メチレン ブルー色素注入による尿路ジャンクション閉塞欠陥の評価

この手順の全体的な目標は、腎臓へのメチレン染料注入による尿路接合部の閉塞を特定することです。この方法は、尿道膀胱の接続など、腎臓および下部尿路発達分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、最悪の場合の大量発生時の尿路構造を視覚化する簡単な方法を提供し、小便器経路の発達分析を可能にすることです。

実験を開始するには、0.1グラムのメチレンブルーパウダーを測定します。メチレンブルーを10ミリリットルの1xリン酸緩衝生理食塩水またはPBSに溶解し、混合物をボルテックスします。次に、10ミリグラム/ミリリットルのメチレンブルー溶液をシリンジフィルターでろ過して、注入中の目詰まりを防ぎます。

次に、滅菌頭皮静脈セットを3ミリリットルの使い捨てシリンジで組み立て、シリンジに3ミリリットルのろ過されたメチレンブルー溶液を充填します。70%エタノールで解剖はさみと鉗子をきれいにします。E18.5またはE19.5で周産期胚を採取するには、まず二酸化炭素吸入を使用して妊娠中のマウスを安楽死させます。

次に、NIHのガイドラインに従って頸椎脱臼を行います。次に、動物の腹側腹部表面に70%エタノールをスプレーします。次に、滅菌解剖ハサミと鉗子を使用して腹側に腹腔を開きます。

子宮全体を持ち上げ、子宮角の先端で体から分離します。次に、ペトリ皿で子宮全体を1x PBSですすいでください。解剖ハサミで子宮を分節的に切断し、解剖鉗子で胎盤脱落膜を取り除き、胚と卵黄嚢を露出させます。

最初に卵黄嚢を切除し、次に解剖鉗子で羊膜を切除して周産期胚を放出します。解剖ハサミで胚の首を切ります。胚を腹側を上にして、イメージング用のデジタルカメラを備えた解剖顕微鏡で固定します。

ジェノタイピングのために尾を集めます。鉗子を使用して、胚の腹腔を開くために慎重に皮膚を引き裂きます。次に、肝臓、胃、腸などの余分な臓器や組織を鉗子で切断または引き出して、背側にある腎臓、尿管、膀胱を露出させて慎重に取り除きます。

解剖した胚から余分な血液を滅菌ガーゼパッドで吸収し、その後、注射を染色し続けます。静水圧により針先からメチレンブルー溶液を排出することにより、針とチューブの気泡を取り除きます。染料溶液の入ったシリングを針先の高さより上に持ち上げて、流れを開始します。

次に、シリンジを下げて流れを止めます。次に、近位尿管の近くの腎盂に針を挿入し、一度置いたのが邪魔にならないように注意してください。腎臓に色素を注入して、尿路閉塞を特定します。

腎盂に1本の針を挿入した後、このテストが成功した場合、針は腎臓も血管も通過しない尿管に向かって腎盂に挿入される必要があります。シリンジを約20センチメートル持ち上げて静水圧を提供し、15〜16マイクロリットルの染料溶液を流します。次に、染料の青色を、最初に腎盂から始まり、次に尿管の長さ、最後に膀胱内腔で監視します。

シリンジを下に置いて染料の流れを止め、腎臓から針を取り外してください。腎臓の水腎症、水尿管、および染料溶液の最終位置を実験ノートに記録します。最後に、対側の腎臓の注射を行い、染料を合計20秒間流します。

色素溶液でトレースした腎臓、尿管、膀胱の画像を、実体顕微鏡に接続されたカメラとイメージングプログラムを使用して撮影します。1つの腎臓に注射した後、メチレンブルー染料は腎盂から尿管を通って膀胱に流れ込み、尿管と膀胱内腔に目に見える青色をもたらします。染料を両腎臓に注入してから約20秒後に流れが長くなるため、膀胱内腔に強い青色が現れ、第2泌尿器系に尿路接合部閉塞がないことを示しています。

異常に拡張した水尿管を注入する場合、色素溶液の最終位置は不明です。また、膀胱内腔に色素が存在しないにもかかわらず、尿管接合部閉塞(UVJO)は、異常な水尿管が中央で損傷しているため、確認できません。この手順を試みている間、無傷の泌尿器系を得るために色素嚢周産期胚を計算することを覚えておくことが重要です。

そして、染料の流れを妨げないように気泡を取り除きます。