乳腺上皮細胞移行 TIP60 の一時的な枯渇後のライブ イメージング

この手順の全体的な目標は、特定の対象遺伝子の枯渇が細胞遊走に及ぼす影響を観察することです。この方法は、がん細胞の移動など、がんの転移における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、動的な細胞移動をリアルタイムで監視できることです。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、腫瘍抑制剤であるTIP60の患者の細胞形態の変化を観察していたときでした。まず、10センチメートル皿あたり3ミリリットルの培養培地に100万個の乳房上皮細胞を播種します。室温でインキュベートしたSRINA混合物を実験細胞培養に一滴ずつ加えます。

両方の皿を手動で振って、細胞が均等に分布していることを確認してから、摂氏37度のインキュベーターに入れます。6時間後、上清を皿ごとに8ミリリットルの新鮮な培地と交換し、培養物をインキュベーターに戻します。翌朝、上清をディッシュごとに3ミリリットルの新鮮な培地と交換し、先ほど示したように、実験用細胞培養にSIRNA混合物の2番目のパッチを追加し、ディッシュを振って試薬が完全に混合されていることを確認してから、細胞をインキュベーターに戻します。

次に、6時間後に上清を8ミリリットルの新鮮な培地に交換し、培養物を一晩インキュベートします。3日目に、プレートあたり2ミリリットルのBPSで細胞を1回洗浄し、皿ごとに1ミリリットルのトリプソンEDTAで摂氏37度で20分間、両方のプレートの細胞を分離します。インキュベーションの終わりに、プレートあたり4ミリリットルの完全な培地で反応を停止します。

ピペッティングで細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を個々の15ミリリットルチューブに移します。遠心分離により細胞を回収し、チューブあたり5ミリリットルの無血清培地にペレットを再懸濁します。カウント後、両方の細胞培養物を1ミリリットルあたり600,000細胞濃度に希釈し、各培養物から500マイクロリットルの細胞を24ウェルプレートの1ウェルに加えて、100%の密度を確保します。

すべての細胞に播種したら、プレートを前後左右に静かに振って均等に分布させ、プレートを細胞培養インキュベーターに24時間置きます。目的遺伝子のノックダウン効率を確認するには、別の遠心分離で残りの細胞をコレクションチューブに集め、市販の試薬を使用してペレットからRNAを単離し、メーカーの指示に従ってリアルタイムの定量PCR評価を行います。翌朝、生細胞イメージング開始の少なくとも1時間前に、顕微鏡と温度制御の電源を入れます。

温度を摂氏37度に設定し、二酸化炭素ガスの供給を5%チャンバーが摂氏37度に達したら、位相差顕微鏡を使用して、細胞が合流し、ウェルの底に完全に取り付けられていることを確認します。次に、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、各ウェルの中心の全長にわたって直線をそっと引っ掻き、すべてのウェルを無血清培地で5回優しく洗浄して、剥離した細胞を取り除きます。最後の洗浄後、各ウェルに1ミリリットルの無血清培地を追加します。

プレートを顕微鏡ステージの10パワー対物レンズの下に置き、放出された光をカメラではなく接眼レンズに向けます。ピントを手動で調整して、各傷とその周囲の細胞を特定します。その後、放出された光をカメラに戻し、生細胞観察システムを使用して傷の位置をマークし、時間条件を設定します。

適切な実験期間の細胞をイメージングし、適切なイメージングソフトウェアで最初のaviビデオを開き、m track jプラグインを開きます。[追加] タブをクリックして 1 つのセルのトラックを追加し、侵襲性前面の先端にある 1 つのセルと、単独で移動できる 1 つのセルを選択します。mtrackJを使用してビデオ上の選択したセルの動きを追跡し、それらのトラフィックを追跡します。

次に、[測定]タブをクリックしてセル移動の距離を測定し、トラック付きのビデオをavi形式で保存します。TIP60が枯渇した後、乳房上皮細胞は対照培養細胞と比較して間葉系になります。実際、TIP60の発現は、上皮細胞接着分子の発現と同様に、siTIP60処理後に大幅に減少します。

一方、TIP60が枯渇すると、特定の上皮から間葉系への移行ドライバー遺伝子の発現が増加します。創傷投与後の細胞培養物のライブイメージングは、siControl培養物と比較して、siTIP60処理細胞の細胞移動が速く、TIP60の枯渇に応答して観察される遊走細胞の割合が有意に増加していることを示しています。さらに、siControl細胞はシートとして移動しますが、siTIP60培養物内ではより多くの単一細胞の動きが観察されます。

このビデオを見れば、ライブセルイメージング技術を使用して細胞移動の動的変化をモニターする方法を十分に理解できるはずです。