Name: 乳腺上皮細胞移行 TIP60 の一時的な枯渇後のライブ イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学ぶライブ細胞イメージングによる創傷治癒アッセイでの細胞移行観察法。TIP60枯渇したMCF10A乳腺上皮細胞を用いて、単一細胞の動的移行をリアルタイムで可視化し、がん転移メカニズムを解明する。

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私たちは彼らの役に立つ議論とコメントの Jha 研究室のメンバーに感謝します。スバールバルヤンマイエン島がん科学研究所シンガポール (R-713-006-014-271)、国立医学国立研究財団にシンガポール、シンガポールの教育省卓越性イニシアチブの各研究センターの下からの補助金に支えられ研究協議会 (CBRG 遺伝研;BNIG11nov001 と CS-IRG;R-713-000-162-511)、文部省学術研究基金 (萌え AcRF 層 1 T1 2012 10 月 -04)。Y.Z.、G.S.C.、および C.Y.T. は、がん科学研究所のシンガポール、シンガポールの国立大学によって授与卒業後奨学金によって支えられました。

1. 準備
<ol><li>MCF10A 培養液の準備: ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) F12 (1:1) 5% 馬の血清、20 ng/mL 上皮成長因子、0.5 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 ng/mL コレラ毒素、10 μ g/mL インスリン/。</li>
	<li>無血清培地の準備: 20 ng/mL 上皮成長因子、0.5 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 ng/mL コレラ毒素と 10 μ g/ml インスリン DMEM/f12 キー (1:1)。</li>
	<li>次の siRNA シーケンスを使用します。 siControl: フォワード: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3' 逆: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3' siTIP60: フォワード: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3' 逆: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'</li>
	<li>10 cm の細胞培養皿および 24 ウェルのプレートを使用します。</li>
</ol>2. 一時的な枯渇 TIP60 による siRNA の
<ol><li>1 日目、トランスフェクション試薬 (例えば、 Lipofectamine RNAiMAX) の 15 μ L 分注、2 mL の血清媒体 (例えば、オプティ MEM) を削減し、それぞれ各の siRNA (10 μ M 株式) の 10 μ L でそれらをミックスします。</li>
	<li>20 分間室温で混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>10 cm 皿で培養液 3 mL と 1 x 106 MCF10A 細胞を播きます。診断を使用してセルをカウントします。</li>
	<li>10 cm 皿に siRNA の混合物によって滴を追加します。</li>
	<li>セルは、37 ° C の定温器に入れる前に均等に分散して確保するため料理を振る。</li>
	<li>インキュベーションの 6 h は後に、、新鮮な培養液 8 ml siRNA 含有培地を交換します。</li>
	<li>2 日目、siRNA 混合の別のバッチを準備し、20 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>追加 1 日目に培養液 8 mL を吸引し、新鮮な培養液 3 mL で置き換えます。</li>
	<li>一滴ずつ料理に siRNA の混合物の 2 番目のバッチを追加します。試薬がインキュベーターに入れる前に混合される完全にできるように料理を振る。</li>
	<li>6 時間後、siRNA を含む媒体を新鮮な培養液 8 mL に置き換えます。</li>
</ol>3 創傷治癒の試金のため種の細胞
<ol><li>3 日目、培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) バッファーの 2 mL で一度セルを洗浄します。PBS バッファーを破棄します。</li>
	<li>SiControl と siTIP60 処理細胞をプレートに 1 mL のトリプシン-EDTA バッファー x 1 を追加することによって trypsinize します。20 分のためのインキュベーターに戻ってそれを置きます。</li>
	<li>各プレートに完全な培養液 4 mL を追加、ピペッティングにより細胞を再懸濁します、15 mL チューブに転送します。</li>
	<li>5 分の 200 g で遠心し、上清を除去します。</li>
	<li>再細胞の無血清培地 5 ml を中断し、診断を使用してセルをカウントします。</li>
	<li>SiControl と siTIP60; 6 × 105セル/mL の細胞懸濁液を準備します。細胞が十分に混合されたことを確認します。100% の confluency ように 24 ウェル プレートのウェル 1 個に細胞懸濁液 500 μ L を追加します。SiControl と siTIP60 の各 5 に 6 井戸をシードします。</li>
	<li>プレートに前後し、均一な配分を確保するため左右に軽く振る。円形の動きは避けてください。24 h のためのインキュベーターでプレートを残してください。</li>
	<li>TIP60 のノックダウン効率を確認する残りのセルを収穫します。5 分間 200 g で残りの細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを除去します。</li>
	<li>次の製造元のプロトコル、市販試薬を用いた RNA を隔離し、ノックダウン効率を評価するリアルタイムの量的な PCR に進みます。</li>
</ol>4. 傷を作成します。
<ol><li>細胞が完全に接続されていることを確認する位相差顕微鏡下で確認してください。顕微鏡下で細胞を観察 (4 X、10 X、および 20 倍) 細胞のコンフルエント単層を形成している細胞が完全に接続されていることを確認します。 注: siControl 細胞は通常添付 siTIP60 細胞より。TIP60 の枯渇、細胞が間葉系のような20になりますがされます。ここでは、通常の卓上型白色光の位相差顕微鏡が使用されます。</li>
	<li>傷を生成するため軽く 200 μ L ピペット チップ; と井戸の中央を横切る直線をスクラッチします。生成された傷の長さは、井戸の直径と同じです。残りのすべての井戸のためには、この手順を繰り返します。各ウェルに新しいピペット チップを使用します。</li>
	<li>水洗いしても各 5 回を用いた無血清培地戸建のセルを削除します。</li>
	<li>各ウェルに無血清培地 1 mL を追加し、住セルイメージ投射に進みます。</li>
</ol>5. 住セルイメージ投射のセットアップ
<ol><li>顕微鏡をオンにし、温度が住セルイメージ投射チャンバー内温度が 37 ° C に届くように設定する前に少なくとも 1 時間を制御</li>
	<li>二酸化炭素 (CO2) ガス供給住セルイメージ投射を開始する前にオンにします。CO2濃度を 5% に設定します。</li>
	<li>顕微鏡のステージ上 24 ウェル プレートを置き、イメージングのための 10 倍の倍率の対物レンズを選択します。カメラではなく接眼レンズに放射光を直接、傷とその周囲のセルにフォーカスを調整します。 注: この例では、位相コントラストと白い光が使用されました。</li>
	<li>生細胞観察システムを使用して、各ウェルの傷の位置をマークします。 メモ: 生細胞イメージング システムの自動化された段階の複数の位置からの画像取り込みできます。画像、すべてのマークされた位置の間隔取られます。</li>
	<li>時間条件を設定: 1 h 間隔と 72 時間の持続期間;この設定に従ってシステムは、1 時間ごと 72 h、適切な時間間隔を設定しモニタリング周期各マークの位置で写真を撮るでしょう。 注: ここでは、72 時間の期間ために勧めこれらの細胞は無血清培地で 72 時間後死ぬを開始します。</li>
</ol>6. 単一細胞運動の追跡
<ol><li>72 h は、JPEG 形式で画像および AVI 形式の動画としてデータをエクスポートした後は、データをエクスポートします。 注: これは ImageJ ソフトウェアのみ AVI 形式で動画を認識できますので重要です。SiTIP60 と siControl のセルの異なるセル移行速度は、ビデオで明らかに観察できます。</li>
	<li>ImageJ ソフトウェアで AVI ビデオを開きます。</li>
	<li>MTrackJ プラグイン (プラグインをダウンロードし、は別にインストールする必要があります) を開く: プラグイン > MtrackJ。</li>
	<li>MtrackJ ツールバーで「追加」タブをクリックしてしてビデオから選択した単一セルためトラックを追加します。侵襲的なフロントの先端に、独自に移行することができますセルの選択 (単一セルの移行)。ビデオを選択したセルの動きに従うし、それらをトレース MtrackJ を使用しています。</li>
	<li>ツールバーの「測定」タブをクリックしての移動距離を測定します。 注: ここでは、単一セルの動きを測定することは困難になって siTIP60 細胞の多くが単一のセルとして移動に対し、単一のセルとして、siControl ほとんどない細胞移動。ただし、侵襲の前面にある細胞の運動することができますまだトレースして、siControl と siTIP60 の両方のセルで計算。</li>
	<li>AVI 形式でトラックとビデオを保存します。</li>
</ol>7 セル移動能力の定量化
<ol><li>定量化, 0 h 画像と画像"n"h で、siTIP60 または siControl のいずれかのセルが完全に傷口を閉じ、"n"は、timepoint を参照する場所を選択します。 注: ここでは、48 h として選ばれた、siTIP60 細胞の傷はほぼ完全に閉鎖されました。</li>
	<li>ImageJ は、次の数式を使用してを使用してパーセント移行を定量化: (0 h -"n"h で傷の領域で傷の領域)/0 h × 100 で傷の領域。</li>
</ol>

<ol><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li>
<li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li>
<li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Rvb1%2FTip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60%2FNuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li>
<li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+functions+of+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular functions of TIP60.</a> Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).</li>
<li>Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+in+DNA+damage+response+and+growth+control%3A+many+tricks+in+one+HAT%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT.</a> Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).</li>
<li>Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+acetylation+of+lysine+3016+of+ATM+activates+ATM+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity.</a> Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).</li>
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<li>Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tip60+in+human+melanoma+cell+migration%2C+metastasis%2C+and+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).</li>
<li>Gorrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+is+a+haplo-insufficient+tumour+suppressor+required+for+an+oncogene-induced+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response.</a> Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+TIP60+by+human+papillomavirus+E6+results+in+attenuation+of+TIP60-dependent+transcriptional+regulation+and+apoptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway.</a> Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+a+metastasis+suppressor+gene+by+Tip60+and+beta-catenin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes.</a> Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).</li>
<li>Sakuraba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Tip60+gene+as+a+potential+marker+for+the+malignancy+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer.</a> Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).</li>
<li>Subbaiah, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+EDD1%2FUBR5+is+utilized+by+the+HPV+E6+oncogene+to+destabilize+tumor+suppressor+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60.</a> Oncogene. , (2015).</li>
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<li>Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+of+metastasis%3A+cell+invasion+and+endothelial+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP60+inhibits+metastasis+by+ablating+DNMT1-SNAIL2-driven+epithelial-mesenchymal+transition+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program.</a> J Mol Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li>
<li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

細胞移動の過程で細胞は付着性シートの形でどちらかの移動ことができます知られています。ゆるい房;または、隔離された単一のセルです。モードと細胞浸潤の動的することができます 1 つの条件ごとに異なると表現型が時間内で変更できます。伝統的な創傷治癒のアッセイは、12 または 24 h など、長い時間間隔と顕微鏡から撮影したスナップショット画像に基づいています。傷の閉鎖のダイナミックと細胞運動のパターンをキャプチャするは困難します。
その一方で、生細胞イメージング システムは細胞遊走はるかに短い間隔 (30 分または 1 時間) と手動で撮影した画像の実現されていない、正確に同じ位置を監視します。システムは自動化されており、研究者が実験の終わりにデータをエクスポートするだけ必要があります。これは細胞運動のパターンとリアルタイムでの創傷閉鎖のプロセスを監視することが可能になります。本研究では定量的アッセイの創傷治癒の生細胞イメージング システムの組み込むことでコントロールまたは TIP60 枯渇細胞の創傷閉鎖のプロセスと同様に、動的な細胞運動のキャプチャで。生細胞イメージング システムを使用...

HIV Tat インタラクティブ蛋白質 60 kDa (TIP60) はヒストンと非ヒストン蛋白質1,2の両方ことができる従ってリジン アセチルトランスフェラーゼです。その機能は転写、DNA 損傷修復、およびアポトーシス1,3,4,5,6,を含む複数のシグナル伝達経路に影響があることが判明します。7,8しますさらに、TIP60 はしばしば癌のダウンレギュ レートのダウンレギュレーションがん転移と相関していると貧しい人々 の生存率は9、10、11,12、。 13,14。腫瘍の転移は癌関連死の主要な原因です。それはマルチ ステップ プロセスと移行と隣接する組織15,16に腫瘍細胞の浸潤、転移の最初のステップが含まれます。そのためには、腫瘍細胞はまず原発腫瘍固まり、総称して侵入した細胞シートの形式のいずれかからデタッチする必要があります。 またはとして単一セル17戸します。このプロセス中に腫瘍細胞はしばしば上皮間葉転換 (EMT) 形態と細胞接着機能17,18変更を伴うに受けること。
移行を検討するいくつかの手法が開発されて、培養細胞の浸潤性腫瘍。その中で、創傷治癒の試金は最も効率的で経済的な19です。まず、この方法は、細胞、細胞に移行し、ギャップを埋めるようにコンフルエント単層の人工ギャップの作成を含みます。第二に、実験の前後でのギャップの画像をキャプチャできます。最後に、ギャップ閉鎖の比較を使用して、細胞の移動の速度を決定します。位相差顕微鏡は通常従来の創傷治癒の試金のための画像をキャプチャする使用されます。創傷治癒の試金のもう一つの利点は、生体内で腫瘍細胞の遊走が一部似ているです。同様に腫瘍転移生体内でアッセイの創傷治癒過程で細胞の移動は上皮シートの集団の移動と独立した単一細胞の移動を示します。
細胞遊走は動的である知られているし、リアルタイムで細胞の動きを文書化する必要があります。例えば、従来の創傷治癒の測定は単一セルの動きを分析する研究者を許可しません。一方、創傷治癒アッセイ用細胞は、しばしば、血清飢餓細胞増殖を抑制します。これは細胞増殖のためギャップ閉鎖の可能性を排除するためです。それにもかかわらず、されますが、いくつかの増殖と細胞死、位相差像の実験はそれらを区別することができる前に撮影します。
生細胞イメージング技術従来の創傷治癒の試金のこの制限に対処します。ライブ イメージング顕微鏡を用いた CO2インキュベーターと適切な温度制御と組み合わせることで、研究者はギャップの大きさを測定できるし、の先端に位置する細胞積極的に移行の動きをトレースしながら時間をかけて閉鎖率、侵襲的なフロント。つまり、住セルイメージ投射細胞の移動を監視するための実装セル移行のより良い視覚化を提供しませんが、また、細胞遊走と細胞増殖より提供を区別する可能性のよう細胞遊走の信頼性の高い解析。
本研究では MCF10A 乳腺上皮細胞は創傷治癒の試金と住セルイメージ投射細胞遊走の TIP60 の役割を研究するの組み合わせを示すため使用されました。MCF10A 細胞内移行能力 TIP60 の枯渇の結果します。

<table><tbody><tr><td>MCF10A細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317TM</td><td>乳房上皮細胞</td></tr><tr><td>DMEM/F12培地 (1:1)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>MCF10A 培養培地</td></tr><tr><td>上皮成長因子 (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A 培養培地用サプリメント</td></tr><tr><td>コレラ毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8052</td><td>MCF10A用培地</td></tr><tr><td>用サプリメントヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-0888</td><td>MCF10A培地用サプリメント</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1882</td><td>MCF10A用サプリメント</td></tr><tr><td>ハウス血清</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>MCF10A用サプリメント</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>MCF10A用</td></tr><tr><td>プレートから取り外す 血球計算盤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>267110</td><td>細胞のカウント用</td></tr><tr><td>Opti-MEM 還元血清培地</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>siRNA混合物用</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>56532</td><td>トランスフェクト試薬</td></tr><tr><td>Trizol 試薬</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>mRNA抽出用</td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成キット</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td>cDNA用世代</td></tr><tr><td>iTaq ユニバーサル SYBR グリーン スーパーミックス</td><td>バイオ・ラッド</td><td>172-5125</td><td>リアルタイム qPCR</td></tr><tr><td>7500 高速リアルタイム PCR システム</td><td>バイオシステム</td><td></td><td>リアルタイム qPCR メカイン</td></tr><tr><td>10 cm ディッシュ</td><td>グライナー バイオワン</td><td>664160</td><td>ノックダウン実験用</td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>セルスター</td><td>662160</td><td>創傷治癒アッセイ</td></tr>用 <tr><td>siControl siRNA</td><td>自己設計</td>済み <td>自己設計</td><td>CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td></tr><tr><td>siTIP60 siRNA</td><td>自己設計</td><td>自己設計</td><td>UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td></tr><tr><td>ライブセルオブザーバー</td><td>ツァイ</td><td></td>ス <td>逆セルオブザーバー 生細胞実験用</td></tr></tbody></table>

乳腺上皮細胞移行 tip60 の一時的な枯渇後のライブ イメージング

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

創傷治癒の試金は効率的な細胞移行の培養を研究する最も経済的な方法の一つ。従来、画像は位相差顕微鏡を用いた実験の前後に撮影が、傷の閉鎖によって細胞の移行の能力が評価されます。ただし、細胞運動は動的な現象を単一セルの動きを追跡するため、従来の方法を指定することはできません。現在の創傷治癒のアッセイを向上させるため、生細胞イメージング技術を使用して、リアルタイムで細胞の移動を監視します。このメソッドは、追跡システムのセルに基づいてセル移行レートを決定することができます、細胞遊走と細胞増殖との間の明確な区別を提供します。ここでは、我々 は TIP60 の存在によって影響を受ける乳房の上皮細胞のさまざまな移行能力を研究するためのアッセイの創傷治癒の生きているセルイメージ投射の使用を示します。細胞の運動性は非常にダイナミックな私たちのメソッドは創傷創傷閉鎖創傷治癒の試金のためのイメージングの伝統の技術で撮影したスナップショットよりも治癒のプロセスに洞察力を提供します。

生細胞イメージングに基づく細胞移行試験の一般的なスキーマ 図 1 aは、このプロトコルのスキーマです。典型的な上皮形態を示した siControl MCF10A セルをトランスフェクトしました。TIP60 の枯渇後、MCF10A 細胞いたより間葉系細胞 (図 1 b) と比較しています。
TIP60 ノックダウン効率の検討 TIP60 ノックダウン効率を図 2に示します。TIP60 発現レベルは siTIP60 治療後大幅に減少しました。TIP60、ほかのいくつかの細胞の移行関連タンパク質の式でしたも検査された20。たとえば、上皮性マーカーである上皮...

ここでは、TIP60 枯渇 MCF10A 乳房の上皮細胞を用いた創傷治癒のアッセイで細胞遊走のリアルタイム モニタ リングを提案します。生細胞イメージング プロトコルの実装を分析し、リアルタイムの時間の単一細胞運動を可視化することができます。

乳腺上皮細胞移行 TIP60 の一時的な枯渇後のライブ イメージング

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

この手順の全体的な目的は、特定の標的遺伝子の枯渇が細胞遊走に及ぼす影響を観察することです。この手法は、がん細胞の遊走など、がん転移における重要な疑問を解明するのに役立ちます。本技術の主な利点は、ダイナミックな細胞遊走をリアルタイムでモニタリングできることです。我々がこの手法を考案したのは、腫瘍抑制因子であるTIP60の欠損に伴う細胞形態の変化を観察していたときのことでした。まず、10 cmディッシュ1枚あたり3 mLの培地に、100万個の乳腺上皮細胞を播種します。室温で20分間インキュベートしたSRINA混合液を、実験用の細胞培養液に一滴ずつ滴下してください。両方のディッシュを手動で振って細胞が均一に分散していることを確認し、37 °Cのインキュベーターに入れます。6時間後、上清を1ディッシュあたり8 mLの新鮮な培地に交換し、培養物をインキュベーターに戻します。翌朝、上清を1ディッシュあたり3 mLの新鮮な培地に交換し、先ほど示した手順と同様に、実験用細胞培養に2回目のsiRNA混合液を添加します。ディッシュを振って試薬が完全に混合されるようにしてから、細胞をインキュベーターに戻します。その後、6時間後に上清を8 mLの新鮮な培養液に交換し、一晩培養します。3日目に、1プレートあたり2 mLのBPSで細胞を1回洗浄し、両方のプレートの細胞を1ディッシュあたり1 mLのtrypsin EDTAを用いて37 °Cで20分間処理し、剥離させます。インキュベーション終了後、1プレートあたり4 mLの完全培養液を加えて反応を停止させます。ピペッティングによって細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を個別の15 milliliterチューブに移します。遠心分離により細胞を回収し、ペレットを1本あたり5 millilitersの無血清培地で再懸濁します。細胞数をカウントした後、両方の細胞培養液を600,000 cells per milliliterの濃度に希釈し、100%のコンフルエンシーを確保するため、各培養液から500 microlitersの細胞を24ウェルプレートの1ウェルに加えます。すべての細胞を播種した後、プレートを前後左右に静かに揺らして均一に分散させ、細胞培養インキュベーターに24時間置きます。目的遺伝子のノックダウン効率を確認するために、再度遠心分離を行って回収チューブに残りの細胞を集め、市販の試薬を用いて製造元の指示に従いペレットからRNAを単離し、リアルタイム定量PCR評価を行います。翌朝、ライブセルイメージングを開始する少なくとも1時間前に、顕微鏡と温度制御装置の電源を入れます。温度を37°Cに、二酸化炭素ガスの供給量を5%に設定します。チャンバーが37°Cに達したら、位相差顕微鏡を用いて、細胞がコンフルエントであり、ウェルの底面に完全に接着していることを確認します。次に、200 µLのピペットチップを使用して、各ウェルの中央に全幅にわたる直線的なスクラッチを慎重に入れます。その後、血清不含培地ですべてのウェルを5回慎重に洗浄し、剥離した細胞を除去します。最後の洗浄後、各ウェルに1 mLの血清不含培地を加えます。プレートを顕微鏡ステージに置き、10倍対物レンズで、放出光をカメラではなく接眼レンズに向ける。手動でピントを調整し、各創傷部位とその周囲の細胞を特定する。その後、放出光を再びカメラに向け、生細胞観察システムを使用して創傷部位の位置をマークし、時間条件を設定する。適切な実験期間にわたって細胞をイメージングし、その後、適切なイメージングソフトウェアで最初のaviビデオを開き、mTrackJプラグインを起動します。[Add]タブをクリックして単一細胞のトラックを追加し、浸潤前縁の先端にある細胞1つと、単独で遊走可能な細胞1つを選択します。mTrackJを用いてビデオ上の選択した細胞の動きを追跡し、そのトラフィッキングをトレースします。次に、「measure」タブをクリックして細胞移動の距離を測定し、トラックを含むビデオをavi形式で保存します。TIP60を枯渇させると、乳腺上皮細胞はコントロール培養細胞と比較してより間葉系となります。実際に、siTIP60処理後は、TIP60の発現および上皮細胞接着分子の発現が著しく低下します。一方で、TIP60を欠損させると、特定の上皮間葉転換（EMT）誘導遺伝子の発現が増加します。創傷処置後の細胞培養のライブイメージングでは、siControl群と比較してsiTIP60処理細胞の細胞遊走が速くなることが示され、TIP60の欠損に応じて遊走細胞の割合が有意に増加することが観察されました。さらに、siControl細胞はシート状に移動するのに対し、siTIP60群では単一細胞としての移動が多く観察されました。このビデオを視聴することで、ライブセルイメージング技術を用いて細胞移動のダイナミックな変化をモニターする方法について、十分に理解することができます。

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JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

がん幹細胞の移動を調査するための区分するマイクロ流体デバイスが記載されている。この小説のプラットフォームは、生存細胞の微小環境を作成し、生細胞運動の微視的な可視化を可能にします。非常に運動性のがん細胞は、潜在的に、より効果的な将来の治療法につながる積極的な浸潤の分子メカニズムを研究するために隔離されています。...

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ここでは、移行と時間をかけて、複数の治療条件下で神経膠腫脳腫瘍幹細胞の侵入を定量化する生細胞イメージング技術について述べる。...

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脊椎動物の脳組織に侵入する膠芽腫(GBM)細胞における微小管動態のライブイメージングを可能にする技術を報告する。蛍光タグ付きGBM細胞の透明なゼブラフィッシュ脳への同所性注射と高解像度の生体内イメージングを組み合わせることで、 in situ...

ゼブラフィッシュ脳に侵入する膠芽腫細胞における微小管動態のライブイメージング

学ぶライブ細胞イメージングによる創傷治癒アッセイでの細胞移行観察法。TIP60枯渇したMCF10A乳腺上皮細胞を用いて、単一細胞の動的移行をリアルタイムで可視化し、がん転移メカニズムを解明する。

乳腺上皮細胞移行 TIP60 の一時的な枯渇後のライブイメージング

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