M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Federica M. Conedera; Petra Arendt; Carolyn Trepp; Markus Tschopp; Volker Enzmann

doi:10.3791/56249

ゼブラフィッシュの再生モデルと網膜変性のレーザー誘起のミュラーグリア細胞の活性化

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

Müller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

ゼブラフィッシュの再生モデルと網膜変性のレーザー誘起のミュラーグリア細胞の活性化

Full Text

10,359 Views

06:27 min

October 27, 2017

DOI: 10.3791/56249-v

Federica M. Conedera^1,2,3, Petra Arendt¹, Carolyn Trepp^1,2,3, Markus Tschopp¹, Volker Enzmann^1,2

¹Department of Ophthalmology, University Hospital of Bern,University of Bern, ²Department of Clinical Research,University of Bern, ³Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences,University of Bern

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study focuses on the use of zebrafish as a model to explore retinal degeneration and regeneration mechanisms. A protocol is described for inducing localized laser injury to the outer retina, monitoring subsequent cellular responses, particularly the involvement of Müller glia, throughout the recovery process.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Retinal biology
Regenerative medicine

Background

Zebrafish are recognized for their ability to regenerate retinal tissue.
Studying glial cell responses can provide insights into regenerative processes.
Localized injury models help minimize damage while focusing on specific cellular dynamics.

Purpose of Study

To establish a method for inducing focal retinal damage.
To observe morphological changes and cellular responses during regeneration.
To provide a framework for exploring repair mechanisms in other models.

Methods Used

The study utilized a zebrafish model to induce focal retinal damage using laser treatment.
Anesthetic procedures were detailed for the humane handling of zebrafish during experiments.
The protocol includes imaging techniques like optical coherence tomography (OCT) for monitoring changes.
Critical steps include preparing anesthetic solutions, applying laser treatment, and immediate imaging post-injury.

Main Results

Laser-induced injuries produced distinct hyper-reflective signals in the retina, indicating damage.
Müller glial responses were evident through immunohistochemistry, showing varying GFAP levels post-injury.
Recovery milestones were tracked, revealing a significant decrease in lesion size and restoration of retinal morphology over time.
The findings underline the dynamic cellular responses associated with retinal healing processes.

Conclusions

This study successfully demonstrates a method for inducing and monitoring retinal injury and regeneration in zebrafish.
The insights gained enhance understanding of regenerative mechanisms and their potential therapeutic implications for retinal diseases.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using zebrafish in retinal studies?

Zebrafish are advantageous due to their rapid retinal regeneration capabilities and the transparency of their embryos, allowing for easy in vivo imaging of cellular processes.

How is retinal damage induced in zebrafish?

Retinal damage is induced using a focused laser that targets specific regions of the outer retina, allowing for minimal impact on surrounding structures.

What types of data are obtained from this method?

Data obtained include morphological changes captured through imaging techniques like OCT, as well as immunohistochemical markers indicating cellular responses during regeneration.

How can this method be adapted for other models?

The protocol can be adapted to other vertebrate models by modifying anesthetic procedures and laser settings according to the specific anatomical and physiological needs of the species.

What are the critical considerations for anesthesia in this study?

Appropriate anesthesia is crucial for the welfare of zebrafish and to ensure successful operation; using freshly prepared anesthetic solutions is essential.

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の網膜変性・再生のメカニズムを勉強する人気動物モデルです。このプロトコルでは、ローカライズされた外傷の内側の網膜に最小の被害で網膜の外側を中断することを誘導する方法について説明します。その後、我々は生体内で網膜の形態と網膜再生を通してミュラーグリア細胞応答監視します。

このビデオの全体的な目標は、ゼブラフィッシュの局所的なレーザー誘発網膜損傷後のin vivoでの細胞変化を監視する方法を示すことです。このモデルは、形態学的変化、動態、関与する細胞タイプなど、網膜再生の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、限局性損傷を誘発することにより、生物学的プロセスを損傷部位で直接調査できることです。

この方法は、ゼブラフィッシュ網膜の再生に関する洞察を得ることができますが、さまざまな動物モデルの修復メカニズムの研究にも適用できます。400ミリグラムのトリカイン粉末を97.9ミリメートルのタンク水と2.1ミリメートルの1モルTBSに溶解して麻酔薬の原液を調製し、pH9で1モルトリスでpH7.0に調整します。

作業溶液を作るには、トリカインストック溶液をタンク水で1〜25に希釈し、50ミリリットルをペトリ皿に移します。次に、ゼブラフィッシュを麻酔液に2〜5分間入れて、ゼブラフィッシュが動かなくなり、外部刺激に反応しなくなるまで待ちます。レーザー治療のために、各魚をカスタムメイドのシリコンピンホルダーに手で移します。

適切な麻酔は、動物の健康と処置の成功にとって重要です。したがって、新たに調製されたトリカイン溶液は極めて重要であり、水から出る時間は10分をはるかに超えてはなりません。532ナノメートルのダイヤルレーザーの出力電力を70ミリワットに、パルス持続時間を100ミリ秒に、空中直径を50ミクロンに設定します。

次に、2%ヒドロキシプロピルメチルセルロースを1〜2滴目に塗ります。メチルセルを眼に塗布するときは、粘性溶液がえらに入らないようにしてください。次に、2mm眼底レーザーレンズを使用して、レーザー照準ビームを網膜に集束させます。

左目の視神経の周りに4つのレーザースポットを配置し、未治療の右の目を内部制御として使用します。レーザー誘導の直後に、まだ麻酔をかけているゼブラフィッシュを、イメージングエリアのカスタムメイドのシリコンピンホルダーに置きます。最適な画像を得るには、市販のハイドロゲルコンタクトレンズを穴あけパンチでゼブラフィッシュの目にフィットするようにカットします。

レンズの凹面をメチルセルロースで満たし、角膜の上に置きます。光干渉断層撮影装置に78D非接触スリットランプレンズを装着します。赤外線画像にIRプラスOCTモードの焦点を合わせて、眼底を視覚化します。

次に、取得ボタンをクリックしてIR写真を撮影し、レーザースポットを網膜上に位置特定します。次に、IR plus OCTモードで網膜層の3次元切片を視覚化し、取得ボタンをクリックして写真を撮ります。これらの画像では、外側の核層の損傷の重症度を観察してください。

治療と画像検査の後に麻酔を元に戻すには、ゼブラフィッシュを水槽の水が入った容器に入れます。回復をサポートするには、ゼブラフィッシュを水中で前後に動かして、えらに新鮮なタンクの水の流れを作ります。レーザー治療の直後に、びまん性の過反射信号が網膜の外側に局在しました。

それは網膜色素上皮から外側の網状層まで伸びていました。びまん性過反射信号は、対照の病変のない眼の網膜には存在しません。同様の拡散性過反射信号は、損傷後の初日に検出されました。

3日目以降、この拡散信号はより整理され、密度が高くなりました。それは一貫して外側の核層に見られ、視細胞層にまで広がっていました。最初の1週間後、平均病変サイズが大幅に減少し、小さな過反射信号のみが検出されました。

14日目から調査された最新の時点まで、レーザースポットはIR画像とOCT画像では見えなくなり、網膜の形態はここで見られるコントロール側と同等になりました。H&E染色は、網膜の変性および再生の程度および動態を調査するために採用された。この画像は、コントロールセクションを示しています。

この画像は、最大の視細胞損失が明らかな損傷の3日後のH&E染色を示しています。グリア細胞マーカーを可視化する免疫組織化学、グルタミン合成酵素を赤で、グリア線維性酸性タンパク質を緑で可視化した。この画像は、GFAPを示す緑色の蛍光がほとんどないコントロール網膜を示しています。

GFAPシグナルは損傷後3日目にアップレギュレーションされましたが、赤色グルタミン合成酵素シグナルは変化しませんでした。この手順に続いて、内因性修復メカニズムへの分子細胞の関与を研究するために、2光子顕微鏡法や細胞および分子分析などの他の方法を実行できます。このビデオを見た後、ゼブラフィッシュ網膜に焦点損傷を誘発する方法と、次の変性および再生プロセスをin vivoで監視する方法をよく理解できるはずです。

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos

Explore More Videos

神経生物学問題 128 細胞生物学ゼブラフィッシュレーザー治療網膜変性再生ミュラー細胞光干渉断層計