2017年9月29日
ここで動的イミン化学を用いたキトサン ベース注射ゲルの作製について述べる。ハイドロゲルの機械的強度と 3 D 細胞培養への応用を調整する方法が掲載されています。
このプロトコルの全体的な目標は、最終的に治療治療に使用するために、三次元細胞培養用の注射可能なキトサンハイドロゲルを調製することです。この方法は、自己修復ハイドロゲルの領域における疑問、例えば、自己修復性ヒドロゲルを全面的に浸漬して作製する方法や、それを3D細胞培養に使用する方法など、その疑問に答えることができます。この技術の私の利点は、互換性のある自己修復ハイドロゲルを非常に簡単な方法で調製することができ、3D細胞培養を使用することである。
このハイドロゲルは注射用でもあるため、細胞治療の担体としても使用できます。さて、Yongsan Li氏がハイドロゲルの作り方と、このハイドロゲルを使った3D細胞培養の方法をご紹介します。Yongsan Liは、私たちの研究室の大学院生です。
ハイドロゲルを作るには、まずDF PEGを合成します。ヒュームフードで、丸底フラスコに分子量4, 000 PEGの4グラムを秤量し、トルエンの100ミリリットルを追加します。次に、ポリマーを溶解するために、溶液を温めます。
すべてのポリマーが溶解したら、蒸発器を使用してすべての溶剤を取り除きます。次に、トルエンを混合し、さらに2回蒸発させるプロセスを繰り返して、乾燥PEGポリマーを調製します。次に、マグネチックスターラーと100ミリリットルのDHFを使用して、ポリマーを溶解します。
次に、0.9グラムの4-カルボキシベンズアルデヒドを溶液に溶解します。次に、0.07グラムのジメチルアミノピリミドを溶液に溶解します。次に、無水塩化カルシウムで満たされた乾燥チューブに1.25グラムのDCCを追加します。
次に、反応を室温で約12時間攪拌します。翌日、500ミリリットルの冷たいジエチルエーテルを使用して白い固形物を沈殿させ、真空ろ過を使用して固形物を収集します。溶質を捨て、換気の良い場所で固形物を乾燥させます。
次に、白い固形物を100ミリリットルのTHFに溶かします。不溶性の白い固形物は、続行する前にろ過する必要があります。次に、新鮮な冷たいジエチルエーテルを使用して溶解した固形物を沈殿させます。
次に、真空ろ過を使用して固形物を収集し、再び乾燥させます。このプロセスを2〜3回繰り返してから、白い固形物を真空乾燥オーブンに入れて完全に乾燥させます。得られた白色粉末は最終製品です:ベンズアルデヒド末端DF PEG。
培養のために細胞をハイドロゲルにカプセル化するには、まず0.44グラムのDF PEGを4ミリリットルのチューブで2ミリリットルの細胞増殖培地に溶解します。混合物をボルテックスして重量の20%の溶液にします。次に、溶液を滅菌します。
10ミリリットルの注射器に入れ、0.22ミクロンのバクテリア保持フィルターに押し込みます。次に、0.165グラムのグリコールキトサンを4ミリリットルの細胞培養培地と混合し、ボルテックスを使用して4重量%のキトサン溶液を作ります。次に、別の0.22ミクロンのバクテリア保持フィルターを使用して溶液を滅菌します。
次に、トリプシンを用いてL929細胞などの細胞を回収します。採取した細胞を洗浄し、1ミリリットルあたり375万個の細胞で培地に再懸濁します。次のステップでは、セルを3Dマトリックスに植え付けます。
これらの手順を正確に実行することは、成功を収めるために重要です。次に、渦を使用して0.4ミリリットルの細胞懸濁液を0.4ミリリットルのキトサン溶液と混合します。この混合物を直径2cmのシャーレの中央にピペットで移し、0.2ミリリットルのDF PEG溶液をシャーレにピペットで移します。
次に、穏やかなピペッティングを使用して、ヒドロゲルの形成を誘導します。ヒドロゲルの形成を評価するには、ディッシュを傾け、溶液の粘度を観察します。カプセル化された細胞の注入性をテストするには、10ミリリットルの注射器で同じ調製を行います。
次に、ヒドロゲルが形成された後、48ゲージの針を通してヒドロゲルをゆっくりとペトリ皿に排出します。次に、プレート内のハイドロゲル-細胞混合物に1ミリリットルの培地を加え、プレートをインキュベーターに移して培養します。1日おきに培地を交換し、3Dヒドロゲル細胞培養液を重ね合わせます。
イメージングのためにハイドロゲルにカプセル化された細胞を調製するには、まずハイドロゲルを1ミリリットルのPBSで2回すすぎます。次に、ハイドロゲルをフルオレセイン-ジアセテート溶液とヨウ化プロピジウム溶液で染色します。両方の溶液を0.5ミリリットルをヒドロゲルに重ね、ハイドロゲルを室温で15分間インキュベー
トします。染色液と短時間インキュベートした後、すべての溶媒を吸引します。次に、共焦点顕微鏡を使用してハイドロゲルを観察し、488ナノメートルで励起して生細胞を観察し、543ナノメートルで励起して死細胞を観察します。2ミクロンのスライスで画像スタックを収集し、ハイドロゲル中の細胞の分布を検証します。
L929細胞。生体内環境組織剛性が約5,600パスカルの典型的なマウスグラスファイバー細胞株をヒドロゲルにカプセル化した。その生存率は培養プロセス全体を通じて非常に高く、驚くべき細胞密度を達成しました。
ハイドロゲル中での7日間の培養後、細胞数は200%増加しました48ゲージの針を介して細胞培養皿に排出されたハイドロゲルは、約1時間後に自己治癒して統合されたハイドロゲルを再形成することができました。培養に7日後、これらの細胞も劇的に増殖しました。一部の細胞が2つに分かれているように見える細胞分裂イベントの証拠が見つかりました。
この生死アッセイは非常に高い生存率を示し、注射後の3Dハイドロゲルでの細胞増殖が成功したことを実証しました。この細胞増殖速度は、培養後7日後の未注入細胞の約3/4でした。そのため、注入時のせん断力は測定可能なマイナスの影響をもたらしますが、注入された細胞はまだかなり増殖していました。
このビデオを見れば、自己修復型ハイドロゲルの調製方法、このハイドロゲルを3D細胞培養に使用する方法、このハイドロゲルによる細胞への送達方法がわかるはずです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば1時間以内に行うことができます。最良の手順に従い、細胞治療や薬物送達のための生体内注射などの他の方法を実行できます。
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本記事では、動的イミン化学を用いた注入可能なキトサンベースのハイドロゲルの調製方法について解説します。特に、三次元細胞培養への応用に向けたハイドロゲルの機械的強度の調整に焦点を当てています。
このプロトコールでは、3D細胞培養向けの注入可能で自己修復能を持つキトサンハイドロゲルの迅速な調製方法について解説します。これにより、生理的な組織の剛性を模倣した、調整可能なプラットフォームを提供します。動的なイミン化学により、ゲル化速度と機械的特性の調整が可能となり、L929線維芽細胞などの細胞を再現性高く封入できます。本アプローチは、制御された3D微小環境における細胞挙動を評価するための汎用的で生体適合性のあるシステムを提供することで、バイオマテリアル設計における初期段階の課題を解決します。
本法は、発見から前臨床への連続的なプロセスに適合しており、in vivoモデルに進む前に細胞と材料の相互作用を早期に評価することを可能にします。