Name: 大規模な gRNA ライブラリ生産 DNA の任意のソースからの普遍的なプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶCORALINA法によるgRNAライブラリ構築。マイクロコッカルヌクレアーゼを用いた酵素消化で精製DNAから全てのガイドRNAを効率的に生成し、CRISPRスクリーニング研究のコストを大幅に削減できます。

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作者は彼らの入力について教授ステファン ・ ベックと教授博士マグダレナ ゲッツに感謝を助ける、CORALINA 法、マクシミリアン Wiessbeck とバレンティン ・ バウマンの有用なコメントのための開発のサポートと思います。仕事は、DFG (STR 1385/1-1) でサポートされています。

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CORALINA は、ターゲット DNA の制御ヌクレアーゼ消化、大規模な gRNA ライブラリを生成し、結果の二重鎖断片のクローニングを一括使用ことができます。統計的推論は、以上 107個々 の gRNA シーケンスの多く既に正常にクローンされた手9でプロトコルを使用してを示します。CORALINA は、複数の方法でカスタマイズできます。DNA のテンプレートの選択は、ターゲット領域と生成されたライブラリの最大の複雑さを定義します。このプロトコルを使用すると、CORALINA ライブラリ以前は人間から生成され、マウスのゲノム DNA9。ここで示した代表的な結果には、精製の BAC DNA から CORALINA ライブラリの生成が描かれています。GRNA 式ベクトルとリンカー シーケンスの選択によっては、さらにカスタマイズを実現できます。我々 は以前効率9で少しバリエーションを持つギブソン アセンブリ リンカー長の 3 つの異なるペアをテストします。
一括消化 DNA から、その起源のため CORALINA gRNAs の protospacer は通常正確 20 長さ、しかしショー両方が依存する平均の長さ分布の bp MNase 消化のパラメーターおよび切除のサイズから作られたページのゲルs.図 2 bとC、、代表的な例は、19 と 27 bp 間の平均距離が断片を示しています。私たちの経験ではフラグメントの長さは生成された gRNA protospacer9で忠実に保持されます。一方、20 より小さいフラグメント結果 gRNAs のオフのターゲット速度が高いため避けるべきである bp、長いフラグメントははるかに少ないそれ以来下流のアプリケーションで問題を示した限り 45、protospacers と、gRNAs 可能性が高い bp はまだ機能9。
CORALINA プロトコルの 2 つの最も重要なステップは、MNase 消化断片のクローニング ステップ サイズの選択です。あまりにも短いフラグメントの生成 (例えば平均 18 歳以下 bp) またはあまりにも多くの空の gRNA 発現ベクターの取り込みはライブラリの無駄をレンダリングします。したがって、切除 (図 2 b, C) を監視する gRNA ベクター バックボーンの完全な消化力を確認し、プロトコル全体のフラグメント コントロールを含む、MNase 消化手順 (図 2 a) を最適化することが重要です。特別なケアは、gRNA ライブラリの表現を保持するためにも。ライブラリ生成の 1 つの一般的なボトルネックは、一般的に増幅の細菌にプラスミドの効率的な転送です。したがって、優れた能力を持つ細菌の大量と多数の個々 のエレクトロポレーション イベントは、高 gRNA クローン数を達成するために必要です。
GRNA ライブラリ用の新しい戦略は次の十年にわたって CRISPR ベースのスクリーニングのアプローチの完全な可能性を収穫する必要があります。モデル システムと異なる CRISPR ベース工学的アプローチの大きい数に従うのスクリーニングを行う前提の大規模なライブラリを生成するコスト効果の高い、シンプルでカスタマイズ可能なメソッドの重要な要求があります。CORALINA は、この第一歩を提供しています。潜在的な用途は多様、特にゲノムの包括的なライブラリを生成する、cDNA 由来のより少なく共通のモデル システム ライブラリ、高度に集中ライブラリおよび (異なる PAM とどの異なる CRISPR 蛋白質の実験のセットアップ要件) は、組み合わせで使用されます。
他のメソッドとは異なり、CORALINA は入力 DNA からすべての可能な gRNAs を生成します。ただし、メソッドの 1 つの欠点は、必要な PAM シーケンスを欠けている gRNAs、ライブラリ、gRNA ライブラリを生成、CRISPR を食べる (表 1) の 2 つ目の酵素法と共有している機能にも含まれていることです。最適な方法の選択の計画されたスクリーニングの仕様に依存する gRNA ライブラリを生成実験、(、規制、遺伝子) 特に気と対象地域 (単一の軌跡、複数の地域、ゲノム) のサイズ。我々 は CORALINA と多数の非コーディングを使用して特別な利点を参照してくださいまたは規定する領域が分析され、不完全なまたは信頼性の低い順序の情報がある場合 (エキゾチックなモデル システム、種 (内細菌叢解析など) の混合物または実験的に求めた入力)、異なる CRISPR 酵素を組み合わせた場合、または分析を飽和は短い、定義の軌跡 (例えばBACs によって表される) に対して実行されます。

分子ターゲット ツールとして細菌の CRISPR/Cas9 システムの適応は、分子生物学の最も最近の革命を引き起こされます。決して前に、それがそう定義されたゲノム場所でクロマチンを操作する簡単です。CRISPR の一般的なアプリケーションは、対象となる遺伝子の突然変異は1、ゲノム工学2、エピゲノム編集3、転写活性化遺伝子サイレンシング4。CRISPR システムの 1 つの特定の利点は、そのアプリケーションはよく研究の候補地に限定されない gRNA ライブラリより少なく偏りのある画面を可能にします。これらは前の実験的知識なしのゲノムの機能遺伝子座の検出を促進します。ただし、gRNA 図書館の建設は現在主 oligo ヌクレオチドの合成に基づいて人間は gRNA ライブラリを購入する限られたオプションがあります、またはマウスの起源またはターゲット地域外開いたリーディング ・ フレーム。したがって、CRISPR 画面が信じられないほど強力な5,6,7、8を既に証明しているが彼らの完全な可能性がまだ開発されていません。
克服するために古典的な gRNA 生成メソッドの 2 つの方法の制限を最近開発されています。両方はカスタム オリゴヌクレオチド合成に頼るのではなく、ターゲット DNA の酵素消化力制御に基づいています。制限酵素を使用して CORALINA9ミクロコッカスヌクレアーゼ、のみ現在利用可能な代替法 CRISPR 食べて10を採用している間 (HpaII、超 Bfaは私とMme私)。重要なは、両方の方法は、gRNA protospacer シーケンスのソースとして任意の入力の DNA に適用できます。CRISPR 食べる方法は、必要な S.pyogenes PAM (protospacer 隣接する動機) がターゲット サイトに従わない複製された gRNAs の数を減らすための戦略を採用し、それのためのすべての可能な機能 gRNAs の小さい一部分だけが生成されます、指定された領域。CORALINA、一方でソース シーケンスのすべての潜在的な gRNAs を生成することができるがまた非機能的なガイドの高い割合が組み込まれています。任意の種の包括的な gRNA ライブラリの製造を可能に gRNA ライブラリを生成制御のヌクレアーゼ活性をシンプルかつコスト効果の高い方法で任意の Cas9 蛋白質またはエフェクター システム。さらに、CORALINA は、適切な入力とベクトルの選択肢を定義するライブラリの種類、サイズ、コンテンツのカスタマイズに適応されます。ここでは、詳細なプロトコルが表示細菌人工染色体 (BACs) またはゲノム DNA9を含む DNA (図 1) のさまざまなソースから包括的な gRNA ライブラリの生成に使用することができます。このプロトコルを伴う代表的な結果は、BAC DNA に CORALINA プロトコルを適用することによって得られました。

<table><tbody><tr><td>500 mM EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03777-10G</td><td>1.4., Mnase</td></tr><tr><td>Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td> の不活性化 <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>LC6678</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg;TBEゲル、20%、10ウェル</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6315BOX</td><td>2.1.、既製の20%PAGEゲル</td></tr><tr><td>O'RangeRuler 5 bp DNAラダー、</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1303</td><td>2.1。</td></tr><tr><td>Novex&reg;TBEランニングバッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>LC6675</td><td>2.1., PAGEゲルランニングバッファー</td></tr><tr><td>使い捨てメス, 滅菌</td><td>VWR&nbsp;</td><td>233-5363&nbsp;</td><td>2.3.、他の同等の試薬を使用することができます</td></tr><tr><td>SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td> S9430</td><td>2.3. +2.5., Thermo Fisher Scientific (S7563)</td></tr> <tr><td>UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593-031</td><td>3.6.1. + 4.3., 他の同等の試薬も使用可能</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma</td><td>10901393001</td><td>3.6.4., 他の同等の試薬も使用可能</td></tr><tr><td>3M 酢酸ナトリウム , pH5.2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;R1181</td><td>3.6.4.、他の同等の試薬はエ</td></tr><tr><td>タノールを使用できます&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3.6.4. + 9.1.8.、分子生物学グレード</td></tr><tr><td>クイック鈍化キット&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E1201</td><td>4.1。</td></tr><tr><td>酢酸アンモミウム</td><td>Sigma</td><td> A1542</td><td>3.1.、他の同等の試薬は</td></tr>酢<tr><td>酸マグネシウム</td><td>Sigma</td><td> M5661</td><td>3.1.、他の同等の試薬は</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA(pH 8.0)</td><td>VWR</td><td>&nbsp;MOLEM37465520(またはプロメガV4231)</td><td>2.2. + 3.1.、他の同等の試薬は、</td></tr><tr><td>アジャンクールAMPure XPビーズ</td><td>ベックマンコール</td><td>ターA63881</td><td>5.3. + 6.5を使用することができる。</td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>5.7.+ 7.1. +8.4., 他の同等の試薬は、</td></tr><tr><td>濃縮T4 DNAリガーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>&nbsp;M0202T</td><td>6.1.+ 8.1.2.</td></tr><tr><td>ロングアンプTaq 2Xマスターミックス&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0287S</td><td>6.3。</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New</td><td>England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>5.1. + 6.6., 他の同等の試薬は使用できます</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>5.4.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>SacII</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0157S</td><td>5.4.2。</td></tr><tr><td>AgeI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0552S</td><td>8.2.1。</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>シグマ</td><td>93362</td><td>8.1.1。</td></tr><tr><td>2M MgCl</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>dGTP、dATP、dCTP、dTTP</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N0446S</td><td>8.1.1。</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigam</td><td> DTT-RO</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Sigma</td><td> P5413</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma</td><td> N6522</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>T5エキソヌクレアーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0363S</td><td>8.1.2。</td></tr><tr><td>Phusion DNAポリメラーゼ&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0530S</td><td>8.1.2。</td></tr><tr><td>Taq DNAリガーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0208L</td><td>8.1.2。</td></tr><tr><td>rSAP</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0371S</td><td>8.3.1。</td></tr><tr><td>TG1コンピテントセル</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td>9.1。</td></tr><tr><td>1mmギャップエレクトロポレーションキュベット&nbsp;</td><td>VWRの</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>バイオアッセイディッシュ(ポリスチレン、245 mm x 245 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DIS-988-010M&nbsp;</td><td>9.4.NaCl</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>S7653&nbsp;</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>BD</td><td>211705</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>BD</td><td>212750</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>寒天</td><td>Sigma</td><td> A1296</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma</td><td> G5516</td><td>9.17.</td></tr><tr><td>MNAse</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0247S</td><td>1.1。</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>全体 Micropulser</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット</td><td>Biorad</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.250ml</td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>コーニング</td><td>430776</td><td>9.1-9.9。</td></tr></tbody></table>

大規模な grna ライブラリ生産 dna の任意のソースからの普遍的なプロトコル

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

ゲノム、エピゲノム工学 CRISPR/Cas9 システムの人気は、そのシンプルさと適応性から生じています。エフェクター (Cas9 ヌクレアーゼやヌクレアーゼ死者 dCas9 融合タンパク質) がガイド RNA、または gRNA として知られている小さい合成 RNA ゲノムの特定のサイトを対象と。CRISPR システムの二部の性質は、個々 の gRNAs の何千もの格納式カセットは単一の実験で多数の異なるサイトを調査する使用ことができますプラスミド ライブラリからスクリーニングのアプローチでの使用できます。
日には、ライブラリの構築のための gRNA シーケンスをライブラリ内のシーケンスの達成可能な複雑さを制限、比較的コストのかかるオリゴヌクレオチド合成によってほとんど専ら生成されています。ここで詳細なプロトコル CORALINA (制御のヌクレアーゼ活性を通じて包括的な gRNA ライブラリを生成)、単純な非常に複雑な gRNA ライブラリの生成コスト法に基づいて入力 DNA の酵素消化、記載されています。カスタマイズ オプションの多くが存在する DNA の任意のソースから、CORALINA ライブラリを生成できますので、多種多様な CRISPR ベースの画面を有効にします。

手でプロトコルを使用して、CORALINA gRNA ライブラリは人間およびマウスのゲノム DNA9と BAC DNA (図 1) から生成されています。GRNA 発現ベクターへのクローニングのために適した入力の DNA の断片を生成するには、制御ヌクレアーゼ消化のための最適の条件は覚悟しなければなりません。ミクロコッカスヌクレアーゼ消化の最適化のための典型的な結果を図 2 aに示します。ヌクレアーゼの不十分な量 (0.1、2、3、4、4.5 または 5 単位) 作り出す必要なサイズ範囲 (10-100 bp) の顕著なプロダクトおよび 5.5 7.5 単位まだ断片が生成されるない平均長すぎる上にあります。大量の酵素 (50 台) は、10 分後入力 DNA の過度の低下に します。その結果、中間の量 (10 台) に選ばれました。ダイジェストされたスケール アップ十分生産する後続の精製とクローニング (図 2 b) の断片を消化します。盲目的にサイズによって DNA のフラグメントを選択し、方向の DNA のフラグメントの紫外線への露出を最小限に抑えるための DNA ラダーのみに依存することをお勧めします中のゲルは消化と切断の品質管理のためその後汚すことが。図 2 bは、20 と 30 bp の断片を DNA から切除されているページのゲルの代表的な例を示しています。ゲル精製 MNase 成功したサイズの選択と MNase 消化フラグメント (図 2) の浄化を確認するページのゲル 20% にフラグメントを読み込みました。手元のプロトコルは選択の gRNA 発現ベクターに MNase 消化断片のクローンを作成できるように、カスタマイズされたリンカー シーケンスの使用と互換性が。ここでは、gRNA PLKO9は、バックボーンとして使用されました。リンカーは、標準 PCR を使用して gRNA 発現ベクターから増幅されます。図 2 Dは、増幅されたリンカー シーケンス、不適切な追加を欠いているまたはないテンプレート amplicons の代表的な例を示しています。次に、リンカー amplicons は正しい方向に MNase 消化断片にリンカーが組み合わされてできるように制限の酵素と消化されます。予測 637 と 295 にリンカーの完全な消化力を示す図 2 Dを示し、5' と 3' のリンカーの agarose のゲルの前にハインドIII とSacII 消化後、それぞれ bp。ゲル画像の右側の部分は文書消化リンカー フラグメントの切除です。次ゲルの消化のリンカーの抽出、プロトコルの次のステップは終わり修理 MNase 消化フラグメント リンカーの結紮。リンカー シーケンスはペプタイドのプライマーを用いた PCR による生成される、ために、リンカーのセルフライゲーションは起こらないはず。だけで終わり修理 MNase 消化 DNA のフラグメントは、ligation に必要なリン酸基を提供します。次の刻み目変換結紮製品は PCR によって増幅されます。ライブラリ内の gRNA シーケンスの表現を歪める過度の PCR 増幅バイアスを避けるためには、増幅は合計で 20 未満のサイクルに限定されます。次の PCR 増幅製品は agarose のゲルを視覚化する困難です。32 サイクル別コントロール Pcr 製品を検出する行われ (しかしライブラリの準備のため使用されません)。このコントロールの結果 PCR図 2Eで表示されます。これにより、ライゲーション反応を最適化するために、時々「フラグメント コントロールなし」で発生する PCR の工芸品を欠いている反応を確実にする (NFC).図 2E目的の増幅を示します (5' リンカー DNA フラグメント + 3' リンカー、長: 869 bp) 次のフラグメントとリンカー シーケンスの等モル (1:1) 比を用いたライゲーション反応の増幅。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> 図 1: GRNA ライブラリの準備のためのタイムラインを提案します。CORALINA は、あらゆる有機体から DNA さまざまの茄多から包括的な gRNA ライブラリの生成のシンプルでコスト効率の高い戦略を提供しています。手でのプロトコルは、1 つの仕事週の間に完了するまで同伴可能です。リンカーの世代は、DNA の端-修理と並行して実行できます。Electrocompetent 細菌の準備 2 日かかります一晩成長ステップが含まれています、したがって反応されてアセンブリの前に開始する必要があります。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> 図 2: プロトコル間の重要な手順を実行します。 (A) 制御消化 BAC DNA の異なるサイズのフラグメントの生成を有効にします。ここで示すように、MNase 消化の最適化です。10 分 10 U MNase の生成 (20-30 bp) の所望の長さの DNA 断片の精製の BAC DNA は MNase の量が異なると扱われました。(B) サイズ ポリアクリルアミドゲルから切除を使用して 20 と 30 bp の断片の選択。精製の BAC DNA は、10 U の 10 分の MNase で処理しました。画像は、切除後記録されました。フラグメントのゲル精製の (C) 品質管理。ゲル精製後 1/6 20% 成功サイズ選択と浄化を確認するページのゲル精製 MNase の積まれ断片。(D) 方向クローニングようにリンカーのアセンブリおよび制限の酵素の消化力のためのリンカー配列の増幅。5' と 3' のリンカーは増幅され、 HindIIIとSacII、それぞれカットします。いいえテンプレート コントロール (NTC) は PCR の工芸品の DNA 汚染コントロールに含まれていた。左: 分析のサンプル アプリケーション。右: 取サンプル アプリケーション。画像はゲル切除後記録されました。PCR を用いた PCR サイクル (32) 数の増加と H2O (NTC) テンプレート コントロールを実行せずまたは前のニック変換手順から NTC の使用によって制御される (E) DNA のフラグメントへのリンカーの結紮を分析できます。入力 (NTC NT))。コントロールが含まれていないフラグメントには (NFC), 結紮と元 MNase フラグメントが省略されたニック翻訳反応から増幅であることが重要です。どの MNase のフラグメントは、リンカー DNA と組み合わされているサンプル生産予想私アンプリコンだけ (869 bp)。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

大規模な gRNA ライブラリを生成するためのメソッドは、シンプルで効率的かつコスト効果の高いはずです。ターゲット DNA の酵素の消化力に基づく gRNA ライブラリの生産のためのプロトコルについて述べる。このメソッド CORALINA (制御のヌクレアーゼ活性を通じて包括的な gRNA ライブラリを生成) は高価なカスタム オリゴヌクレオチド合成に代わるものを提示します。

大規模な gRNA ライブラリ生産 DNA の任意のソースからの普遍的なプロトコル

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

この手法の全体的な目的は、あらゆるソースから精製されたDNAを用いて、包括的なガイドRNAライブラリを構築することです。gRNAライブラリは、CRISPRベースのスクリーニングに使用されるプラスミドの集合体です。CORALINA法では、精製DNAを酵素消化し、得られた断片をガイドRNAライブラリのバックボーンにクローニングします。この手法の主な利点は、入力配列から考えられるすべてのガイドRNAを生成でき、非常に費用対効果が高いことです。本ビデオでは、細菌人工染色体からのCORALINAライブラリの保護について実演していますが、この方法は原理的に、あらゆる生物のあらゆる種類の入力DNAに適用可能です。また、マイクロコッカスヌクレアーゼの新しいバッチを使用するたびに、その消化反応の最適化を行う必要があります。各反応につき、以下を準備する。10x micrococcal nuclease bufferを1 µL、1x bovine serum albumin、標的DNAを1 µg、micrococcal nucleaseを1 µL加え、水を加えて全量を10 µLとする。37 °Cで15分間インキュベートする。500 millimolar EGTAを1 µL添加し、直ちに酵素を不活性化します。DNAサンプルにゲルロード用色素を含むサンプルバッファーを加え、20%ポリアクリルアミドゲルに1ウェルあたり1 µgのDNAをロードします。サイズ確認のため、適切なDNAラダーをロードします。1x TBE泳動バッファーを用い、150ボルトで約1.5時間、または下側の色素前線がゲルの下端に到達するまで電気泳動を行います。超高感度核酸染色剤を用いてゲルを染色し、UVライト下で可視化します。この例では、DNAを20から30塩基対のサイズまで消化するためのマイクロコッカスヌクレアーゼの最適濃度は10ユニットでした。最適化反応で示した方法と同様に、この最適濃度のmicrococcal nucleaseを用いて、10から12 µgの標的DNAを消化します。PAGEでDNA断片を分離した後、滅菌済みメスを使用してマーカーレーンの隣のゲルを切り出し、ラダーが含まれる部分のみを、超高感度核酸染色剤を含む新鮮な1x TBE電気泳動バッファーで染色します。DNAラダーを可視化し、カミソリを用いて、およそ18から30 base pairsのサイズ範囲にあるmicrococcal nuclease消化DNA断片を切り出します。ゲルスライスをマイクロセントリフュージチューブに移します。ゲルの残りを、前述の手順に従って核酸染色剤で染色します。ゲルにUV光を照射し、ゲル切り出し工程の記録として画像を保存します。滅菌済みのピペットチップを用いて、切り出したゲルスライスをマイクロ遠心チューブの壁面に押し付けて潰すことからこの手順を開始します。ゲルの2倍量のPAGE溶解バッファーを加え、回転プラットフォーム上で37 °Cで16時間インキュベートします。翌日、サンプルをマイクロ遠心機を用いて最大速度で1分間遠心分離します。破砕されたゲルの断片が混入しないように注意しながら、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。ゲルペレットに0.5倍量のPAGE可溶化バッファーを加え、ボルテックスした後、再度遠心分離を行います。上清を合わせ、テキストプロトコルに記載されている標準的なフェノール・クロロフォーム抽出法を用いてDNA断片を抽出します。DNA断片の単離と並行して、標準的なPCRを用いてガイドRNA発現ベクターからリンカーを増幅させます。方向性クローニングを確実にするため、テキストプロトコルに記載されている通り、リンカーを適切な制限酵素で消化します。リンカーの制限酵素消化液を1%アガロースゲルで電気泳動します。目的のバンドを切り出し、ゲル抽出キットを用いて切り出したゲルピースからDNAを精製します。末端修復反応にはDNAブランキングキットを使用します。マイクロ遠心チューブに以下を添加します。精製したDNA 10 µL、10x blunting buffer 1.5 µL、1 mM dNTP mix 1.5 µL、水 1.4 µL、およびblunting enzyme 0.6 µLを加えます。22 °Cで30分間インキュベートした後、70 °Cで10分間インキュベートして酵素を加熱活性化させます。水 85 µLを加え、テキストプロトコルに記載されている反応クリーンアップを行います。テキストプロトコルに従い、マイクロコッカスヌクレアーゼで消化し修復した断片とリンカー配列を等モル量ずつ用い、14 µLのライゲーション反応系をセットアップします。ニックトランスレーション後、ライゲーション産物をPCRで増幅させます。5'末端と3'末端に正しくリンカーが付加されたマイクロコッカスヌクレアーゼ断片を、2つの5'リンカーまたは2つの3'リンカーを持つ断片から分離するため、15サイクルのPCR反応液をすべて混合し、DNAローディングダイーを加えて0.8%アガロースゲルで電気泳動を行います。869 base pairsの顕著なバンドを切り出し、ゲル抽出キットを用いてDNAを精製します。分光光度計を用いてDNA量を定量します。その後、テキストプロトコルに詳述されている通り、Gibson assemblyによりPCR増幅断片をguide RNA発現ベクターにクローニングします。この手順を開始するために、精製したベクターインサート構築物を滅菌済みの予冷したPCRチューブに分注し、氷上で保持します。1mmギャップの電気穿孔用キュベットを氷上で冷却します。調製したばかりのTG1細胞25マイクロリットルをDNAの一分注量に直接加え、直ちに混合液を電気穿孔用キュベットに移します。キュベットを軽く弾くか叩き、気泡や空気の混入がない状態で、細胞とDNAの混合液がキュベットチャンバーの全域に均一に分散するようにします。キュベットをスライドチャンバーにセットし、適切なエレクトロポレーションプログラムを開始します。直ちに、室温の2TY 475 µLをキュベットに加えます。エレクトロポレーション後の細菌を50 mLチューブに移します。個別のエレクトロポレーションを繰り返し、1つのライブラリで形質転換されたすべての細胞を1つの50 mLチューブに回収し、全量を記録します。ライブラリ全体の総コロニー数を推定するため、ライブラリで形質転換された細菌の規定のごく少量を、適切な抗生物質選択剤を含む10 cmアガープレートに塗布します。残りの細菌の容量を減らすため、約 4,000 g で10分間、または目に見えるペレットが形成され上清が透明になるまで遠心分離します。上清を数ミリリットル除いてすべて取り除き、細胞を再懸濁します。適切な抗生物質選択剤を含む 2TY アガーコーティング済みバイオアッセイ皿に細菌を塗抹します。適切な量のpUC19コントロール電撃法反応液を、適切な抗生物質選択剤を含む別の10cmアガープレートに播種します。アガープレートを37°Cで一晩インキュベートします。翌日、コントロールプレートのコロニー数をカウントし、細菌のDNA 1µgあたりのコロニー形成単位（CFU）およびライブラリーの複雑性を推定します。最後に、プラスミドDNA抽出のためにプレートから細菌を回収します。ゲル精製後、精製されたmicrococcal nuclease断片の1/6を20%PAGEゲルに電気泳動し、サイズ選択と精製が正常に行われたことを確認しました。リンカーアンプリコンを制限酵素で消化し、micrococcal nucleaseで消化された断片にリンカーが正しい向きでライゲーションされていることを確認しました。この代表的なゲル画像の左側は、それぞれHindIIIおよびSacIIによる消化前後の5'および3'リンカーを示しており、リンカーが予測通り637 base pairsおよび295 base pairsに完全に消化されたことを示しています。ゲル画像の右側は、消化されたリンカーフラグメントの切り出しを記録したものです。DNAフラグメントへのリンカーのライゲーション成功は、PCRサイクル数を増やしたPCRを用いて分析しました。コントロールとして、前段階のニックトランスレーション工程で用いたテンプレートなしコントロールを入力としたテンプレートなしコントロールと、マイクロコッカスヌクレアーゼ断片なしコントロールを含めました。マイクロコッカスヌクレアーゼ断片とリンカーDNAを結合させたサンプルのみで、期待される869 bpの増幅産物が得られました。この手法を習得し、適切に実施すれば、5日間で完了させることが可能です。この手順を行う際は、ライブラリの複雑性を維持し、他のコントロール反応を実施することが重要です。このビデオを視聴することで、DNAを断片化し、それらをライブラリベクターバックボーンにクローニングすることにより、CRISPRベースのスクリーニング用ガイドRNAライブラリを構築する方法について十分に理解できたはずです。

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