大規模な gRNA ライブラリ生産 DNA の任意のソースからの普遍的なプロトコル

この方法の全体的な目標は、あらゆるソースから精製されたDNAから包括的なガイドRNAライブラリーを構築することです。gRNAライブラリーは、CRISPRベースのスクリーニングで使用されるプラスミドコレクションです。COROLINA法は、精製されたDNAの酵素消化を使用して、得られたフラグメントをガイドRNAライブラリーバックボーンにクローニングします。

この技術の主な利点は、入力配列から可能なすべてのガイドRNAを生成し、非常に費用対効果が高いことです。このビデオでは、細菌の人工染色体からCORALINAライブラリーを保護する方法を示していますが、この方法は原則として、あらゆる生物のあらゆるタイプのインプットDNAに適用できます。ミクロコッカスヌクレアーゼ消化の最適化は、ミクロコッカスヌクレアーゼの新しいバッチごとに実行する必要があります。

各反応について以下を設定します。1マイクロリットルの10xマイクロコッカスヌクレアーゼ緩衝液、1xウシ血清アルブミン、1マイクログラムの標的DNA、1マイクロリットルのマイクロコッカスヌクレアーゼおよび水から10マイクロリットル。摂氏37度で15分間インキュベートします。

500ミリモルEGTAの1マイクロリットルを追加して、酵素を直ちに不活性化します。ゲルローディング色素を含むサンプルバッファーをDNAサンプルに加え、20%ポリアクリルアミドゲルにウェルあたり1マイクログラムのDNAをロードします。サイジングに適したDNAラダーをロードします。

ゲルを1x TBEランニングバッファーに150ボルトで約1.5時間、または下部の色素前面がゲルの下端に達するまで分析します。超高感度核酸染色剤を用いてゲルを染色し、UV光下で可視化します。この例では、DNAを20〜30塩基対のサイズまで消化するためのミクロコッカスヌクレアーゼの最適濃度は10単位でした。

この最適濃度のミクロコッカスヌクレアーゼを使用して、最適化反応で実証されたのと同じ方法で10〜12マイクログラムの標的DNAを消化します。DNA断片をPAGEで分離した後、滅菌メスを使用してマーカーレーンの隣のゲルを切断し、ラダーを含むゲルの一部のみを超高感度核酸染色を含む新鮮な1x TBEランニングバッファーで染色します。DNAラダーを視覚化し、カミソリの刃を使用して、約18〜30塩基対のサイズ範囲でMicrococcal Nuclease消化されたDNAフラグメントを切り取ります。

ゲルスライスを微量遠心チューブに移します。前述の通り、ゲルの残りの部分を核酸染色液で染色します。ゲルをUV光にさらし、ゲル切除ステップの記録として画像を取得します。

この手順は、滅菌ピペットチップを使用して、切除されたゲルスライスをマイクロ遠心チューブの壁に押しつぶすことから始めます。ゲル容量2容量のPAGE可溶化バッファーを添加し、回転プラットホーム上で摂氏37度で16時間インキュベートします。翌日、サンプルを微量遠心分離機で最高速度で1分間遠心分離します。

上清を新しい微量遠心チューブに移し、砕いたゲル片を移さないように注意してください。0.5容量のPAGE可溶化バッファーをゲルペレットに添加し、ボルテックスして遠心分離を繰り返します。上清を結合し、テキストプロトコルに記載されている標準的なフェノール-クロロホルム抽出法を使用してDNA断片を抽出します。

DNA断片の単離と並行して、標準PCRを使用してガイドRNA発現ベクターからリンカーを増幅します。方向性クローニングを確実にするために、リンカーは、テキストプロトコルに記載されているように、適切な制限酵素で消化されます。リンカーの制限酵素消化物を1パーセントアガロースゲルで分析します。

正しいバンドを切除し、ゲル抽出キットを使用して切除したゲル片からDNAを精製します。DNA鈍化キットは、末端修復反応に使用されます。以下をマイクロチューブに加えます。

精製DNA10マイクロリットル、10x鈍化緩衝液1.5マイクロリットル、1ミリモルdNTPミックス1.5マイクロリットル、水1.4マイクロリットル、鈍化酵素0.6マイクロリットル。摂氏22度で30分間インキュベートした後、摂氏70度で10分間インキュベートすることにより、酵素を加熱して活性化します。85マイクロリットルの水を加え、テキストプロトコルに記載されているように反応クリーンアップを実行します。

テキストプロトコールに記載されているように、等モル量のミクロコッカスヌクレアーゼを消化および修復したフラグメントおよびリンカー配列を使用して、14マイクロリットルのライゲーション反応を設定します。ニックトランスレーションに続いて、ライゲーション産物をPCRによって増幅します。正しく結合した5プライムリンカーおよび3プライムリンカーを有するマイクロコッカスヌクレアーゼフラグメントを、2つの5プライムリンカーまたは2つの3プライムリンカーを有するフラグメントから分離するには、15サイクルのPCR反応をすべて組み合わせ、DNAローディング色素を添加して、0.8%アガロースゲル上で泳動します。

プロミネントバンドを869塩基対で切り取り、ゲル抽出キットを使用してDNAを精製します。分光光度計を使用してDNAの量を定量します。続いて、PCR増幅フラグメントを、テキストプロトコルに詳述されているように、GibsonアセンブリによってガイドRNA発現ベクターにクローニングする。

この手順を開始するには、精製したベクターインサートコンストラクトを滅菌済みおよび事前に冷却したPCRチューブに分注し、氷上に保ちます。1ミリメートルギャップのエレクトロポレーションキュベットを氷上で冷却します。調製したばかりのTG1細胞25マイクロリットルをDNAの1アリコートに直接加え、すぐに混合物をエレクトロポレーションキュベットに移します。

キュベットをフリックまたはタップして、細胞とDNAの混合物がキュベットチャンバーの長さに沿って分布し、空気や気泡が閉じ込められていないことを確認します。キュベットをスライドチャンバーに置き、適切なエレクトロポレーションプログラムを開始します。すぐにキュベットに室温2TYの475マイクロリットルを追加します。

エレクトロポレーションされた細菌を50ミリリットルのチューブに移します。個々のエレクトロポレーションを繰り返し、1つのライブラリで形質転換されたすべての細胞を1つの50ミリリットルチューブに収集し、総容量を文書化します。ライブラリ全体のコロニーの総数を推定するには、適切な抗生物質を選択した10センチメートルの寒天プレートに、ライブラリとともに形質転換した定義された少量の細菌をプレート化します。

残りの細菌の体積を減らすには、約4, 000 gで10分間、または目に見えるパレットが形成されて上清が透明に見えるまで遠心分離します。上清を数ミリリットルを除いてすべて取り除き、細胞を再懸濁します。適切な抗生物質の選択を含む2TY寒天コーティングバイオアッセイ皿に細菌をプレートします。

適切な量のpUC19コントロールエレクトロポレーション反応を、適切な抗生物質を選択して追加の10cm寒天皿に広げます。寒天プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、制御されたプレート上のコロニーの数をカウントして、細菌のDNAマイクログラムあたりのコロニー形成単位とライブラリの複雑さを推定します。

最後に、プラスミドDNA抽出のためにプレートから細菌をこすり落とします。ゲル精製後、精製したmicrococcal nucleaseフラグメントの1/6を20%PAGEゲルにロードし、サイズ選択と精製が成功したことを確認しました。リンカーアンプリコンは、リンカーがミクロコッカスヌクレアーゼ消化フラグメントに正しい向きでライゲーションされるように、制限酵素で消化されました。

この代表的なゲル画像の左側は、HindIIIおよびSacIIによる消化前と後の両方で5つのプライムリンカーと3つのプライムリンカーを示しており、リンカーが予測される637塩基対と295塩基対に完全に消化されたことを示しています。ゲル画像の右側は、消化されたリンカーフラグメントの切除を記録しています。リンカーのDNA断片へのライゲーションの成功を、PCRサイクル数を増やしたPCRを用いて解析しました。

含まれるコントロールは、前のニック変換ステップのテンプレートなしコントロールを入力として使用するテンプレートなしコントロールと、マイクロコッカスヌクレアーゼフラグメントなしコントロールでした。ミクロコッカスヌクレアーゼフラグメントをリンカーDNAと結合したサンプルのみが、869塩基対の予想アンプリコンを生成しました。このテクニックを習得すると、適切に行えば5日で実行できます。

この手順を試行する際は、ライブラリの複雑さを維持し、他の制御反応を実行することが重要です。このビデオを見れば、DNAを細かく切り刻み、これらをライブラリベクターバックボーンにクローニングすることで、CRISPRベースのスクリーニング用のガイドRNAライブラリを生成する方法について十分に理解できるはずです。