ラットの視神経の部分断裂: 網膜神経節細胞の二次変性を評価する新しい手術アプローチとの確立モデル

網膜神経節細胞の二次変性は、主に緑内障で発生します。この論文は、視神経部分離断の革新的な手術アプローチモデルを示しています。この省スペースの手術アプローチにより、部分的に交差した視神経の断端に薬物やキャリア、またはRGCの選択的トレーサーを投与する研究者の能力が向上し、研究者はRGCの二次損傷メカニズムを新しい方法で研究することができます。

緑内障は慢性神経変性疾患であり、進行性の神経病理は長期間持続します。高眼圧症は緑内障の明確な原因の1つであり、高眼圧症の減少が緑内障治療の唯一の有効な治療法であることが確認されています。しかし、一部の患者の状況は、高眼圧症が制御された後でもさらに悪化します。

したがって、RGCの二次変性は緑内障で起こると考えられています。しかし、一次性変性または二次性変性に特異的に関連するメカニズムはまだ明らかではありません。RGCの二次変性メカニズムは、神経外傷およびCES神経変性疾患の治療を導きます。

視神経の部分的な定量的切断を支援するために、新しく設計された低コストの手術器具を紹介します。この装置は、ハンドヘルドポールと溝付きヘッドの2つの部分で構成されています。溝付きヘッドは半円形で、垂直方向の深さは200マイクロメートルで、溝付き表面により、腹側視神経がその中に横たわり、切断のために安定させることができます。

視神経を器具の溝に置きます。器具の溝付き表面により、視神経を安定させて切断することができます。次に、適切な針先またはナイフの先端で視神経を垂直に横断します。

視神経の背側部分のみが切り取られるので、腹側部分は器具で保護されているので注意してください。視神経の周りの硬膜を分離して解離し、髄膜鞘に関連する眼動脈を切断しないようにします。一次損傷は、定量的に切断された視神経軸索に対応する RGC (背側) で達成されましたが、二次損傷は、交差していない視神経軸索に対応する RGC (中央側および腹側) で、直接的な損傷はありません。

ラットは、獣医用イソフルラン気化器システムを使用して麻酔をかけられました。手術中は麻酔が監視され、それに応じてイソフルランの投与量が調整されました。呼吸の深さと速度を常に評価し、5分ごとにつま先をつま先でつま先つまむ評価を行って、深い痛みがないことを確認します。

ラットの右側を上向きにして手術台に置き、頭を手術台に向けて置きます。手術視野の中央で右軌道を調整します。次に、0.5%クロルヘキシジンと75%エタノールを適用して、外側眼瞼に沿って右眼窩皮膚の外部音響孔までの切開領域を数回清掃します。

虹彩はさみを使用して、外側眼角と外部音響孔の間の毛皮を取り除きます。虹彩ハサミを使用して、外側眼角に沿って外側の音響孔までの長さ0.5〜1センチメートルで皮膚を切開します。次に、筋膜をつまんで上に引っ張ると、0.12ミリメートルの歯付き鉗子を備えた三角形のくさびが作成されます。

バンナススプリングハサミの下刃を切開部に挿入し、ハサミの皮と同じせん断方向で筋膜を切り開きます。特に外側外側眼角の皮下筋膜を切断する場合は、鋭い鋸歯状の鉗子を使用して筋膜表面の皮下筋膜を垂直に上に引っ張り、Vannasスプリングハサミで筋膜を切断して、外側眼窩静脈の損傷を避け、過度の出血によるモデル不良を引き起こします。虹彩ハサミで筋膜を切断し、眼窩静脈を露出させます。

鈍い解剖を使用して、切開部の両側を開きます。この手技の利点は、血管を直接切断する際に出血を防ぐことができることです。次に、虹彩はさみを使用して右外側眼角を切開線に沿って切断し、外科的アプローチを完全に露出させ、眼窩筋のフォローアップ鈍的解剖のための視野を完全に露出させます。

筋膜下眼窩筋のフォルダーを固定し続け、皮膚と筋膜切開の方向に垂直に分離を鈍らせます。次に、徐々に側面に沿って分離し、眼窩脂肪組織が出現するまで眼窩の深さに到達します。この手順により、眼窩腔のより深い部分が開き、視神経を覆う組織に干渉することなく作業するためのより大きな手術窓が提供されます。

上記の手順では、出血が発生した場合は、滅菌済みの外科用綿棒または綿棒を使用して圧力をかけます。眼窩内の脂肪組織を露出させた後、ラットの頭の方向を外科医に垂直に向ける方向から外科医の右側に変えます。視神経の周りの眼窩筋円錐に覆われた眼窩脂肪組織を切除します。

このアクションは、適切な外科的アプローチを確保し、公開することができます。切除した脂肪組織の量は、出血が続かないように合理的な範囲内に抑えるようご注意ください。脂肪組織を切除した後、外側の直腸が露出します。

外側の直筋を外側にクランプし、バンナスのスプリングハサミで切ります。この手順の目的は、外側直筋がはるかに広く、視神経の視界を明らかに遮っているため、視神経のより良い露出を達成することです。外側直筋の下にまだ脂肪組織がある場合は、0.12ミリメートルの歯付き鉗子を使用して視神経を覆っている脂肪を引き上げ、バンナスのスプリングハサミで切断します。

次に、視神経の周りの組織鞘が見えます。視神経が完全に露出するまで、眼窩の深さで視神経の方向に沿って組織鞘を分離し続けます。外科用綿棒を使用して、組織の除去から発生する少量の血液をきれいにすることにより、領域を清潔に保ちます。

これで視神経が見えるはずです。神経にアクセスするためには、眼動脈を傷つけずに神経を囲む髄膜鞘を抜く。シースをゆっくりと回転させて、手術用顕微鏡の倍率を上げて硬膜の血管パターンを調べます。

血管がない領域を探し、硬膜の縦方向の切断を許可します。側方の切り傷による血管系の損傷を避けるために、針先またはナイフの先端で視神経の方向に平行に鞘を裂きます。神経を覆うために残ったのはくも膜だけでした。

とても薄くて透明感があります。前の手順と同様に、くも膜を針先またはナイフの先端で、視神経の方向に平行にそっと裂きます。視神経を器具の溝内に柔らかく慎重に置くと、背側の視神経が溝の頭の端よりわずかに高くなります。

次に、針先またはナイフポイントで溝頭のプラットフォームエッジの上にある背側視神経を横断して、視神経の部分的な切断を完了します。視神経を解放するために、視神経の垂直方向に向かって、器具を少し深く動かします。次に、楽器のグルーブヘッドをそっと取り出します。

余分な損傷を避けるために、眼の筋肉や他の組織を傷つけないようにしてください。その後、視神経の部分的な断端を観察することができます。外側直筋、筋膜、および目の組織の周りの他のものを元の位置に交換します。

次に、眼窩の筋肉層と皮膚層を順番に縫合します。縫合後の感染を防ぐために、創傷に抗生物質軟膏を塗布します。ラット蘇生の過程では、加熱マットで断熱材を準備するか、ケージ内に乾いたパッドで覆います。

暖かく保つためにそれらを毛布で覆います。回復過程でラットの気道開存性を確保します。動物は独立して飼育され、手術後も注意深く観察されました。

自己設計の手術助手器具を使用して、新しい手術アプローチによる二次損傷モデルの確立に関する成功を検証するために、モデルが確立された直後にRGCを逆行的に標識しました。この手順の目的は、神経トレーサー色素を上丘に注入することにより、RGCを逆行性に標識することでした。染料は網膜のRGCに逆行的に取り込まれ、右眼の未交差軸索を持つ生きているRGCのマーカーを提供します。

右眼で部分的に横断された視神経軸索に対応するRGCは、Fluoro-Goldで標識できませんでしたが、対照眼として、手術なしで左目、網膜上の視神経に沿ったRGCはすべて、上丘から逆行的に蛍光金染料でマーキングされました。視神経部分離断の有無にかかわらず、蛍光標識RGCの結果が示されました。視神経の非交差部分に対応する右網膜のRGCのみを蛍光金で標識し、非標識RGCと標識RGCの明確な境界を視覚化し、視神経の部分的な切断を実証した。

対照眼として、左眼網膜のすべてのRGCを蛍光金で標識しました。これらの画像は、手術前後に右眼の血液供給が観察されたことを示しています。手術後、動脈はまだ血液で満たされており、静脈の閉塞は観察されませんでした。

これは、手術中に血液供給システムに損傷がなかったことを示しました。RGCの二次縮退モデルが成功裏に確立されました。ポテンシャル視神経切断モデルは、二次変性のメカニズムを研究し、二次変性と戦う神経保護薬のスクリーニングに使用できる動物モデルです。

このモデルの融合は、視神経と網膜の両方で、一次変性症と二次変性症を位置で正確に分離する能力です。当社が設計した装置の主な利点は、再現性が高く、操作が容易になることです。練習すれば、最初のエントリーカットが行われた後、完全な外科的処置のすべてのステップを片目あたり10〜15分で完了することができます。