生体内でひと脂肪由来間葉系幹細胞が脂溶性膜の蛍光色素をラット膝関節変形性関節症モデルでの追跡

このプロトコルでは、効率的に遠赤色蛍光 (IA) の関節内注入によるラット膝変形性関節症 (KOA) モデルで、セルの永続性とひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSCs) の体内を監視する方法について説明します。

この手順の全体的な目標は、in vivo 蛍光イメージングを使用して、ラット膝骨炎、または KOA モデルにおけるヒト脂肪由来間葉系幹細胞の細胞持続性と生体内分布の有効性を評価することです。In vivo幹細胞の追跡は、KOA動物モデルの間葉系幹細胞に由来するヒト脂肪の刺激と分布に関する再生数学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。DiDを使用する主な利点は、ラットシフト発光スペクトルにより、細胞作用や色素標識細胞の機能的損傷なしに、生きた動物の深部組織イメージングが可能になることです。

麻酔をかけた250〜300グラム、8〜12週齢の雄のSprague Dawleyラットを加熱パッドの左側位置に置きます。カミソリを使用して右膝を徹底的に剃り、10%ポビドンヨード溶液と70%エタノールで手術部位を消毒します。非外科的領域をサージカルパッドで覆います。

そして、メスを使って膝蓋腱に沿って横方向に2センチの切開を行い、関節包を露出させます。次に、外科用メスを使用して内側側副靭帯を横断し、半月板を大腿骨に向けて反射させ、鉗子で内側半月板をつかみます。メスを使用して、脛骨アタッチメントから最も狭い点で半月板を切り抜きます。

信頼性と実行可能性の高いKOA発症を得るためには、各実験動物で半月板の大腿骨側を完全に切断する必要があります。次に、4-O観察可能な縫合糸で関節包を閉じ、ラットが完全に回復するまでラットを監視します。手術の8週間後、ヒト脂肪由来間葉系細胞を、2ミリリットルのトリプシンとEDTAを併用した80%コンフルエント培養物から37°Cで3分間分離します。

数分後、4ミリリットルの完全培地でトリプシンを中和し、遠心分離により細胞を回収します。ペレットを5ミリリットルの無血清培地中に1ミリリットルあたり10〜6細胞の濃度で1回再懸濁します。そして、50マイクロリットルのDiD細胞標識溶液で細胞を37°Cで50分間標識します。

インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を回収し、洗浄ごとに5ミリリットルのPBSで2回洗浄します。最後の遠心分離後、PBS濃度100マイクロリットルあたり細胞を10〜6番目の生存細胞の2.5倍に希釈し、26ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器に細胞をロードします。次に、関節部を露出させた最初の実験動物の関節炎の膝を剃り直し、露出した皮膚を70%エタノールで消毒します。

膝蓋靭帯の内側、内側大腿顆、内側脛骨顆が形成する三角形の中心に標識細胞を注入し、イメージングソフトウェアを開きます。in vivo生物発光イメージングシステムを初期化し、イメージングシステムの中央ステージ内で動物を仰臥位に配置します。チャンバーのドアを閉めた状態で、蛍光ボックスをチェックし、適切な励起蛍光フィルターセットと蛍光フィルターセットを選択します。

視野を D、ピクセルの曲げを 8、F ストップを 2、露光時間を自動に設定します。画像を取得した後、動物が完全に回復するまで監視しながら、ヒートパッドで回復させます。次に、適切な画像解析ソフトウェアで、蛍光の測定のための放射効率の単位と解析の対象領域を選択し、各画像からの蛍光シグナルを定量化します。

この代表的な実験では、変形性膝関節症を誘発したラットの膝関節の連続切片を、手術の8週間後にH&EとサフラニンO / Fast Green染色によって評価しました。関節軟骨の厚さは、H&E染色切片で観察されるように、手術を伴わない反対側の関節よりも関節炎の膝の方が薄い。さらに、サフラニンO / Fast Green染色によって視覚化されるように、関節炎関節ではプロテオグリカンが減少し、フィブリル化コラーゲンが増加します。

染色の1時間後、DiD標識ヒト脂肪由来間葉系細胞は、in vitroで丸い形状を示します。24時間後、培養したDiD標識間葉系細胞は長い紡錘形を示し、DiDが細胞の接着能力を変化させないことが確認されました。手術の8週間後に変形性関節症動物の膝を画像化すると、注射後0日目から70日目までDiD標識細胞の存在が明らかになります。

その開発後、この技術は、幹細胞治療分野の研究者が、動物の変形性膝関節症の治療のための間葉系幹細胞の安全で実行可能な注射のための最適なルーチンと投与量を決定する道を開きました。このビデオを見た後、外科的に誘導されたラットKOAモデルでの注射およびin vivo追跡のために、ヒト間葉系幹細胞をDiDで標識する方法を十分に理解しているはずです。