人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

この方法の全体的な目標は、多能性幹細胞の分化を均質な層の網膜色素上皮細胞に効果的に導くことです。この方法は、網膜がどのように発達するか、幹細胞疾患モデルをどのように確立するかなど、網膜および眼の研究の分野における質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、自発的な方法よりも高速で効率的であることです。

この方法は、成長因子と低分子の組み合わせを使用して、幹細胞の分化を14日で未成熟RPEに、3か月後に成熟機能RPEになるように指示します。手順の一部を実演するのは、カリフォルニア大学サンタバーバラ校の幹細胞生物学および工学研究所の副所長であるキャシディ・アーノルドです。この手順を開始するには、フィーダーフリー、無血清の条件で幹細胞コロニーを約80%のコンフルエンスまで増殖させてから、継代します。

次に、メーカーの推奨に従って12ウェルプレートを細胞外マトリックスベースのハイドロゲルでコーティングし、室温で1時間、または摂氏4度で一晩硬化させます。その後、ゼロ日目に必要なカルシウムやマグネシウムを含まない網膜分化培地とPBSの量を分量し、水浴で摂氏37度に温めます。次に、温めたRDMに成長因子を追加し、EDTAを室温に戻します。

必要に応じて、分化のために継代する幹細胞から、形態に基づくP10ピペットチップを使用して、分化したコロニーをすべて除去します。コロニー間の線維芽細胞細胞とコロニー内の不透明な細胞は、除去する分化細胞を示しています。細胞の手動除去は、完全に未分化の幹細胞集団から始めることで、より効率的な濃縮が可能になるため、プロトコルの最も重要なステップの1つです。

次に、幹細胞から培地を吸引し、予熱したPBSの2ミリリットルでウェルを1回洗浄することにより、6ウェルプレートの1ウェルを12ウェルプレートの4ウェルに継代します。その後、PBSを吸引し、ウェルごとに1ミリリットルのEDTAで各ウェルを3回すすぎます。次に、プレートをゆっくりと傾けて、EDTAを吸引します。

細胞が時期尚早に持ち上げられるのを避けるために、プレートを攪拌しないでください。3回目の洗浄後、再度1ミリリットルのEDTAを加え、プレートをフード内で室温で3〜5分間インキュベートします。このインキュベーション中にプレートを乱さないでください。

その後、EDTAを吸引し、着座するウェルごとに1ミリリットルのRDMに加えて、0.5ミリリットルの追加の培地を追加します。例えば、6ウェルプレートの1ウェルを4.5ミリリットルのRDMで洗浄し、12ウェルプレートの4ウェルにプレートします。次に、セルスクレーパーを使用して細胞を静かに剥離します。

ウェル内で5回ピペッティングしてRDMの細胞を粉砕し、このステップを迅速に完了してプレートへの再付着を防ぎます。円錐形のチューブに入れます。細胞の大きな塊を解離しますが、単一細胞懸濁液に三分化しません。

細胞をピペットに均等に分散させ、プレートへの再付着を防ぐためにこの手順を迅速に完了します。必要に応じて、光学顕微鏡を使用して細胞凝集体のサイズを観察します。続いて、ECMコーティングされた12ウェルプレートに細胞を播種します。

プレートを前後に傾けて細胞をウェル全体に均等に分散させ、次の培地交換まで摂氏37度、CO2濃度5%の細胞培養インキュベーターに入れます。この手順では、メーカーの推奨に従って、成長因子低減ECMで6ウェルプレートをコーティングします。室温で1時間、摂氏4度で一晩置いておきましょう。

次に、濃縮井戸ごとに必要な量のDPBSと1ミリリットルのRDMを分注し、水浴で摂氏37度に温めます。トリプシン様酵素を室温に持ってきて、必要な量のRPE支持媒体を摂氏37度まで温めます。その後、RSMに抗菌試薬とROCK阻害剤を添加して、0.5倍の抗菌剤と10マイクロモルのROCK阻害剤の最終濃度を達成します。

愛着を向上させるために、最初の4〜7日間はこの媒体を使用してください。次に、すべてのウェルから使用済み培地を吸引し、成長因子を含まない予熱したRDMのウェルごとに1ミリリットルを追加します。必要に応じて、P10ピペットチップを使用して、解剖顕微鏡下ですべての非RPE細胞を解剖し、こすり落とします。

解剖後、RDMとすべての細胞破片を吸引し、ウェルごとに1ミリリットルの予熱したDPBSで2回洗浄します。続いて、12ウェルプレートのウェルあたり0.5ミリリットルのTDEを添加し、摂氏37度で5分間インキュベートします。その後、セルスクレーパーを使用して、プレートから細胞を静かに取り除きます。

ピペッティングで3〜4回ピペッティングして細胞酵素懸濁液を穏やかに粉砕し、均一な懸濁液を作成します。次に、ROCK阻害剤を含まない予熱したRSMで細胞酵素懸濁液を1対10の比率で希釈します。細胞懸濁液を173gで室温で5分間遠心分離します。

5分後、細胞ペレットから培地を吸引し、10マイクロモルのROCK阻害剤を使用してRSMに細胞を再懸濁します。次に、40μmの細孔を持つナイロンメッシュのセルストレーナーを使用して細胞を濾します。血球計算盤を使用して細胞の数をカウントし、濾過溶液中の細胞の濃度を計算します。

その後、成長因子を減少させた細胞に、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加したRSMの4ミリリットルで1平方センチメートルあたり5細胞に10回10のECM被覆プレートを播種する。細胞播種から48時間後にRSMを10マイクロモルのROCK阻害剤に交換し、3〜4日ごとに培地を交換し続けます。4〜7日後にRSMへのROCK阻害剤の追加を中止します。

細胞を摂氏37度、CO2 5%で28〜35日間成熟させ、RSMを3〜4日ごとに交換し続けます。ここに示されているのは、分化のための継代直前の人工多能性幹細胞です。幹細胞は小さく、コロニー内に密集しており、コロニー間の線維芽細胞やコロニー内の不透明な継ぎ道などの分化した細胞を含んでいないようです。

これが2日目の未成熟RPE細胞です。この段階では、セルはまだサブコンフルエントであり、セル間の空きスペースに投影が拡張されている必要があります。これらの細胞は、14日目に濃縮物を除去するために選択する前にあります。

非RPE細胞は、パッチまたは不透明なリボンとして表示されます。丸いパッチには線維芽細胞の形態を持つ細胞が含まれていますが、不透明なパッチは神経網膜であると考えられています。これらの画像は、30日目の通過0、1、および3のRPEを示しています。

各継代で、細胞はコンフルエントであり、位相の明るい境界と多角形の形状を含む網膜色素上皮形態の特徴を持っているように見えます。一度習得すると、継代および濃縮技術は、細胞培養の規模にもよりますが、1〜2時間で完了することができます。この手順に続いて、遺伝子やタンパク質の定量化や機能アッセイなどの技術を使用して、RPEが成長因子やファゴサイトース外部セグメントを分泌する能力に関する疑問に答えることができます。

2013年にDave Buchholz氏と2015年にLindsay Leach氏が発表した論文では、この手法の開発と最適化について詳しく説明しています。私たちは、この分野の研究者がすぐに利用できるように、手順の各ステップの詳細かつ徹底的なデモンストレーションを提供しました。楽しい実験。