Name: 人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学ぶ 多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞への迅速な誘導分化法。成長因子と低分子化合物を用いて14日で未成熟RPE、3か月で機能的な成熟細胞を得られます。網膜疾患モデル構築に有用です。

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この作品は、生薬 (CIRM; TG2 01151、FA1 00616 TB1 01177 CL1 00521 DR1 01444 の補助金)、バーモント州コミュニティ財団、財団ブローのビジョン、カリフォルニア工科大学のガーランド イニシアチブによって支えられたと、財団失明ウィン ・ ガンド橋渡し研究加速プログラムとの戦い。

1 プロトコルの日 14 日 0 の試薬の準備 <ol><li>次のメディア コンポーネントの準備: 100 x N2 サプリメント、2 mL の 1 mL を追加することによって <ol><li>網膜の分化の作る 100 mL 中 (RDM)。50 x B27 サプリメント、ダルベッコの 96 mL に非必須アミノ酸 (NEAA) x 100 の 1 mL &#39; s 変更必須培地/栄養混合物 F12 9 (DMEM/F12).</li>
		1 M ニコチン酸アミド (NIC) 8 mL の滅菌水、ボルテックス、ボリュームを 10 mL の滅菌水にもたらすに NIC の溶解 1.221 g の <li>を作る 10 mL。無菌フィルター ソリューションです</li>。
	</ol></li> <li>次成長因子および小さい分子の準備: <ol><li>西川遺伝子組換えマウスの頭、人間 dickkopf WNT シグナル伝達経路阻害剤 1 (デンマーク クローネ-1) と 100 μ g/ml ごとに 0.1% ウシ血清アルブミン IGF-1(BSA) リン酸緩衝液 (PBS) で。必要に応じての約数と最大 3 カ月の-20 ° C でストア</li>。
		<li>は、10 μ G/ml と組換えヒト ・ マウス ・ ラット アクチビン A 100 μ g/ml 各に PBS で 0.1 %bsa に FGF basic を再構成します。必要に応じて因数と 1 年間-80 ° c ストア</li>。
		<li>再構成 SU 5402 (FGF 受容体のチロシンキナーゼ阻害剤) と CHIR99021 (グリコーゲン合成酵素キナーゼ 3、GSK-3 β 阻害剤) ジメチルスルホキシド (DMSO) で 10 mm。約数と最大 1 年間または 6 ヶ月の-20 ° C でストアそれぞれ</li>。
	</ol></li> <li>0 日目や日 14:1 x ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA) 溶液 (0.2 g PBS の 1 L あたり EDTA)-/- 1x PBS の次を取得 (カルシウムやマグネシウム、pH 7.4 PBS)、1 x 解離トリプシン様酵素 (TDE) DPBS (ダルベッコ &#39; s PBS)、Y-27632 (RSM)、中小企業を支援する RPE 二塩酸塩 (10 μ M で使用します).</li>
</ol> 2。: 日 0 分化多能性幹細胞の通路の 継前におよそ 80% 合流するフィーダー フリー、無血清条件 <ol><li>成長幹細胞コロニー 。
	注: この手順の最適化に関する詳細については議論を参照してください</li>。
	<li>は、メーカーの推奨事項に従って細胞外マトリックスによるハイドロゲル (ECMH) と 12 ウェル プレートをコートします。4、または一晩室温で 1 時間を設定できるように ° C</li>
	<li>因数 RDM と PBS-/- 成長因子を追加する前に 0、37 ° c の水浴は暖かい日の必要量。部屋の温度に EDTA をもたらすします</li>。
	<li>は、暖められた RDM 10 mM NIC、50 ng/mL 頭、10 ng/mL デンマーク クローネ-1 および 10 ng/mL IGF-1 の 0 日の必要な成長因子を追加します。手順 1.2 株から RDM の 10 mL に NIC の 100 μ L、5 μ l の頭のデンマーク クローネ-1 の 1 μ L、IGF-1 の 1 μ L を追加します</li>。
	<li>は、差別化のため継代するが幹細胞からの形態に基づいてすべての差別化された植民地を削除する選択します。P10 ピペット先端部を使って、分化した細胞を手動で削除します 。
	注: コロニーとコロニー内で不透明な細胞間の線維芽細胞は、分化した細胞を削除するを示します。分化した細胞の詳細についての議論を参照してください</li>。
	<li>12 ウェル プレート (1:4) の 4 の井戸に 6 ウェル プレートの単一の井戸を通路 。
	注: この段階で幹細胞を継詳細についての議論を参照します。
	<ol><li>幹細胞から幹細胞の培地を吸引し、予め温めておいた PBS-/- の 2 mL で一度洗浄します</li>。
		<li>吸引 PBS-/- と各 3 回も EDTA 6 ウェル プレートのウェルあたり 1 mL でリンスします</li>。
		<li>は軽くプレートを傾け、EDTA を吸引します。途中でセルを持ち上げることを避ける方法でプレートを揺り動かしてはいけない</li>。
		<li>第 3 洗浄後 EDTA の 1 mL を追加し、3-5 分のためのフードに室温で孵化させなさい。この潜伏中にプレートを邪魔しないでください</li>。
		<li>は、EDTA を吸引し、余分な媒体の 0.5 mL とシードがよくあたり RDM の 1 mL を追加します。たとえば、4 の井戸 12 ウェル プレートにプレートに RDM の 4.5 ml 6 ウェル プレートの 1 を洗うです</li>。
		<li>は、注意深く取り外しますセルにセル スクレーパーを使用します。円錐管のすべてのセルを収集し、上下に 5 回ピペッティングによる RDM のセルをカップ刻んだ。細胞の大きな塊を解離がない単一細胞懸濁液をカップ刻んだか。均等にピペットで細胞を配布します。プレートへの再付着を防ぐためにすぐにこの手順を完了します</li>。
		<li>細胞外マトリックス コート 12 ウェル プレート (ウェルあたり細胞懸濁液の 1 mL) のセルをシードします</li>。
		<li>プレートを井戸全体に均等に細胞を配布する前後に傾け。次の媒体の変更まで 37 ° C、5% CO 2 で細胞文化のインキュベーターをそっと置きします</li>。
		<li>では、正確な時間を注意してください。毎日同じ時刻に変更中です</li>。
	</ol></li></ol> 3。1 に 14 日目: 成長因子添加 <ol><li>日 1: すべての井戸 (ウェルあたり 1 mL) に媒体を変更 (手順 2.4 参照) 0 日目の成長因子配合で RDM を使用します</li>。
	<li>日 2: 10 ng/mL IGF-1、10 ng/mL デンマーク クローネ-1 10 ng/mL 頭 5 ng/mL FGF basic RDM (ウェルあたり 1 mL) 10 mm NIC を使用してメディアを変更します。手順 1.2 株から RDM の 10 mL に NIC、FGF basic の 5 μ L、1 μ L の頭の 1 μ L の DKK1、IGF1 の 1 μ L の 100 μ L を追加します</li>。
	<li>日 4: 100 ng/mL アクチビン A, 10 ng/mL デンマーク クローネ-1 10 ng/mL IGF-1 と RDM (ウェルあたり 1 mL) を使用してメディアを変更します。手順 1.2 株から RDM の 10 mL にアクチビン A、1 μ L の DKK1、IGF-1 の 1 μ L の 10 μ L を追加します 。
	注意: この段階で細胞が合流するに従ってください</li>。
	<li>日 6: 5402 100 ng/mL アクチビン A と 10 μ M SU RDM (ウェルあたり 1 mL) を使用してメディアを変更します。手順 1.2 株からアクチビン A の 10 μ L と SU の 10 μ L の RDM 5402 に 10 mL を追加します</li>。
	<li>日 12、10、8: 3 μ M、10 μ M SU 5402、100 ng/mL アクチビン A RDM (ウェルあたり 1 mL) を使用してメディアを変更 CHIR99021。手順 1.2 株から RDM の 10 mL にアクチビン A、SU 5402 10 μ CHIR99021 の 3 μ L の 10 μ L を追加します</li>。
</ol> 4。日の濃縮の RPE の通過 0 <ol><li>コート成長因子 6 ウェル プレートは、製造元の推奨事項に従って ECMH を削減します。4、または一晩室温で 1 時間を設定できるように ° C</li>
	<li>因数 DPBS 必要のボリュームと RDM の濃縮と 37 に水浴の暖かい井戸ごとに 1 ミリリットル ° C. 持参部屋の温度と暖かい必要なボリュームに RSM、抗菌剤、Y-27632 の 37 に TDE ° C</li>
	<li>追加抗菌試薬と Y-27632 0.5 倍と RSM をそれぞれ 10 μ M の組成を得るします。最初の 4-7 日添付ファイルを改善するためにこのメディアを使用します</li>。
	<li>すべてから培地を使った吸引井戸し、予め温めておいた RDM (成長因子は必要) の井戸あたり 1 mL を追加します</li>。
	<li>解剖顕微鏡を使用して、手動で分析し、P10 のピペット チップを使用してすべての非網膜色素上皮細胞を削りします 。
	メモ: は、代表的な結果については、例を参照してください</li>。
	<li>郭清後、吸引 RDM とすべてのセルの残骸。予め温めておいた DPBS ウェルあたりの 1 つの mL で 2 回洗浄します</li>。
	<li>は、TDE 12 ウェル プレートのウェルあたり 0.5 mL を加えるし、5 分優しくプレートからセルを削除する使用細胞スクレーパーの 37 ° C で孵化させなさい。優しく上下に 3-4 回をピペッティングにより細胞/TDE サスペンションをカップ刻んだ P1000 ピペットを使用して均一な懸濁液を作成します</li>。
	<li>は 1:10 Y-27632 せず、予め温めておいた RSM でセル/TDE の懸濁液を希釈します。室温で 5 分間 173 x g で細胞を懸濁液を遠心します</li>。
	<li>細胞ペレットから培地を吸引し、RSM で 10 μ m の細胞を再懸濁します Y-27632 (1 mL あたり濃縮井戸).</li>
	<li>は、40 μ m の孔を持つナイロン メッシュの携帯ストレーナを使用してセルを痛めます。診断を使用して、指定したボリュームのセルの数を数えるし、緊張したソリューション内のセルの濃度を計算します</li>。
	<li>シード細胞成長因子の減少 1 × 10 5 セル/cm 2 4 mL RSM の 10 μ m で細胞外マトリックス コート プレート Y-27632</li>。
	<li>は、10 μ m、RSM を置き換える Y-27632 細胞播種後 48 時間ごとに 3-4 日 (例えば 月曜日と木曜日) メディアの交換を続けると。10 μ M を交換しないでください 4-7 日後 Y-27632</li>。
	<li>は、37 ° C および 5% の CO 2 の 28 から 35 日で成熟するセルを許可します。RSM を交換して 3-4 日おき (例えば 月曜日と木曜日) 続けます</li>。
</ol> 5。成熟: 通路 1 と RPE の 2 注: かっこで示されているように、ボリュームは 1 6 ウェル プレートや T75 フラスコのよく示されます。
<ol><li>0 の通路の 28 に 35 日間コートの製造元の推奨事項に従って ECMH と 6 ウェル プレート (T75 フラスコ).</li>
	<li>因数 DPBS と RSM 必要と 37 に水浴の暖かいボリューム部屋の温度 ° c. をもたらす TDE</li>。
	<li>吸引井戸から媒体および洗浄の各も二度と一緒に過ごした 2 mL (10 mL) に予め温めておいた DPBS 。
	注: は、10 μ M を使用しないでください Y-27632</li>。
	<li>吸引 DPBS TDE の 1 mL (5 mL) を追加。5 分で 37 ° C、5% CO 2 インキュベーターに配置します。インキュベーション後、セルを確認する倒立顕微鏡上のビューのセルを契約およびデタッチします</li>。
	<li>井戸やフラスコの底から細胞を取り除く適切に大きさで分類された細胞スクレーパーを使用して優しく</li>。
	<li>P1000 tip (10 mL の血清ピペット) を使用して優しくカップ刻んだセル/TDE サスペンション上下に 3-4 回に均一な懸濁液を作成します</li>。
	<li>は、細胞懸濁液 1:10 RSM で希釈します。まあ/フラスコを洗浄し、希薄化後の細胞懸濁液を加える RSM の 2 mL (5 mL) を予約します 。
	注: こと酵素露光時間 25 分を超えることはできません</li>
	<li>室温で 5 分間 173 x g で細胞懸濁液を遠心します</li>。
	<li>細胞ペレットから培地を吸引し RSM の 1 mL (5 mL) に細胞を再懸濁します</li>
	<li>は、40 μ m の孔を持つナイロン メッシュの携帯ストレーナを使用してセルを痛めます。診断を使用して、指定したボリュームのセルの数を数えるし、緊張したソリューション内のセルの濃度を計算します</li>。
	<li>種子 1 x 10-5 セル/cm 2 RSM の 4 mL (15 mL) ECMH コーティング プレート上のセル</li>。
	<li>は、30 日間成熟するセルを許可します。RSM を変更するごとに 3-4 日間続ける</li>。
	<li>2 に 1 の通路から細胞を通路に 30 日 (ステップ 5.2 5.11) の上記の手順を繰り返します</li>。
</ol> 6。中間の細胞バンクの作成: 凍結の通路 2 日 3-5 RPE 注: 10mj/cm ^2 (50%)、顔料を取り戻していない間に細胞を凍結します。
<ol><li>3 × 10 6 セル/mL の濃度で細胞を再懸濁しますに必要な 10 %dmso を凍結保存培地量を計算するセルの数に基づいて、.</li>
	<li>手順 5.2 に 5.8。3 x 10 6 セル/mL に 10 %dmso を凍結保存培地で細胞ペレットを再懸濁します、1.2 mL セラム チューブに細胞懸濁液の 1 mL を転送します</li>。
	<li>は-1 ° C/分で冷却し、一晩-80 ° C で設計された冷凍コンテナーにセラム チューブを配置します。長期保存用液体窒素に転送します 。
	注: これらの細胞は、融解時に通路 3 になります。評価の前に 30 日以上の培養します。シード通過 1.5 x 10 で 3 網膜色素上皮融解時に cm 2 あたり 5。 2, 4, 6, 7</li></ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
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</ol>

博士クレッグは再生パッチの技術 LLC の共同創設者です。

このプロトコルでは、多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞を生成する方法について説明します。メソッドはフィーダー フリー、無血清培養法から両方人間の胚および誘導多能性幹細胞を使用して最適化されていました。1998 年にヒトの胚性幹細胞の初期の分離、2007 年に誘導多能性幹細胞 (iPSC) の導出方法がされている幹細胞文化の多数開発14,15,16、 17。これらのメソッドは、この分化に影響を受けている幹細胞コロニーを生成するために十分なはずです。適切に派生し、維持された多能性幹細胞にこのメソッドの適用性への既知の制限があります。
最も重要な手順は、幹細胞の分化 (ステップ 2.5) の 0 日目へのプロセス (手順 4.5) の 14 日で手動の郭清の必要性継です。幹細胞のコロニーから分化した細胞を削除するを選択、ケントの18の画像を参照します。示されるように、コロニーとコロニー内で不透明な細胞と線維芽細胞は分化した細胞はこのプロトコル18を開始する前に削除する必要があるを示します。定義されたエッジを持つ未分化、堅く詰められたコロニーだけは、差別化のため継代する必要があります。
幹細胞/ウェル (ステップ 2.6.7) シードの数は幹細胞通過時に単一細胞懸濁液に物できない診断を使用して正確に数えることができないという事実によって複雑になります。80% コンフルエントの細胞の近似 6 ウェル プレートの継 1 12 ウェル プレートの 4 井戸に適応があります。成長率などの幹細胞ラインの違いは、どのように迅速に未熟な網膜色素上皮に到達 0 に 4 日間合流に及ぼします。幹細胞は正確な合流点に関係なく RPE を生成しますが、この段階であまりにもスパース セルになる場合に、細胞収率は否定的影響を。未熟な網膜色素上皮細胞は、1 日目でほぼ 100% 合流 4 日目で約 40-50% の合流をする必要があります。セルは、4 または 6 日コンフルエント単層を生産されていません、プロトコルは 0 日で, 播種密度が高いで繰り返してください。たとえば、6 ウェル プレートの 1 は 0 日目で 12 ウェル プレートの 4 の井戸に継代、未熟な網膜色素上皮が 4 日目で 100% 合流、日 0 1:3、1:2 通路にシードを減らすかより合流になる幹細胞を許可します。前継。複数のセルの行を比較するときに一貫した播種密度を確立する重要です。
14 日で手動の解剖手順は、非網膜色素上皮細胞が文化 (図 2) に存在する場合にのみ必要です。プロトコル CHIR99021 のに加えて、以来多くの多能性幹細胞ラインほとんどない手動の郭清が必要です。いくつかの準備がある神経のパッチの発症率が高いと、それらのセルを削除することが重要。RPE 通路 3 通過 0 で実行可能な場合は、すべて非網膜色素上皮細胞を削除するための十分な時間を割いて分化プロトコルを繰り返すことは不可能です。これは多くの場合、発生しませんが、それは必要なときに 14 日目に解剖手順を最適化できることに注意してくださいにここに記載されています。
様々 な網膜色素上皮分化プロトコルのコストと同様に培養法、効率、定量化、相違があるし、されている後者の機能の評価は2を徹底的に見直します。我々 はここでの詳細な有効性、適応性、およびセル行4,7,8の広い範囲への適用性のため 14 日方法を好みます。このプロトコルでは凍結保存手順はまた実験でロットごとに変動を回避する将来の使用のための中間細胞バンクの作成の主要な利点を提供します。12 ウェル プレートのだけ 4 井戸、通路 0 6 ウェル プレート、1 と 2 の通路で T75 フラスコに拡大する可能性があります。通路 2 日 3-5、セルはまだ 10mj/cm ^2 して顔料を取り戻していないときに、セルの数千万を凍結し、3 日間 30 通路を指定、成熟 RPE を解凍、RNA 発現、タンパク質発現、成長因子をチェックすることが可能です。分泌、貪食など。最大 13 の通路19の RPE を展開するプロトコルを定めています。
楽しみにして、このメソッドは、iPSC 眼疾患のモデル化と世代 RPE の細胞療法のための役に立つでしょう。IPSC 疾患モデリングに関してこのプロトコルは、現在使用されているラボで CRISPR 修正行同じ患者から非修正コントロールから RPE を生成します。さらに、このプロトコルは、合成基質と細胞療法に必要な優れた製造基準を遵守するために役立つ無料の xeno の条件に適応されます。

網膜色素上皮は色素細胞の単層感光体の重要なサポートを提供します。網膜色素上皮細胞 (RPE) ビジョン、光吸収、栄養とイオン輸送、サイクリング、レチノイドを含む視細胞外節貪食に多数の機能があるし、成長因子の分泌1。RPE とビジョン、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症などの損失の結果の機能に影響を与える網膜ジストロフィーのさまざまながあります。多能性幹細胞から RPE の世代はこれらの目の病気を理解するための研究を促進するかもしれないし、細胞療法2RPE の無制限のソースを提供することができます。実際には、複数の臨床試験は進行中 RPE 由来の多能性幹細胞3を使用しています。
この分化プロトコル ブッフホルツ4によって記述されていた、クレッグ5から以前に公開された方法に基づいていた。プロシージャを模倣塩基性繊維芽細胞成長因子 (FGF-2; インスリン成長因子 (IGF) の操作を介して RPE 運命に向かって未分化の多能性幹細胞を直接に通常体内の発達過程FGF-basic)、成長因子 β (TGF-β) および wnt シグナル経路4,5に変換します。プロトコルは、97.77% ± 0.1% 前色素タンパク質 (ブイデータ) 肯定的な細胞が得られたし、xeno 無料条件6,7に適応されているプロトコル後半 WNT 経路アゴニストの添加により向上します。結果 RPE は、適切な極性で知られている網膜色素上皮成長因子を分泌して、視細胞外側セグメント8の貪食能を遂行する成績証明書および蛋白質レベルでの RPE マーカーを表現するために示されています。このプロトコルより迅速かつ信頼性の高い塩基性繊維芽細胞成長因子8の簡単な除去を伴う分化の「自然な」プロトコルよりもです。さらに、RNA 塩基配列解読 RPE は、このプロトコルを使用して取得したデータを示してより一般的な自発的なアプローチ8を使用して得られたものに似ています。14 日メソッドは、マッツォーニ9 (色素性、偏光、貪食、分裂、多角形)9によって述べられる"5 P の"に合った RPE を生成します。この手順は、複数のラボで再現可能なことを証明して中を近年10、11,12に掲載されているいくつかの追加の分化方法を認めることを願う,13。

<table><tbody><tr><td>SterilGARD III 層流バイオセーフティキャビネット</td><td>ベイカー</td><td>モデル:SG603A-HE、タイプ:A2、クラス:2</td><td>6' ベイカー層流バイオセーフティキャビネット</td></tr><tr><td>解剖フード</td><td>Labconco</td><td>モデル3970405</td><td>層流ベンチトップ</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ 1500</td>加熱<td>ステージ</td></tr>エア<tr><td>ジャケット付きCO2インキュベーター</td><td>三洋電機</td><td>MCO-17AIC</td><td>37°Cおよび5% CO2</td></tr><tr><td>倒立位相差顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>名称</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>メディア コンポーネント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>N2サプリメント</td><td>ギブコ</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>ギブコ</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>ギブコ</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>成長因子および試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse noggin</td><td>R&Dシステム</td><td>1967-NG-025</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトDKK-1</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ5439-DK-010</td><td></td></tr><tr><td>組換えIGF-1</td><td>R&Dシステム</td><td>291-G1-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF基本</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト/マウス/ラットアクチビンA</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>SU5402 FGF阻害剤</td><td>サンタクルーズ</td><td>バイオテクノロジーsc-204308</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Substrates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>growth factor reduced ECMH</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>その他の試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X Versene (EDTA)</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS(カルシウム、マグネシウム不使用)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE(トリプシン様解離酵素、TDE)</td><td>Gibco</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 (RPE 支持培地)</td><td>Lonza</td><td>BW04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>12-541-0 (1254)</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>BioLife Solutions</td><td>210102</td><td>凍結保存培地</td></tr><tr><td>1.2 mL Cryogenic Vial</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty (冷凍容器)</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>冷凍容器</td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-2</td><td>抗菌試薬</td></tr><tr><td>名前</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>その他の機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>12ウェル培養プレート</td><td>コーニング</td><td>CLS3516</td><td>分化時に使用されます。</td></tr><tr><td>T75フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430641</td><td>RPEの成熟中に使用されます。</td></tr><tr><td>6ウェル培養プレート</td><td>コーニング</td><td>CLS3513</td><td>RPEの成熟期に使用されます。</td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>Corning</td><td>08-771-1A</td><td>継代中に使用されます。</td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>細胞数を数える前の継代中に使用されます。</td></tr></tbody></table>

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

分化多能性幹細胞の網膜色素上皮細胞 (RPE) を直接する手法について述べる.詳細かつ徹底的なプロトコルを提供する目的は、各ステップを明確に示すことと、分野の研究者が容易に閲覧できるようにします。このプロトコルは、必要最小限のまたは手動の郭清を伴う RPE の均質な層の結果します。ここで紹介した方法のため有効であることが示されている誘導多能性幹細胞 (iPSC) とヒト胚性幹細胞。さらに、長期保管を許可する銀行や中間細胞の凍結保存法について述べる。このプロトコルを使用して生成された RPE は iPSC 皿での疾患モデリングまたは臨床アプリケーションの役に立つかもしれない。

このメソッドは、RPE の均一、色素、および立方単分子膜の生産の結果します。図 1のタイムラインは、図 2に示されている画像に対応します。図 2 aのように、幹細胞のコロニーは定義されたエッジとコロニーとコロニー内で不透明な細胞も線維芽細胞きつくパックされました。図 2 bは、10mj/cm ^2 は、未熟な RPE の表現を提供します。セルは、この段階ですでに合流場合、彼らは分化過程に重要な予測を拡張できません。厳しく 10mj/cm ^2 のセルは単分子層を確立し、タイトな接合、上皮の特徴を形成することができません。この合流点を最適化する方法の詳細については、ディスカッション セクションで概説されます。図 2は、この分化過程中に生じる可能性のある非 RPE の 2 つの最も一般的なタイプの形態を示しています: 神経または線維芽パッチ。定義、芽のようなパッチが管の内径にほぼ半透明に対しこれらの神経のパッチが解剖顕微鏡で特に不透明な表示されることに注意してくださいすることが重要です。それはより簡単に化合物の光学顕微鏡と解剖顕微鏡の両方でそれらを識別するためにエタノール実証ラボ ペンで組織培養プレート上のこれらの領域をマークすることができます。図 2 D-Fを示す特徴的な明るい罫線、石畳の形態、RPE の健全な成熟文化を示す色素沈着。図 3は、位相差顕微鏡および明るいフィールド顕微鏡によって描かれた完全に成熟 RPE の別の外観を表示する高倍率の画像です。通路で 3 日間 30、セルが RNA、貪食2,4,6 や成長因子の分泌蛋白質の表現式を含む以前の出版物に記載されている評価の準備ができて ,7。これらの特徴づけは、これらの画像で表されるセルがだけでなく色素立方、しかしも貪食後分裂と、偏光であることを示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig1.jpg"> 
図 1: します。成長因子添加と網膜色素上皮の成熟のためのタイムライン。成長因子は 0-14 日目から 12 ウェル プレートに追加されます。成熟 RPE 6 ウェル プレートや濃縮の日から 30 日間解凍後 (3 日間 30 の通路) に T75 フラスコで培養しています。矢印を示す酵素細胞継します。(A ~ E) の下のタイムラインが図 2の画像に対応します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig2.jpg"> 
図 2: 代表的な形態と成熟 RPE の合流します。誘導多能性幹細胞分化 (A) の通過の直前に。未熟な RPE 細胞サブコンフルエント日 2 (B) で、14; の日にピックアップを削除する濃縮前に、非 RPE パッチ (白い矢印で示されます) は、パッチまたは不透明な「リボン」(C) として表示されます。RPE 0、1、および 3 日 30 通路 (D、E、およびF)。スケール バー = 200 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig3.jpg"> 
図 3: 3 の通路で RPE を成熟: 日 30位相コントラスト (A) に描かれている立方形態と色素沈着明るいフィールド (B) に描かれています。スケールバー = 50 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルでは、多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞 (RPE) を生成する方法について説明します。メソッドは、分化誘導細胞の未熟な網膜色素上皮に 14 日で成熟し、機能的な RPE 3 ヵ月後に成長因子および小さい分子の組み合わせを使用します。

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

この手法の全般的な目的は、多能性幹細胞を網膜色素上皮細胞へと効果的に分化させ、均一な層を形成させることです。本手法は、網膜の発達機序や幹細胞を用いた疾患モデルの構築方法など、網膜および眼科研究分野における課題の解決に寄与します。この技術の主な利点は、自然分化法よりも迅速かつ効率的であることです。この手法では、成長因子と低分子化合物を組み合わせて、幹細胞を14日間で未熟なRPEに、さらに3か月後に成熟した機能的RPEへと分化誘導します。本手順のデモンストレーションを行うのは、カリフォルニア大学サンタバーバラ校（UC Santa Barbara）の幹細胞生物学・工学研究室の副ディレクターであるCassidy Arnoldです。この手順を開始するには、継代させる前に、フィーダーフリーかつ無血清条件下で幹細胞コロニーを約80%のコンフルエンスまで増殖させてください。次に、メーカーの推奨に従って12ウェルプレートに細胞外マトリックスベースのハイドロゲルをコーティングし、室温で1時間、または4 °Cで一晩静置して固めます。その後、0日目に必要な量の網膜分化培地（RDM）とカルシウムおよびマグネシウム不含PBSを分注し、ウォーターバスで37 °Cに加温します。続いて、加温したRDMに増殖因子を添加し、EDTAを室温に戻します。必要に応じて、分化させるための継代前幹細胞から、形態に基づいて分化したコロニーをP10ピペットチップを用いてすべて除去します。コロニー間の線維芽細胞様細胞およびコロニー内の不透明な細胞は、除去すべき分化細胞であることを示しています。完全に未分化な幹細胞集団から開始することで、より効率的な濃縮が可能になるため、細胞の手動除去はこのプロトコルにおいて最も重要なステップの一つです。次に、6ウェルプレートの1ウェルから12ウェルプレートの4ウェルへ継代します。幹細胞から培地を吸引し、あらかじめ加温したPBS 2 mLでウェルを1回洗浄します。その後、PBSを吸引し、各ウェルを1 mLのEDTAで3回洗浄します。続いて、プレートをゆっくりと傾けてEDTAを吸引します。細胞が早期に剥離するのを防ぐため、プレートをいかなる方法でも揺らさないでください。3回目の洗浄後、EDTAを1 mL再度加え、フード内で室温にて3〜5分間インキュベートします。このインキュベート中はプレートに触れないでください。その後、EDTAを吸引し、播種するウェル1つあたり1 mLのRDMと、さらに0.5 mLの余剰培地を加えます。例えば、12ウェルプレートの4つのウェルに播種する場合、6ウェルプレートの1つのウェルを4.5 mLのRDMで洗浄します。次に、セルスクレーパーを使用して、細胞を穏やかに剥離させます。ウェル内でピペッティングを5回繰り返し、RDM中で細胞をトリチュレーションします。プレートへの再凝着を防ぐため、この操作は迅速に行います。その後、コニカルチューブに移します。細胞の大きな塊は分散させますが、単一細胞懸濁液になるまでトリチュレーションしないでください。細胞をピペット内で均一に分散させ、プレートへの再付着を防ぐため、この操作を迅速に行います。必要に応じて、光学顕微鏡を用いて細胞塊の大きさを観察してください。その後、ECMコーティングした12ウェルプレートに細胞を播種します。プレートを前後に傾けて細胞をウェル全体に均等に分散させ、次回の培地交換まで37°C、5%CO2の細胞培養インキュベーターに置きます。この手順では、メーカーの推奨に従って6ウェルプレートを成長因子低減ECMでコーティングします。室温で1時間、または4°Cで一晩静置して定着させます。次に、濃縮ウェル1つあたりに必要な量のDPBSと1 mLのRDMを分注し、ウォーターバスで37 °Cまで加温します。トリプシン様酵素を室温に戻し、必要な量のRPE支持培地を37 °Cまで加温します。その後、RSMに抗菌剤とROCK阻害剤を添加し、最終濃度が0.5x抗菌剤および10 µM ROCK阻害剤となるように調製します。接着を改善させるため、最初の4〜7日間はこの培地を使用します。次に、すべてのウェルから使用済みの培地を吸引し、成長因子を含まないあらかじめ温めておいたRDMを1ウェルあたり1 mLずつ加えます。必要に応じて、解剖顕微鏡下でP10ピペットチップを用い、RPE以外の細胞をすべて剥離・除去します。解剖後、RDMおよびすべての細胞残渣を吸引し、1ウェルあたり1 mLの予熱したDPBSで2回洗浄します。続いて、12ウェルプレートの1ウェルあたり0.5 mLのTDEを加え、37 °Cで5分間インキュベートします。その後、セルスクレイパーを用いてプレートから細胞を穏やかに回収します。細胞酵素懸濁液をピペッティングで3〜4回緩やかに混和し、均一な懸濁液を作成します。次に、ROCK阻害剤を含まない予め加温したRSMで、細胞酵素懸濁液を1:10の割合で希釈します。この細胞懸濁液を、室温にて173gで5分間遠心分離します。5分後、細胞ペレットから培地を吸引し、10 µMのROCK阻害剤を含むRSMで細胞を再懸濁します。次に、孔径40 µmのナイロンメッシュセルストレーナーを用いて細胞をろ過します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測し、ろ過後の溶液中の細胞濃度を算出します。その後、10 µMのROCK阻害剤を含む4 mLのRSMを用い、細胞を成長因子低減ECMコーティングプレートに1 × 10⁵ cells/cm²の密度で播種します。播種から48時間後にRSMを10 µMのROCK阻害剤を含む新しい培地に交換し、その後は3〜4日ごとに培地交換を継続します。ROCK阻害剤の添加は、4〜7日後に終了します。細胞を37°C、5% CO2の条件下で28～35日間成熟させ、3～4日ごとにRSMを交換し続けます。ここに示されているのは、分化のために継代する直前の誘導多能性幹細胞です。幹細胞は小さく、コロニー内に密に詰まっており、コロニー間やコロニー内部に線維芽細胞のような分化細胞や不透明な領域は見られません。こちらが2日目の未成熟なRPE細胞です。この段階の細胞はまだ亜合流状態で、細胞間の空隙に向かって突起を伸ばしているはずです。これらの細胞は、14日目に濃縮物を取り除くためのピックアップを行う前の状態です。非RPE細胞は、パッチ状または不透明なリボン状に現れます。円形のパッチには線維芽細胞様の形態を持つ細胞が含まれており、不透明なパッチは神経網膜であると考えられています。これらの画像は、30日目の継代0回目、1回目、および3回目のRPEを示しています。継代ごとに、細胞はコンフルエントであり、位相差顕微鏡で明るく見える境界や多角形などの、網膜色素上皮（RPE）形態の特徴を備えている必要があります。習得すれば、継代および濃縮の手技は、細胞培養の規模に応じて1〜2時間で完了できます。本手順に続き、遺伝子やタンパク質の定量、機能解析などの手法を用いることで、RPEの成長因子分泌能や外節の食作用に関する疑問を明らかにすることが可能です。この手法の開発と最適化については、2013年にDave Buchholz氏、2015年にLindsay Leach氏によって発表された論文に詳述されています。本分野の研究者が容易に利用できるよう、手順の各ステップについて詳細かつ徹底的なデモンストレーションを提供します。実験の成功をお祈りします。

rapid-directed-differentiation-retinal-pigment-epithelial-cells-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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