Name: 遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 8 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9マイクロインジェクション法によるアメリカナマズIctalurus punctatusの遺伝子編集。TICAM1とRBL免疫関連遺伝子のノックアウトで検証され、機能ゲノミクス研究に有用な効率的プロトコルを確立する。

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この研究は、米国農務省-NIFA 賞 2015 67015 23488 ロジャー ・ コーンによって賄われていた。著者は博士ロナルド ・ フェルプスのビデオでひなの銘柄選択基準の説明をありがちましょう。Ahmed Elaswad とカリム大同博士研究を資金調達のためワシントン DC のエジプト文化および教育局を感謝したいと思います。

この実験は、魚の遺伝学研究ユニット、e. w. シェル水産総合研究センター、オーバーン大学、アラバマで行われました。この実験で使用されるすべての実験的プロトコルは、実験が開始される前にオーバーン大学機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC-AU) によって承認されました。この実験で使用される材料・機器リストは、材料表で見つけることが。以下に、手順と手続きの準備とアメリカナマズ 1 細胞期胚の図 1に示します。
1. くよくよ銘柄選定と産卵
<ol><li>ひずみまたは関心の遺伝的系統から健全なアメリカナマズひな株式を選択します。アメリカナマズの男性と女性は、良い二次性徴を表わすべきであります。</li>
	<li>よく発達した性器乳頭で自分の体の残りの部分よりも広い広い筋肉ヘッドを持っている男性を選択します。暗い色、瘢痕、領土戦いから傷は、性的な準備の兆候です。自分の体の残りの部分よりも狭く、頭を持って女性を選択し、ソフト、触知可能なバランスのとれた腹部があります。精度と初期処理中に魚を強調を避けるためには、産卵のための準備を検討する前に 2-3 日、女性を餌を停止します。</li>
	<li>魚が慎重に、迅速に処理を実行します。処理のストレスを減らすためには、産卵袋 (32 mm サイズ メッシュ) で魚を押しながら処理女性を必要とするすべての手順を実行します。</li>
	<li>排卵を誘発するホルモン注射の直前に、女性の体重を測定します。</li>
	<li>継続的な水の流れと十分なエアレーション タンクを通過する流れの中の女性と産卵の袋を掛けます。</li>
	<li>無菌、黄体形成ホルモン放出ホルモン アナログ (LHRHa) インプラントの 85 μ g/kg を 14 G 針は注入をロードします。0.9% 滅菌生理食塩注射前に、と注射部位 (背側の筋肉) をすすいでください。45 ° の角度で、注入装置を挿入し、インプラントをリリースします。70% エタノールに浸した綿球で針と注射部位にスワイプを撤回します。</li>
	<li>場所保有物タンクで産卵袋魚は水没、水水面下 15-20 cm。(上記 5 ppm の溶存酸素) 十分な通気と水質が良い高品質卵の排卵のため重要です。</li>
	<li>水の温度を35度時間 (h) の関係を使用してに基づいて排卵時間を予測します。度 h 応答時間ホルモン注射と排卵 (h) 時間を = * 水の温度 (° C)。たとえば、900-1,000 度 h 応答時間の女性目されているホルモン注入時 25 ° C から 36-40 h通常、卵の最初のチェックは、ホルモン投与後約 36 h、4 h の間隔で行われます。</li>
	<li>で排卵をチェックするには、産卵バッグ内側に取り付けられている卵を捜している間水面上産卵袋がフワリします。少なくとも 10 卵を見てこの女性は排卵と手除去のため準備ができていることを示します。</li>
</ol>2. 精子の準備
注: 精子予想される排卵時間前に少数の時間を準備することができます。
<ol><li>麻酔は、精子の運動に悪影響を及ぼすかもしれないので麻酔なしで、頭にパーカッシブな打撃によって男性を安楽死させます。</li>
	<li>小秤量皿に睾丸を収集、任意の組織を削除し、必要に応じて血液を削除する 0.9% 生理食塩水 50 mL で洗浄します。よく発達した精巣は白 villiform 突起が無数に (図 2) です。</li>
	<li>睾丸の重量を決定します。</li>
	<li>精子ソリューションを卵の受精の準備、精巣を鉗子を使用して 100 cm2 100 μ m メッシュのセンターに転送します。精巣精巣中にクラッシュを使用してメッシュを折るし、50 mL のコレクション チューブに精子をフィルターします。これは、親指を経由して、コレクション チューブの縁に対してメッシュ内の精巣に圧力を適用することによって行うことができます。0.9% 食塩を使用して、コレクションの管にメッシュから精子を洗浄します。食塩は、精巣の 10 mL/g まで追加できます。</li>
	<li>精子の濃度、運動性および生存率をチェックしてください。 注: 濃度は希釈容積の分かっている白子の診断で精子細胞をカウントすることによって決定できます。また、分光光度計を使用して白子の光学密度を評価することによって精子密度を推定できます。この方法では 505 nm の波長で吸収は以前精子36の異なる濃度の吸収のために準備されている管理図と比較されます。精子の運動は、精子運動 (運動期間と呼ばれる)37の停止まで精子の活性化からの時間として、顕微鏡下でチェックできます。実行可能な精子無染色まま実行可能なだけの精子細胞を染色トリパン ブルーなど選択的色素を持つ精子を染色して、精子の生存率を決定できます。ただし、マイクロインジェクション手順、これは精巣がよく発達している場合は必要はありません。</li>
	<li>4 ° C で 2.5 ステップから 0.9% 生理食塩水で精子を格納し、準備の後 24 時間以内に使用します。</li>
</ol>3. 卵のコレクションと受精
<ol><li>直径 20 cm のきれいな乾いたパンを産卵に短縮野菜の非常に薄い層を適用します。</li>
	<li>100 ppm の炭酸水素ナトリウムとバッファー tricaine メタン スルホン酸を含んだ麻酔液で女性の場所 (最終的な解決の pH は 7.0 であるべき) 魚は完全に麻酔38まで。 注意: Tricaine メタン スルホン酸刺激吸入、摂取または皮膚を通して吸収される場合があります。</li>
	<li>慎重に、産卵の袋から魚を削除し、麻酔液を洗浄する 0.9% 生理食塩水に浸し。魚は、魚の体表の粘液層の除去を避け、清潔なタオルを使用して完全にオフに乾燥します。</li>
	<li>植物性ショートニングを手剥離中に卵の付着を防ぐために、骨盤のフィンを含む口の周りの領域に適用されます。</li>
	<li>手は、卵巣に穏やかな圧力を適用することによって産卵フライパンに卵をストリップします。良い卵が自由に流れる、色、黄金の黄色、最小限を持ってない塊や血栓 (図 2)。水は珠孔閉鎖を刺激することができます卵と受精する前に水との接触を避けてください。</li>
	<li>マイクロインジェクションの卵を受精させると、200-300 卵を産卵フライパンに転送します。油を塗ったプラスチック植物のラベルは、産卵フライパンに卵を転送するスプーンとして使用できます。精子ソリューション (ステップ 2.5) から卵への 1-2 mL を加え、軽く混ぜます。卵に精子の比率は、約 11,000 精子・卵をする必要があります。</li>
	<li>精子と卵をアクティブに卵に淡水を追加します。少し卵をカバーするために十分な水を追加します。1-2 分で 30 s. 受精が発生するため、そっと卵を旋回します。単一の層で整理される卵を受精させることが重要です。ナマズ卵は、胚の複数の層を microinject が難しく、お互いに準拠します。</li>
	<li>受精卵より淡水を追加でき、10-15 分を強化する卵。</li>
	<li>乾燥を防ぐために、数時間にわたって受精濡れタオルで未受精卵の残りを含んでいる産卵鍋をカバーします。受精をずらして行うことができます、マイクロインジェクションと非注入コントロール胚の 1 つのセル段階の胚の連続供給を確保するため,の 200-300 の卵をすることができます 1 つのバッチが 30-60 分毎を受精するたとえば。卵がそれらを削除する困難にぬれたタオルに付着濡れタオルと卵との接触を避けてください。このプロトコルでは除去した後 2-3 時間以内の受精卵が効率的に microinjected し、いた卵同様の成功は、除去した後すぐに受精します。</li>
</ol>4. 針を引っ張ると読み込み
<ol><li>2 針 (図 3) に 1.0 mm 外径ホウケイ酸ガラスの毛細管を引き出します。いくつかの切開が行われているスポンジの切れ端で紙箱に針を格納します。針を破損しないよう、スポンジの直径が針の幹の長さよりも小さい必要があります。</li>
	<li>鋭いオブジェクトを使用して針の薄領域の小さい部分を分割することにより、針の先端を開きます。また、先端の薄領域を顕微鏡下で鉗子でつまんで針を開きます。</li>
	<li>Cas9 タンパク質と gRNA(s) を混ぜて注射液を準備します。他のタイプの RNA やタンパク質を注射して、同じ手順でこともできます。このプロトコルでは gRNAs はアメリカナマズ免疫関連遺伝子、フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM1) 遺伝子とラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子の 2 つをターゲットに設計されシャーらによると準備します。高品質な Taq ポリメラーゼ32,39を使って。GRNAs のゲノムのターゲットだった 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA TICAM 1 遺伝子 (図 4) 3' と 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' protospacer 隣接するモチーフ (PAM) RBL 遺伝子のエクソン 1 シーケンス下線 (図 6) のため。<ol>
<li>アメリカナマズ ゲノムに対して爆発ガイド RNA ターゲット シーケンスし、潜在的なターゲットを離れてサイトを持たないものを選択します。</li>
		<li>フェノールレッドをカラー gRNA/Cas9 蛋白質は総量の 3 分の 1 をミックスに追加します。</li>
		<li>それぞれの胚は 50 で注入されるヌクレアーゼ フリー水混ぜ gRNA/Cas9 タンパク質の最終濃度を調整 nL 約 2.5 ng gRNA と 7.5 ng Cas9 蛋白質を含みます。使用する前に氷で 10 分間混合物を孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microloader と針の幹に、microloader を挿入する microloader チップ (図 3) を後退しつつゆっくりと混合物を追放して注射針に gRNA/Cas9 混合物の 5-10 μ L をロードします。内部に気泡を引っかけないように。</li>
	<li>マイクロ ピペット ホルダー付ける針とタイトな接続を確保するマイクロマニピュレーターにホルダーを取り付けます。無料の安定した動きを確認します。窒素ボンベを開き、圧力レギュレータを調整するマイクロインジェクションの圧力を適用します。 注: 注入量は、圧力、ニードル絞りの直径および注入の期間によって影響を受けます。鉱物油のドロップに注入を注入するボリュームを決定するには、診断に配置。必要な場合、注入量を増減する圧力、射出と針直径の期間を調整できます。鉱物油は一貫性のあるボリュームを確保するために複数回を挿入します。</li>
</ol>5. ナマズ胚のマイクロインジェクション
<ol><li>植物性クリーン 100 mm ペトリ皿にショートニングの非常に薄い層を適用します。</li>
	<li>油を塗ったプラスチック植物のラベルを使用して、ペトリ皿に受精パンから 50-100 卵を転送し、Holtfreter のソリューション (材料表) とそれらをカバーします。単一のレイヤーにお互いに対して卵を合わせます。この配置は、マイクロインジェクション プロセス中に場所に卵を保持する必要があります。</li>
	<li>卵とペトリ皿を顕微鏡のステージに配置し、片方の手でそれを保持します。単一の滑らかな動きで絨毛膜や卵黄を貫くそれまでは、もう片方の手 (図 3) 針を下げ。針の先端は、注入材料を配信する前に、blastodisc にできるだけ近くする必要があります。<ol>
<li>卵黄に注入材料を提供するペダルを押し下げます。Blastodisc が明確に表示されていない場合は、卵黄内の異なる場所に注入材料を広げることができます。針を挿入し、卵黄の遠端にし、ペダルと針を撤回、卵黄の異なる領域を介して注入材料の普及に同時に行われています。50 nanoliters までに注入することアメリカナマズの卵黄の胚は、しかし、gRNA/Cas9 の蛋白質の量は各遺伝子突然変異率および胚の生存のための32の最良の結果を達成するために最適化する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スムーズに針を撤回、卵を損傷しないようにします。同じ手順で別の卵を注入するシャーレに移動します。これが卵を損傷したり、針を破ると注入プロセス中にペトリ皿の動きを避けてください。破裂またはマイクロインジェクションによる建物損傷の卵を削除します。注入受精後 15-20 分で開始することができますコンティニュ (受精後約 60-90 分) までまだ 1 つのセル段階で胚がいる限りは。</li>
	<li>ドキシサイクリンと40を孵化まで 6-7 日間連続の穏やかな通気が 10 ppm と Holtfreter のソリューションに戻って挿入された胚を配置します。ソリューションを毎日変更し、死胚を削除します。</li>
</ol>6. 突然変異の検出
<ol><li>ランダムに、72 h ポスト受精でいくつか挿入された胚を収集、卵黄を削除およびゲノム DNA を抽出します。コントロールとして 3-5 非注入胚が含まれます。 注: ゲノム DNA は、卵の殻と卵黄素材プロティナーゼ K 消化とエタノール沈殿物32を使用しての除去後胚から抽出することができます。</li>
	<li>ゲノムの各遺伝子は、突然変異が、忠実度の高い Taq ポリメラーゼ32を使用して予想されるの gRNA 対象を並ぶ DNA のセグメントを増幅します。TICAM 1、5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG プライマーの 3' (フォワード) と 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (リバース)、750 を増幅する使用された RBL、5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA プライマーの中 bp 3' (フォワード) と 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (反転) しました。RBL 遺伝子から 375 bp セグメントを増幅します。<ol>
<li>次の PCR の反作用を使用して: 最大 20 μ L PCR グレード水;1 x 高忠実度 MgCl2、0.2 mM dNTP Taq の酵素反応バッファーをミックス、それぞれ同じセット、100-300 ng の DNA と忠実度の高い Taq の酵素ブレンドの単位数として 1.25 の前方および逆のプライマーのための 0.4 μ M。PCR の循環状態を実行: 初期変性 94 ° c 3 分;35 サイクルの変性 94 ° C で 30 s、55 60 ° C で熱処理、TICAM の s と 40 の RBL、72 ° c 1 分/kb; 拡張用10 分のための 72 ° C で最終的な拡張子。</li>
	</ol>
</li>
	<li>精製 PCR の製品、測量変異検出アッセイ、ヘテロデュプレックス易動移動性試金、制限酵素認識部位の損失のシーケンスなどの変異検出法やが、他の変異検出法を用いた変異胚を検出します。ターゲットに適しています。このプロトコルでは、TICAM 1 と RBL 遺伝子の精製 PCR 産物の塩基配列決定と同様、 SapIカット サイト制限酵素の損失のため測量変異検出法を用いた突然変異体の胚を検出します。</li>
	<li>突然変異体の対立遺伝子を識別するために PCR の製品と個々 のコロニーからシーケンス ベクトルをクローンします。提示し、図 4と図 6突然変異体の対立遺伝子は挿入された胚から来た。6 からの PCR の製品の microinjected し、TICAM 1 と 8 を含むシーケンス、RBL 遺伝子の 48 のベクトルの 2 つの個別のチューブ、microinjected 胚の 1 つ、コントロールの胚は、急速に複製のための他と 86 ベクトルの各遺伝子の 3 コントロール胚を集めた各遺伝子の 3 コントロール非注入胚からの反応をシーケンスします。</li>
	<li>別の突然変異体の対立遺伝子を識別するために変異胚からブラストや T コーヒーなど DNA シーケンスの配置ツールを使用して野生型シーケンスのシーケンスを比較します。</li>
</ol>

著者は、利害の対立があるないことを宣言します。

遺伝子ノックアウトを達成するためにチャネル ナマズ胚のための詳しいプロトコルが提示されました。卵黄の CRISPR/Cas9 蛋白質の注入ははるかに簡単、時間を節約、ほとんど遺伝子導入や遺伝子編集魚の一般的な手法である一の細胞胚の blastodisc を microinjecting と比較した場合の広範なトレーニングを必要としません。30,42。 現在のプロトコルはアメリカナマズ TICAM 1 および RBL 遺伝子でオクターリピートの誘起に成功する証明しました。信頼性と効果的な手順は、アメリカナマズに将来遺伝子のノックアウトを生成するための基盤を築きます。プロトコルは、CRISPR/Cas9 システムを使用してチャネル ナマズ ゲノムまたは媒介メダカ tol2 遺伝子導入などのナマズに他の遺伝子技術を適応させるために他の遺伝子を対象とする変更できます。また商業的に重要であると彼らの卵チャネル ナマズ卵より処理に敏感と思われる青ナマズ (I. furcatus) などその他のナマズの種の評価価値が...

マイクロインジェクション、細胞または胚ガラス毛管1を DNA、RNA、タンパク質、および他の高分子などの物質の少量を提供するために使用一般的な検査手法です。インジェクションは、マイクロ、マイクロマニピュレーター、顕微鏡2など特別な機器セットアップを使用して実行されます。手法は、遺伝子を通じて世代遺伝子組み換え、遺伝子ノックアウトおよび遺伝子療法の細胞内構成要素3,4のダイナミクスを理解することを目的とする生物の多くを変更するのには研究者によって使用されています,5。
アメリカナマズ (Ictalurus イシガキダイ) は養殖に最も人気のあるナマズの種とアメリカ合衆国の遊漁船活動。チャネル ナマズの機能ゲノミクスの研究がますます必要あり、アメリカナマズの完全なゲノムの配列ゲノム編集ツール6、7の最近の進歩の有用性を高めます。遺伝子機能の理解だけはナマズ、実施されている研究の充実がないが、ナマズ産業を強化するより効果的な遺伝的改良プログラムにも 。興味の特定の特性の重要な遺伝子を特定すると、遺伝的有利な対立遺伝子を生成するゲノム編集によるナマズ生産を転送する、有害な対立遺伝子を抑制すること、これらの対立遺伝子の選択を改善するために使用できます。遺伝子導入、またはこれらのオプションのいくつかの組み合わせを有利な対立遺伝子。1 つの魚の種から商業的に有益な特性の異なる最高の遺伝子を組み合わせることによって、生産性と収益性魚生産操作8を大幅向上させるでしょう。
遺伝子ノックアウトは、遺伝子機能の生体を研究する直接法です。DNA レベルでの突然変異は、さまざまな世代の効果の研究を容易にする将来の世代に継承されます。異なるゲノム編集ツール開発含む亜鉛指核酸 (ZFNs)、転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs) して定期的に空間短い回文繰り返し/CRISPR 関連タンパク質 9 (CRISPR/Cas9 をクラスター化) システム9,10、11,12。
CRISPR/Cas9 システムから RNA 誘導部位特異的 DNA 胸の谷間5,13魚の遺伝子ノックアウトを含むゲノムの DNA 配列を編集する使用されている強力な効率的なツールです。システムは、ゲノム DNA エンドヌクレアーゼ酵素、Cas9 で対象のシーケンスを決定するガイド RNA (gRNA) で構成されます。ZFNs と TALENs 上のいくつかの利点とのゲノムの任意のシーケンスをターゲットに CRISPR/Cas9 システムを設計することができます: (1) 低コスト (2) 簡単に工学ガイド RNA ターゲット シーケンスに結合した (3) より特定化したターゲットを突然変異 (4)複数のシーケンスが変更されません TALENs とまでの変異の (6) の改善された生殖伝送速度 6-fold ZFNs と TALENs14と比較した場合の遺伝子の同じ時間 (5) 高い突然変異率の異なる gRNA の対象になることができます。 15,16,17,18。
マイクロインジェクションの主な方法として、エレクトロポレーション、電気衝動が胚又は細胞膜の透過性と生体分子19,20の吸収を高めるために適用されます。いくつかの遺伝子導入魚はメダカ (メダカ)、ゼブラフィッシュ (動脈分布)、マスノスケ (オンコルヒュンクス ・ tshawytscha)、アメリカナマズ、鯛 (Sparus sarba) などのエレクトロポレーションを使用して生成された、一般的な鯉 (コイ)21,22,23,24,25,26。
エレクトロポレーションは遺伝子ノックアウトのプラスミド Cas9 の DNA、RNA および蛋白質を提供する使用されています。哺乳類セルの Cas9/gRNA プラスミド DNA Cas9 mRNA/gRNA、および Cas9 タンパク質/gRNA 複合体は、エレクトロポレーションを使用して配信され、突然変異誘発率はほとんどエレクトロポレーション テスト条件27Cas9 蛋白質/gRNA 錯体を用いた最高だった。マボヤ脊索動物 (ユウレイボヤ)、TALENs の構造を表現する複数の遺伝子28のノックアウトを誘発する受精卵に electroporated だった。ZFNs プラスミドの構成要素表現されたアメリカナマズ29黄体形成ホルモンをノックアウトする electroporated。ただし、一度細胞に導入し、プラスミドの構造必要があります RNA に転写、RNA のマイクロインジェクションに比べて突然変異誘発の時間を遅らせる可能性が高い目的の DNA シーケンスをターゲットすることができます前に機能性タンパク質に変換/タンパク質。胚の開発は、遅延変異は注入された創設者のモザイクを増加します。さらに、遺伝子組換え発現はマイクロインジェクション、変異導入効率を下げることで発現レベルを達成する可能性はありません。
細胞にゲノム編集ツールを導入するための手段としてマイクロインジェクション エレクトロポレーションにいくつかの利点があります。ゲノムの分子の編集は、細胞または胚マイクロインジェクション30を確実に導入できます。以下の注入材料が必要です。注入される材料の量を決定するは簡単です。高い突然変異の創始者魚における低モザイクでレートすることができます達成 F1変異の生殖を改善するでしょう。創始者の少ない魚は高い突然変異率のための最初の世代を作り出すために分析される必要があります。エレクトロポレーションで創設者のより多くの魚は、コストが増加分析する必要。ただし、アメリカナマズ microinjected 胚の生存はより多くの胚31,32を注入することによってこれを克服するのに electroporated のものより低い。アメリカナマズ、16 〜 55%、対象遺伝子によって卵黄 microinjected 胚の生存、gRNA/Cas9 蛋白質32の投与量。
ナマズ胚の正規のインジェクションは技術的に難しく、時間がかかり、ただし、迅速かつ効率的な CRISPR/Cas9 蛋白質マイクロインジェクション プロトコルが表示チャネル ナマズ胚のため。このプロトコルでは、1 つの細胞胚の卵黄に CRISPR/Cas9 タンパク質溶液を注入するので以下の時間と専門知識が必要です。受精卵の数百は、1 h (約が発生する最初の細胞分裂に必要な時間) で注入することができます。プロトコルを検証するため、2 つ病感受性関連遺伝子はアメリカナマズ、フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプターの分子 (TICAM1) 遺伝子、ラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子のノックアウトされました。TICAM 1 は、toll 様受容体 (TLR) 3 によって開始されたシグナル伝達経路に関与しています。TICAM 1 チャネル ナマズのE. ictaluri33耐性種、青ナマズのダウンレギュ レートであった細菌愛媛 ictaluri課題、次亢進していた劇的に。RBL は、病菌 columnareカラムナリス病の病原の感染初期で重要な役割を果たしている、急性と堅牢なアップレギュレーションに比べてカラムナリス病感受性チャネル ナマズの緊張で記録された、カラムナリス病耐性株34。

<table><tbody><tr><td>Reproboost インプラント</td><td>Center of Marine Biotechnology</td><td></td> チャネルナ<td>マズの排卵誘発のための黄体形成ホルモン放出ホルモンアナログ (LHRHa)</td></tr><tr><td>TRICAINE-S</td><td>Western Chemical. Inc.</td><td></td><td>ホルモン注射および卵ストリッピング中の親魚の鎮静用。</td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>0.5%, 滅菌フィルター</td></tr>付き <tr><td>実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>213709</td><td>マイクロインジェクション中の卵子の可視化用</td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>ASI-Applied Scientific Instrumentation&nbsp;</td><td>モデルMPPI-3</td><td>胚への注入材料送達用</td></tr><tr><td>マイクロマニピュ</td><td>レーターASI-Applied Scientific Instrumentation&nbsp;</td><td>モデルMM33&nbsp;</td><td>注射針の動きを保持し、制御するため。</td></tr><tr><td>エッペンドルフマイクロローダー</td>エ<td>ッペンドルフ</td><td>5242956.003</td>マイクロ<td>インジェクションニードルに注入液をロードするため。</td></tr><tr><td>縦型ニードルプラー</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 720</td><td>マイクロインジェクション針引っ張り用</td></tr><tr><td>Cas9 protein</td><td>PNA Bio Inc.&nbsp;</td><td>CP01</td><td>Streptococcus pyrogenes由来の組換えCas9タンパク質。</td></tr><tr><td>High FidelityPLUS PCRシステムの拡充</td><td>&nbsp;ロシュ・ダイアグノスティックス社(米国</td><td></td>) <td>gRNA調製に使用するDNAテンプレートのPCRおよび増幅用</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細血管</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td>ック <td>外径1mm(OD)、マイクロインジェクション針の製造用。</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>マイクロインジェクション中に胚を保持するため。</td></tr><tr><td>クリスコ</td><td>J.M. スマッカー・カンパニー</td><td></td><td>産卵皿やシャーレをコーティングするための野菜ショートニング。</td></tr><tr><td>Holtfreterの溶液</td><td>ホームメイド</td><td></td><td>59 mM NaCl、0.67 mM KCl、2.4 mM NaHCO3、0.76 mM CaCl2、1.67 mM MgSO4を使用して、マイクロインジェクションされた胚を孵化までインキュベートします。&nbsp;</td></tr><tr><td>ドキシサイクリンヒクレートUSP(一水和物)</td><td>Letco Medical</td><td>690904</td><td>Holtfreterの溶液に抗生物質を10 ppmに添加して、細菌感染を防ぎます。</td></tr></tbody></table>

遺伝子編集アメリカナマズ、 ictalurus イシガキダイ胚に crispr/cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

アメリカナマズ遺伝子機能を勉強する大きな機会につながる、アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイの完全なゲノムが配列されています。遺伝子ノックアウトは、これらの遺伝子機能の生体を研究に使用されています。クラスター化された定期的に空間短い回文の繰り返し/CRISPR 関連付けられている蛋白質 9 (CRISPR/Cas9) システムは、遺伝子の機能を変更するゲノム DNA 配列を編集するための強力なツールです。従来のアプローチは、マイクロインジェクションによる単一細胞期胚に CRISPR/Cas9 mRNA を導入してきましたが、ナマズの遅く、非能率的なプロセスをすることができますこの。ここでは、CRISPR/Cas9 蛋白質とアメリカナマズ胚のための詳しいプロトコルを説明します。簡潔に、卵子と精子は、収集し、人工受精を実行をだった。受精卵は、Holtfreter のソリューションを含むペトリ皿に移されました。注入量が校正され、ガイド Rna/Cas9 ターゲット フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM 1) 遺伝子とラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子は 1 細胞期胚の卵黄に microinjected いた。オクターリピートされた DNA の配列によって確認された遺伝子ノックアウトに成功しました。これらの突然変異のための予測された蛋白質シーケンス変更フレーム シフトを含めるし、時期尚早停止コドンによる蛋白質を切り捨ています。

マイクロインジェクション プロトコルの効率を示すためには、gRNAs チャネル ナマズ フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM1) 遺伝子とラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子をターゲットに設計された microinjected。
TICAM 1 プール、クローンの PCR の製品からの個々 のコロニーからのベクトルの DNA の配列は、TICAM 1 遺伝子の塩基変異を明らかにしました。突然変異率分析 24 個人で 79% であった。突然変異の例を図 4および図 5に示します。アメリカナマズのシーケンスを符号化 TICAM1 遺伝子の塩基変異の効果予測された蛋白質の長さと野生型のシーケンスと比較してシーケンスは<stro...

CRISPR/Cas9 システムを用いたチャネル ナマズ胚の遺伝子を編集するための簡単かつ効率的なマイクロインジェクション プロトコルが表示されます。このプロトコルでは Rna、ガイドし、Cas9 蛋白質は 1 細胞期胚の卵黄に microinjected いた。このプロトコルは、2 つのチャネル ナマズ免疫関連遺伝子をノックアウトによって検証されています。

遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

チャネルナマズ、Ictalurus punctatus胚へのCRISPR/Cas9タンパク質のマイクロインジェクションによる遺伝子編集。チャネルナマズの標的遺伝子編集のための信頼性と効率的なプロトコールの開発は、機能ゲノミクスの研究に不可欠です。特に、チャネルナマズのゲノムのシーケンシングによってゲノムリソースが濃縮された後。ここでは、チャネルナマズにおけるCRISPR/Cas9ゲノム編集の詳細なプロトコールを紹介します。このプロトコルは、2つのチャネルナマズ免疫関連遺伝子を標的とすることによって開発および検証されています。アダプター分子を含むToll/interleukin-1受容体ドメイン、またはTICAM1遺伝子、およびラムノース結合レクチンまたはRBL遺伝子。すべての手順は、アラバマ州のオーバーン大学にあるEWシェル漁業研究センターの魚遺伝学研究ユニットで行われました。ひなのストックの選択と産卵。編集したい系統または遺伝系統から健康なチャネルナマズの親魚ストックを選択します。チャネルナマズのオスとメスは、良好な二次性徴を示す必要があります。性器乳頭が発達した、体の他の部分よりも幅の広い筋肉質の頭を持つ男性を選択します。領土争いによる暗い色や傷跡も、性的覚悟の表れです。頭が体の他の部分よりも狭く、柔らかく触知可能で丸みを帯びた腹部を持つ女性を選択してください。精度を確保し、初期の取り扱い中に魚にストレスを与えないように、産卵の準備状況を調べる2〜3日前にメスへの給餌を停止します。魚の取り扱いは、取り扱いのストレスを軽減するために、迅速かつ慎重に行う必要があります。雌の取り扱いが必要なすべての手順は、魚が産卵バッグに保持されている間に行う必要があります。ホルモン注射の直前に、女性の体重を取得します。メスが入った産卵バッグは、連続的な水の流れと適切な通気を備えたフロースルータンクに吊るすことができます。黄体形成ホルモン放出ホルモンアナログのキログラムあたり85マイクログラムの14ゲージ針を持つインプランターを無菌的にロードします。LHRHAです。注射前に、注射部位と背側の筋肉組織を0.9%滅菌生理食塩水ですすいでください。.インプランターを45度の角度で挿入し、インプラントを解放します。針を引き出し、70%エタノールに浸した綿で注射部位を拭きます。.魚が水面下15〜20センチメートルの水に完全に浸かるように、産卵バッグを飼育水槽に置きます。溶存酸素の5ppm以上を含む適切な曝気、良好な水質は、高品質の卵子の排卵にとって重要です。度時間関係を使用して、水温に基づいて排卵時間を予測します。通常、卵子の最初のチェックはホルモン注射の約36時間後に行われ、その後4時間間隔で行われます。排卵をチェックするには、バッグの内側に付着している卵を探している間、産卵バッグを水面からそっと持ち上げます。卵子が少なくとも10個くらい見えるとき、この女性は排卵し、手のストリッピングの準備ができています。精子の準備。精子は、予想される排卵時間の数時間前に準備することができます。オスの魚は安楽死させ、精巣は小さな計量皿に集められます。精巣の重量を決定します。ティッシュをすべて取り除き、必要に応じて精巣を0.9%生理食塩水で洗って血液を取り除きます。よく発達した精巣は白く、多くの絨毛状の突起があります。精巣を粉砕し、100ミクロンメッシュを使用して精子をろ過します。0.9%生理食塩水を使用して、メッシュから精子を50ミリリットルのチューブに洗い流します。生理食塩水は、精巣1グラムあたり最大10ミリリットルまで添加できます。精子の濃度を決定します。運動性と生存率を確認してください。ただし、これらの手順では、精巣が十分に発達している場合、これは必要ありません。その後、精子は4°Cで保存でき、調製後24時間以内に使用する必要があります。卵子の収集と受精。直径20センチの清潔な乾いた産卵パンに、野菜ショートニングの非常に薄い層を塗ります。魚が完全に麻酔されるまで、100ppmの緩衝剤であるトリカインメタンスルホン酸と重炭酸ナトリウムを含む麻酔液にメスを置きます。産卵バッグから魚を慎重に取り出し、0.9%生理食塩水に浸して麻酔薬を洗い流します。魚の体表面の粘液層が剥がれないように、清潔なタオルを使用して魚を完全に乾かします。骨盤のヒレを含むベントの周りの領域に野菜のショートニングを適用して、ハンドストリッピング中に卵の付着を示します。卵子を油を塗った産卵皿に手で剥ぎ取り、卵巣に穏やかな圧力をかけます。良い卵は自由に流れ、色は黄金色で、塊や血栓は最小限またはまったくないはずです。受精前に卵子と水との接触を避けると、水はマイクロパイルの閉鎖を刺激する可能性があるためです。マイクロインジェクションのために卵子を受精させるには、油を塗った産卵皿に200〜300個の卵に移します。卵子に1〜2ミリリットルの精子溶液を加え、穏やかに混ぜます。卵子に新鮮な水を加えて、精子と卵子を活性化します。卵をわずかに覆うのに十分な水を追加する必要があります。卵を30秒間静かに渦巻きます。受精は1〜2分で起こるはずです。卵子を単層で受精させることが重要です。ナマズの卵は互いに付着するため、胚の複数の層をマイクロインジェクションするのが困難です。受精卵にさらに真水を加え、卵が10〜15分間固まるのを待ちます。残りの未受精卵は、乾燥を防ぐために濡れたタオルで覆うことができ、数時間かけて受精させることができます。受精はずらして行うことができます。2〜300個の卵子の1バッチを30〜60分ごとに受精させることで、マイクロインジェクション用の1つの細胞段階での胚の連続供給を確保し、非注入胚を制御することができます。針を引っ張ってローディングします。外径1mmのホウケイ酸ガラスキャピラリーを2本の針に引き込みます。針を紙箱に入れ、スポンジでいくつかの切開をします。針が折れないように、スポンジの直径は針の茎の長さよりも小さくする必要があります。その後、鋭利な物体を使用して針の小さな部分を最も細かい領域で折ることにより、針先を開くことができます。あるいは、顕微鏡下で一対の鉗子で先端の最も細い領域をつまむことによって針を開くこともできます。ガイドRNAとCas9タンパク質を混合して注入液を調製します。フェノールレッドは、ガイドRNA Cas9タンパク質ミックスの着色に添加することができ、フェノールレッドは総体積の最大3分の1を占めています。その後、混合物を氷上で10分間インキュベートしてから使用します。マイクロローダーを使用して、ガイドRNA Cas9混合物の5〜10マイクロリットルを注射針にロードします。マイクロローダーをニードルステムに挿入し、マイクロローダーの先端を引っ込めながら混合物をゆっくりと排出します。気泡を内部に閉じ込めないでください。針をマイクロピペットホルダーに取り付け、しっかりと接続します。次に、ホルダーをマイクロマニピュレーターに取り付けます。自由で安定した動きを確保します。窒素ボンベを開き、圧力調整器を調整して、マイクロインジェクションの圧力を加えます。注入の量は、圧力、針の開口部の直径、および注入の持続時間によって影響を受ける可能性があります。注入する量を決定するには、血球計算盤に置いた鉱油の滴に注入します。必要に応じて、圧力と針の直径を調整して、注入量を増減させることができます。鉱油に複数回注入して、一定の量を確保します。ナマズ胚のマイクロインジェクション。100ミリメートルのきれいなペトリ皿に野菜ショートニングの非常に薄い層を適用します。受精皿から50〜100個の卵子をペトリ皿に移し、ホルトフレッター溶液で覆います。卵は単層で互いに整列する必要があります。このアライメントは、マイクロインジェクションプロセス中に卵子を所定の位置に保持する必要があります。卵の入ったペトリ皿を顕微鏡のステージに置き、片手で持ちます。もう一方の手で針を下げ、絨毛膜と卵黄を1回の滑らかな動きで突き刺します。注射材料を送達する前に、針の先端をブラストディスクにできるだけ近づける必要があります。ペダルを踏み込み、注入材料を卵黄に送り込みます。ブラストディスクがはっきりと見えない場合、注入材料は卵黄全体のさまざまな場所に広がる可能性があります。これを行うには、針を卵黄の遠端に挿入します。次に、ペダルを踏み込み、同時に針を引き抜きます。これにより、注入材料が卵黄全体のさまざまな場所に広がります。2.5ナノグラムのガイドRNAと7.5ナノグラムのCas9タンパク質を含む50ナノリットルを問題なく卵黄に注入できます。卵を傷つけないように、針をスムーズに引っ込めます。次に、ペトリ皿を動かして、同じ手順で別の卵を注入します。注入プロセス中のペトリ皿の動きは、卵子を損傷したり針を壊したりする可能性があるため、避けてください。マイクロインジェクションにより破裂または損傷した卵子を取り除きます。注入は受精後15〜20分で開始でき、胚がまだ1つの細胞段階にある限り継続できます。注入された胚は、10 PPMのドキシサイクリンを含むホルトフレッター溶液に戻され、孵化するまで6〜7日間連続的に曝気されます。溶液は毎日交換され、死んだ胚は取り除かれます。業績。この図は、チャネルナマズのTICAM1遺伝子におけるCRISPR/Cas9による突然変異を示しています。青色の配列はプロトスペーサー隣接モチーフまたはPAMを表し、緑色の配列は誘導RNAの標的を表しています。Cas9タンパク質によって誘発される二本鎖切断は、2つの赤い三角形の部位で起こると予想されていました。欠失変異は破線で表され、各ダッシュは削除されたヌクレオチドに対応します。赤色の配列は挿入、紫色は置換変異を表します。78の画分は、78のシーケンシング反応における変異対立遺伝子の数を表します。例えば、3/78は、合計78の反応から3つのシーケンシング反応で対立遺伝子が検出されたことを意味します。突然変異率は、解析した24人で79.2%であった。突然変異により、タンパク質からいくつかのアミノ酸が除去され、下流のリーディングフレームが変化し、翻訳が早期に終了しました。ほとんどの変異では、TICAM1と予測されたタンパク質配列の80%以上が、早期終止コドンのために切断されました。この図は、チャネルナマズのRBL遺伝子におけるCRISPR/Cas9による突然変異を示しています。エクソニックシーケンスは大文字で、イントロニックシーケンスは小文字です。青色の配列はプロトスペーサーに隣接するモチーフを表し、緑色の配列は誘導RNAの標的を表しています。Cas9タンパク質によって誘発される二本鎖切断は、2つの赤い三角形の部位で起こると予想されていました。欠失変異は破線で表され、各破線は削除されたヌクレオチドに対応します。赤いシーケンスは挿入です。40の画分は、40のシーケンシング反応における変異対立遺伝子の数を表します。例えば、2/40は、合計40の反応から2つのシーケンシング反応で対立遺伝子が検出されたことを意味します。突然変異率は、解析対象40人で87.5%であった。欠失は5塩基対から183塩基対の範囲であり、最大20塩基対が挿入されました。インデルの70%以上が、野生型タンパク質の長さより10%以下の切断タンパク質をもたらしました。このビデオでは、1つの細胞チャネルのナマズ胚にCRISPR/Cas9タンパク質をマイクロインジェクションする方法を示しました。説明されている手順は、シンプルで、迅速で、効率的です。そして、2チャネルのナマズ遺伝子の遺伝子ノックアウトに成功しました。TICAM1 と RBL.注射されるものに応じて、プロトコルを変更して他の生物学的に活性な物質を含めることができます。また、他のナマズ種や、卵の構造や組成が類似している他の魚種にマイクロインジェクションするように改変することもできます。

microinjection-crisprcas9-protein-into-channel-catfish-ictalurus

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

トランスジェニック操作およびゲノムの編集は、機能的遺伝子とシス -regulatory要素の役割をテストするために重要です。ここでは、ゲノム（Tol2の媒介蛍光レポーター導入遺伝子構築物を含む、TALENs、およびCRISPRs）の変更を生成するための詳細なマイクロインジェクションプロトコルが緊急モデルの魚のために提示され、イトヨ。...

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

対象となるゲノム編集モデルにおける動脈分布(ゼブラフィッシュ) は、CRISPR ベースのアプローチの出現によって大きく促進されています。ここで、生成・ ヘテロ二本鎖移動性試金が組み込まれたナンセンスの CRISPR 由来の対立遺伝子の同定と次世代シーケンシングによる突然変異の同定の合理化された、堅牢なプロトコルについて述べる.

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進化系アステュアナクス メキシコで遺伝子を操作するためのアプローチについて述べる。3 つの方法を示します: メダカ Tol2 を介した遺伝子導入、CRISPR/Cas9、および morpholinos...

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CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション

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火花のサイレンシング:弱い電気魚のCRISPR/Cas9ゲノム編集

このプロトコルは、CRISPR/Cas9遺伝子編集ツールで動作するように最適化された Culex quinquefasciatus...

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

初期の開発は母性遺伝製品に依存しており、これらの製品の多くの役割は現在不明です。ここでは、CRISPR-Cas9を使用して、単一世代で母性効果表現型を特定するプロトコルについて説明しました。...

母体クリスパントによる初期発生における母体発現遺伝子の役割の決定

このプロトコルは、CRISPR-Cas9技術を使用してゼブラフィッシュ胚の正確なノックイン編集を容易にするアプローチを説明しています。表現型パイプラインは、QT延長症候群関連遺伝子変異をモデル化するためのこれらの技術の適用可能性を実証するために提示される。...

CRISPR-Cas9を介したゼブラフィッシュハートの正確なノックイン編集

接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集

CRISPR-Cas技術は、ゲノム編集の分野に革命をもたらしました。ただし、目的の生殖細胞系列編集を見つけて分離することは、依然として大きなボトルネックです。したがって、このプロトコルは、標準的なPCR、制限消化、およびゲル電気泳動技術を使用して、F0...

ゼブラフィッシュの生殖細胞系列編集の迅速な分離のための精子のスクリーニング

このプロトコルは、遺伝子修正されたラットモデルを生成するための最適化されたアプローチを提示します。アデノ随伴ウイルス(AAV)はDNA修復テンプレートの送達に使用され、エレクトロポレーションはCRISPR-Cas9試薬の送達に使用され、2細胞胚のゲノム編集プロセスを完了します。...

アデノ随伴ウイルス(AAV)と2細胞胚エレクトロポレーションを用いたラット胚のCRISPR-Cas9ゲノム編集

学ぶCRISPR/Cas9マイクロインジェクション法によるアメリカナマズIctalurus punctatusの遺伝子編集。TICAM1とRBL免疫関連遺伝子のノックアウトで検証され、機能ゲノミクス研究に有用な効率的プロトコルを確立する。

遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

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