無菌を緩める CoCrMo 粒子への暴露によるマウス頭蓋骨融解モデルの構築と評価

この手順の全体的な目標は、コバルト-クロム-モリブデンナノ粒子への曝露により、マウスカルバリア骨分解モデルを構築し、評価することです。摩耗粒子誘発性骨溶解は、関節形成術の失敗における無菌緩みの主な原因ですが、これの根本的なメカニズムは不明です。追跡期間が長く、散発的に発生するため、臨床例で無菌緩みの部分形成を調査することは困難です。

したがって、さらなる研究のためには、摩耗動物モデルが必要である。当研究室では、コバルト合金粒子を用いて構築された壁面カルバリアル骨溶解モデルが、無菌緩みの部分形成を研究するための有効なモデルです。これは、最初にコバルト合金プロテーゼからナノスケールのコバルトクロムモリブデン粒子を生成し、それらを1ミリグラムあたり1ミリグラム/ミリリットルの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁することによって達成されます。

次のステップは、2つの目と耳の間の2つの中間点の間の線での切開位置を特定することです。次に、ショック解剖により頭蓋骨膜をカルバリウムから除去します。次に、50マイクロリットルのコバルト合金ナノ粒子ストックを取り、それらをカルバリアの中央縫合糸に埋め込みます。

2週間のメンテナンスの後、数匹のマウスを犠牲にし、骨溶解評価のために頭蓋骨を採取します。骨溶解は、コバルト合金ナノ粒子処理マウスにおいて、マイクロCTおよびHおよびE染色画像の両方で明らかです。コバルト合金プロテーゼからコバルトクロムモリブデン合金を取得し、高真空3電極直流を作製することにより、コバルトクロムモリブデン粒子を得る。

コバルトクロムモリブデン粒子の平均直径を定量化するために、1ミリグラムの粒子を1.5ミリリットルの無水エタノールに取り、超音波振とうによってそれらを懸濁します。透過型電子顕微鏡の対物レンズテーブルに懸濁液の約20マイクロリットルを1滴塗布し、一連の画像を取得します。付属のソフトウェアを使用して、TEM画像の平均直径と粒度分布を計算します。

これは代表的なTEM画像で、左のパネル、右のパネルは、商用ソフトウェアで計算されたコバルトクロムモリブデン合金のナノ粒子サイズの分布を示しています。平均直径は約50ナノメートルです。粒子を15分間オートクレーブしてエンドトキシンを除去します。

次に、それらをストック溶液として15ミリグラム/ミリリットルの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁します。次に、頭蓋骨骨溶解モデルの構築です。生後6週齢のマウスを選択して麻酔する:グループごとに6匹のマウス。

動物をプライムポジションに置きます。毛皮を取り除き、頭蓋の皮膚を75パーセントのエタノールで消毒します。切開の場合は、2つの目と耳の間の2つの中間点をそれぞれ特定し、それらを結ぶ線に沿って皮膚を切開します。

ショック解剖により、頭蓋骨膜を頭蓋骨から慎重に完全に除去します。骨膜の明確な解剖は、頭蓋骨内の粒子間の相互作用を強化します。縫合糸は、単純な中断縫合糸で切開の両端で慎重に行われます。

通常、完全な縫合糸には3針縫う必要があります。最後の段階では、縫合線の両端を保持しながら、結び目を作らずに縫合線を切開部に通します。15マイクロリットルのコバルト合金ストック溶液ナノ粒子を取り、カルバリアの中央縫合糸に埋め込みます。

最後のステッチを単純な中断縫合糸で結びます。マウスをさらに2週間維持します。2週間後、動物を犠牲にし、カルバリアを収穫します。

ピンセットでカルバリアサンプル上のすべての軟組織を優しく透明にし、4°Cの4%パラホルムアルデヒドに組織を接着します。コバルトクロムモリブデンナノ粒子誘起モデルでの骨溶解評価には、マイクロCTスキャンの24時間前に高解像度マイクロCTを実施します。パラホルムアルデヒドからリン酸緩衝生理食塩水でカルバリアサンプルを移します。

マイクロCTスキャンの日には、リン酸緩衝生理食塩水からカルバリア検体を採取し、機器に関連付けられたホルダーに固定します。マイクロCT装置でcalvariaをスキャンします。各種ソフトで立体再構成を行います。

H染色とE染色は、ナノ粒子誘起モデルにおける骨溶解評価のための別のツールです。15%のエヒレンジアミン四酢酸を含むリン酸緩衝生理食塩水でカルバリアサンプルを4°Cで3週間脱石灰します。脱灰したカルバリアをパラフィンに埋め込み、粒子堆積領域で2マイクロメートルのセクションにスライスします。

切片をヘマトキシリンとエオシンで染色します。全体の通過通過を光学顕微鏡で観察し、顕微鏡写真を取得します。代表的なマイクロCT画像をご紹介します。

左パネルにマイクロCTデータの3次元再構成画像を示します。コントロールマウス、シャム操作マウス、ナノ粒子処理マウスの断面画像を右パネルに示します。骨溶解は、ナノ粒子治療グループで明らかです。

これは、機器関連ソフトウェアによるマイクロCT写真の定量分析です。測定値には、骨密度、骨体積、または総体積比、総多孔率の割合、小柱数、小柱の厚さ、および小柱の分離または間隔が含まれます。コバルト合金ナノ粒子で処理されたマウスは、対照動物と比較して、骨ミネラル密度および骨体積が有意に低く、全多孔率の割合が高い

これは、コントロールマウス、偽操作マウス、およびナノ粒子処理マウスのカルバリアサンプルの代表的なHおよびE染色画像です。骨溶解は、ナノ粒子治療グループでも明らかです。コバルト合金ナノ粒子によって構築されたマウス頭蓋骨溶解モデルは、摩耗粒子誘発骨溶解のモデリングにおいて高い成功率を示しています。

以下は、いくつかの重要な要素です。まず、コバルト合金ナノ粒子は、摩耗粒子とカルバリアとの間の相互作用を強化します。第二に、頭蓋骨の適切な曝露と骨膜の明確な解剖により、粒子と頭蓋骨の間の相互作用がより集中的になります。

第三に、マイクロCTによる骨量減少の定量的測定により、さまざまな治療間の骨量減少の違いにアクセスしやすくなり、従来の骨組織形態測定法と比較して骨溶解の確固たる証拠が得られます。コバルト合金粒子によって構築されたウェアカルバリア骨溶解モデルは、無菌緩みにおけるウェア粒子と異なる細胞との間の相互作用を調査するための理想的なモデルです。マイクロファージ、線維芽細胞、破骨細胞、骨芽細胞など。

私たちのモデルが、将来の無菌緩みの研究に役立つことを願っています。