無菌を緩める CoCrMo 粒子への暴露によるマウス頭蓋骨融解モデルの構築と評価

本手順の全体的な目的は、コバルト・クロム・モリブデンナノ粒子への曝露により、マウス頭蓋骨骨溶解モデルを構築し、評価することです。摩耗粒子誘発性骨溶解は、人工関節置換術後の無菌性緩みの主要な原因となりますが、その根底にあるメカニズムは不明確です。臨床例における無菌性緩みの病原性を探究することは、追跡期間が長く、発生が散発的であるため困難です。

したがって、さらなる研究には摩耗動物モデルが必要である。当研究室では、コバルト合金粒子を用いて構築したマウス頭蓋骨溶解モデルが、無菌性弛緩の病態生理を研究するための有効なモデルとなっている。これはまず、コバルト合金製人工関節からナノスケールのコバルト・クロム・モリブデン粒子を生成し、それらを15 mg/mLの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させることで達成される。

次のステップは、両眼の間および両耳の間のそれぞれの中心点を結ぶ線上において、切開位置を特定することです。次に、ショックディセクションにより、頭蓋蓋から頭蓋骨骨膜を除去します。続いて、50 µL のコバルト合金ナノ粒子のストック溶液を採取し、頭蓋蓋の中縫合線に埋入します。

2週間の維持期間後、一部のマウスを犠牲にし、骨溶解能を評価するために頭蓋冠を回収します。コバルト合金ナノ粒子で処理したマウスでは、micro-CTおよびH&E染色像の両方で骨溶解が顕著に認められます。コバルト合金人工関節からコバルトクロムモリブデン合金を入手し、高真空三電極直流法を用いて、コバルトクロムモリブデン合金からコバルトクロムモリブデン粒子を製造します。

コバルトクロムモリブデン粒子の平均粒径を定量するため、1 mgの粒子を1.5 mLの無水エタノールに加え、超音波処理により懸濁させます。この懸濁液を約20 µL（1滴）分、透過型電子顕微鏡（TEM）のステージ上に滴下し、一連の画像を撮影します。提供されたソフトウェアを使用して、TEM画像から平均粒径および粒子径分布を算出します。

左側のパネルに代表的なTEM画像を示し、右側には市販のソフトウェアを用いて算出したコバルト・クロム・モリブデン合金ナノ粒子の粒度分布を示しています。平均粒子径は約50 nanometersです。エンドトキシンを除去するため、粒子を15分間オートクレーブしてください。

その後、ストック溶液として15 mg/mLの濃度になるよう、リン酸緩衝生理食塩水で再懸濁します。次に、頭蓋骨溶骨モデルを作製します。6週齢のマウスを、1群あたり6匹ずつ選択し、麻酔を施します。

動物を適切な位置に固定します。頭蓋骨上の被毛を除去し、75% ethanolで皮膚を消毒します。切開のために、両眼の間と両耳の間の中心点をそれぞれ特定し、それらを結ぶ線に沿って皮膚を切開します。

ショック剥離法により、頭蓋蓋から頭蓋骨膜を慎重に完全に除去します。骨膜を明確に剥離することで、頭蓋蓋内の粒子間の相互作用を高めることができます。切開部の両端は、単純結節縫合を用いて慎重に縫合します。

通常、完全な縫合には3回の縫合が必要です。最終段階では、縫合糸の両端を持ち、結紮せずに切開部を通して縫合糸を通します。15 µLのコバルト合金ストック溶液ナノ粒子を採取し、頭蓋蓋の中央の縫合部に埋め込みます。

単純結節縫合の最後のステッチを結紮します。マウスをさらに2週間飼育します。2週間後、動物を安楽死させ、頭蓋骨を採取します。

ピンセットを用いて、頭蓋骨サンプルの軟組織を慎重に取り除き、4%パラホルムアルデヒドを用いて4°Cで組織を固定します。コバルトクロムモリブデンナノ粒子誘発モデルにおける骨溶解の評価については、micro-CTスキャンの24時間前に高解像度micro-CTを実施します。パラホルムアルデヒドから、頭蓋骨サンプルをリン酸緩衝生理食塩水に移します。

micro-CTスキャンの実施日に、リン酸緩衝生理食塩水から頭蓋冠標本を回収し、装置に付属のホルダーに固定します。micro-CT装置で頭蓋冠をスキャンし、各種ソフトウェアを用いて3次元再構成を行います。

H&E染色は、ナノ粒子誘発モデルにおける骨溶解評価のためのもう一つの手法です。15%のエチレンジアミン四酢酸を含むリン酸緩衝生理食塩水中で、頭蓋骨検体を4°Cで3週間脱灰させます。脱灰した頭蓋骨をパラフィンに埋没させ、粒子が沈着した領域を2 µmの厚さに切片化します。

切片をヘマトキシリン・エオジンで染色します。光学顕微鏡を用いて全体的な形態変化を観察し、顕微鏡写真を撮影します。以下に代表的なマイクロCT画像を示します。

左パネルにmicro-CTデータの3次元再構成画像を示す。右パネルに、コントロール群、擬似手術群、およびナノ粒子投与群のマウスの断面画像を示す。ナノ粒子投与群では骨溶解が顕著である。

以下は、装置付属のソフトウェアによるmicro-CT写真の定量分析です。測定項目には、骨密度、骨量または総体積比、全空隙率、骨梁数、骨梁幅、および骨梁分離度または間隔が含まれます。コバルト合金ナノ粒子で処理したマウスは、対照動物と比較して、骨密度と骨量が有意に低く、全空隙率が高いことが示されています。

以下は、コントロール群、擬似手術群、およびナノ粒子投与群の頭蓋骨サンプルの代表的なH&E染色像です。ナノ粒子投与群においても骨溶解が明確に認められます。コバルト合金ナノ粒子を用いて構築したマウス頭蓋骨骨溶解モデルは、摩耗粒子誘発性骨溶解のモデル構築において高い成功率を示しています。

以下にいくつかの主要な要因を挙げます。第一に、コバルト合金ナノ粒子が摩耗粒子と頭蓋蓋の相互作用を強化します。第二に、頭蓋蓋を十分に露出させ、骨膜を明確に剥離することで、粒子と頭蓋蓋の相互作用がより強固になります。

第三に、micro-CTによる骨損失の定量測定を行うことで、さまざまな治療法間における骨損失の差をより容易に評価することができ、従来の骨組織形態計測と比較して、骨溶解に関する確かな根拠を得ることができます。コバルト合金粒子によって構築された摩耗頭蓋骨骨溶解モデルは、無菌性緩みの過程における摩耗粒子と、マクロファージ、線維芽細胞、破骨細胞、骨芽細胞などのさまざまな細胞との相互作用を調査するための理想的なモデルです。

本モデルが、今後の無菌性弛緩の研究に役立つことを期待しています。