Name: 臓器移植における HLA 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶカスタム抗原アレイ法による臓器移植におけるHLA同種抗体の検出。個別のドナーHLA配列に基づくパーソナライズされた抗原セットを用いて、移植拒絶に関与する免疫エピトープを特定し、移植成績向上への貢献を目指す。

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我々 に感謝夫妻ショーン李とスポットでそのような支援のためにカナダの西部大学の興李アレイ生産。サンプル サービスを提供する組織適合性コア、北西の包括的な移植センターの大学スタッフに感謝しております。この作品は、補助ノースウェスタン メモリアル ボード ホスピタル、JJ にノースウェスタン大学によって提供される学部スタートアップ資金、部分的にサポートされています。

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利害の衝突が宣言されていません。

ここで説明した点配列の設計は alloantibody 移植臓器のドナーの HLA 抗原に対する特異性に関する実験的研究。クリニックで広く使われる既存の SAB アッセイと対照をなして抗原配列方法個々 のドナーの真の HLA シーケンスに対応できる柔軟性のあるデザインの主要な利点があります。新しいプラットフォームをあいまいさ16,27せず正確な HLA allelic シーケンス測定値を生成することが間もなく急速の DNA 解析技術のポテンシャル、指定されたデータベースの潜在的なを悪用します。リポジトリの HLA 系列15世界の人口の。私たちの現在の配列スクリーニングのプロトコルを移植血清のいくつかのパイロット研究の成功をベースに開発されました。ここで我々 はこの段階で、プロトタイプの配列が臨床診断アプリケーションのための研究使用のためにのみ構築されることを強調すべき。
SAB と抗原配列の別の注目すべき違いは、後者が...

世界中で日常的に行われている臓器置換療法は、数百万の命を救っています。固形臓器移植、米国で 100万人あたり約 100 人の患者で発生します毎年、大きい数はまだ待ちでいる臓器 (器官によって提供される情報によると供給の厳しい不足を受信する間調達および移植ネットワーク - OPTN/全米: optn.transplant.hrsa.gov)。臓器移植臓器の廃棄物の削減し、命を救うために規制されて、科学的なツールこれらの規制を通知するために使用は有効性で限られています。例えば、科学界は完全に HLA 分子の非常に多型の状態を認識し、高解像度入力し、シーケンス ベース (SBT) を用いた DNA の正確な遺伝子検査は、近年1,で開発されている2します。 ただし、alloantibody 試験方法がまだできていない抗原プローブとして多様な個々 の HLA のシーケンスを生成します。標準的なテストはこの頃不変のパネルを使用するを構成する HLA の共通の変形の ~ 100 の対立抗原の A、B、C、DQ、DP、DR は人口3,4,5,6シーケンスします。頻繁に実際のドナーの HLA シーケンスに含まれていないテストパネル、移植医師と外科医は、ドナーの実際のシーケンスと対応する「標準」の共有類似性に基づいてドナー固有反応性を推論する強制することで、テストは、7、8を設定します。その結果、信頼性の高い抗体テスト結果9,10、11,12に基づいて拒否リスク見積もりを行うに困難な場合があります。したがって、新しい個人的にカスタマイズのテスト同種抗体が緊急に必要な13,14 です。
HLA 遺伝子は免疫応答6にキー関数がある主要組織適合遺伝子複雑な (MHC) の受容体をエンコードします。HLA 遺伝子ヒトゲノム6の最も多型の遺伝子が知られています。DNA の急速な進歩による HLA 遺伝子、対立遺伝子の新しい亜種のための戦略をシーケンス (または対立遺伝子と単に呼ばれる)、爆発的な速度で15、16が発見されています。2017 年 3 月 16,755 検証された対立遺伝子入金されていた IMGT/HLA データベース (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html) にどの 12,351 のクラスのだったらと 4,404 クラス II グループの。対照的にだけ少し以上 100 の異なる対立遺伝子は臓器移植における同種抗体を検出する使用標準的な単一抗原ビーズ (SAB) のアッセイで表されます。SAB 法はフローサイトメトリーを用いた Luminex プラットフォームに基づいて構築されます。アッセイを利用して生産、マイナーなバッチ変動以外の抗原の不変のセットからは、研究所5の個人間でしっかり抗血清テストを標準化できます。しかし、このテストはドナー シーケンスが不在であるときに特にドナーの対立遺伝子に対する具体的開発すべて同種抗体をキャプチャできません、SAB から設定します。真のシーケンスに基づくドナー抗原のカスタム生産が望ましいが、必要な生産の合理化及び試験手順の技術的な課題が残っています。
最近腎移植科目17のフィージビリティスタディにおける代替方法論について述べる。メソッドは、配列形式の事前調査のペプチド抗原を使用し、被験者の血清、移植後。各アレイは、スポット合成法18,19,20,21,22,23各 15 の抗原ペプチドを生成することを使用して構築されたカスタムされました。アミノ酸の長さは、完全に基づいてそれぞれの臓器ドナーの HLA 対立遺伝子 a、B、C、DQA1、DQB1 DRB1。スポット合成標準 fmoc 保護化学22を使用してセルロース膜で運営され、何百もの完全に自動化されたロボット システム19,21と並行してカスタム ペプチドを作り出すことができます。膜配列は、ストリッピングと reprobing サイクルの複数のラウンドを耐えることができます。私たちの回顧的研究17(すなわち前に、と移植後) 時系列で収集ストアド移植抗血清と抗原パターンの変化を検出します。ここ製造、抗血清の調査と結果分析して配列設計を含むワークフローのプロトコルの技術を説明します。メソッドは、同種移植ドナーの HLA 分子に特定の線形エピトープに対する抗体を検出するため。

<table><tbody><tr><td>ペプチドアレイ</td><td>INTAVIS バイオアナリシス機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>無脂肪乳</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ</td><td>1706404</td><td></td></tr><tr><td>TBST</td><td>サンタクルーズ・バイオテクノロジー</td><td>10711454001</td><td></td></tr><tr><td>ヤギの抗ヒトIgG&ndash;HRP&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A18811</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td><td>Thermo Scientifics</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc gel imaging system</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>1708265&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

臓器移植における hla 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

関数とグラフトの長寿は臓器移植における批判的にひと白血球抗原 (HLA) に対する免疫学的拒絶反応の制御の成功に依存します。適合ガイドラインとして既存のいずれかを示す抗 HLA 免疫の検査に基づいているまたはde novoが主要な移植の障壁を構成する HLA 抗体を生成します。現在のテストは、〜 100 事前に選択された組換え HLA 抗原の固定セットを使って移植血清を調べる単一抗原ビーズ (SAB) プラットフォームに基づいて構築されます。しかし、人間まで多様な HLA 型は、同じ HLA シーケンスの組み合わせを共有することができます一卵性双生児以外ないの 2 人が存在します。HLA タイピングと直接配列の高度な技術は、間ドナーの DNA シーケンスの不整合をキャプチャすることが正確に、受信者の HLA、SAB 試金、シーケンスの表現、その限られた変化のためには正確に検出することができます。ドナーの HLA 不一致に対して同種抗体。我々 は個人ごとに抗ドナー HLA 抗体の特徴を検出して別の技術を使用して相補的な手法を開発しようとしました。スクリーニング ツールは移植後血清抗体関連型拒絶反応のリスクを評価するために臓器の受信者をプロービングのためドナー HLA 派生系列のカスタム ペプチド配列です。ドナーと受信者の 1 つのペアの 1 つの配列に 600 のユニークなペプチドまでに基づいて行われますドナーの HLA タンパク質配列、各ペプチド、15 アミノ酸配列で、少なくとも 1 つの不一致残渣を運ぶします。これらのアレイで前と移植後の血清の抗原パターンを比較するパイロット実験で抗 HLA も関与する免疫抗原を特定することができました解像度の信号を検出することができました。パーソナライズされたこれら抗原配列は臓器移植におけるドナーの HLA 抗原の高分解能の検出を許可します。

スクリーニング法17配列を使用して元の研究では、腎臓移植の 5 科目の合計を登録しました。入力結果の私達のコホートとはそれぞれのドナーの HLA を得た。自分の病歴や SAB テストから対立遺伝子の抗体価も私たちに利用できた。これらの 5 人の患者の私たちのパイロット研究で考案した 2 つの異なる方法論: ペプチドとカスタムされたパーソナライズされた配列の固定パネルから成る標準的な配列は、ドナーと受信者の各ペア。この後者のパーソナライズされたプロトコルがこの記事と動画のもので記述されている最初の方法は、技術的には個々 の移植の特異性の高レベルを達成するためにアレイ プラットフォームのパフォーマンスを検証することを許可されていた中、ドナー特異的抗体 (DSA) の包括的な検診は、しばしば貧しい移植結果5,25,26関連付けます。
<p...

ひと白血球抗原 (HLA) シーケンス臓器提供者と受信者のペア間の不一致は、臓器移植での拒絶反応の抗体の主要な原因です。レシピエントの抗ドナー HLA 同種抗体をプローブする個々 のドナーの HLA シーケンスに基づくカスタム抗原配列の使用をご紹介します。

臓器移植における HLA 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

この同種抗体検出のためのカスタムアレイ法の全体的な目標は、臓器移植における人道的な白血球抗原またはHLAエピトープを描写することです。この方法は、移植拒絶反応に関与する特定の免疫エピトープに関する臓器移植分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、完全にカスタマイズ可能であり、個々の臓器提供者のHLA配列を反映できるパーソナライズされた抗原セットを組み込むことができることです。この技術は、同種抗体の特定のHLAエピトープを検出する可能性を秘めています。International Immunogenetics Project human leukocyte antigen project projectのデータベースから配列を取得するには、あいまいな対立遺伝子の組み合わせページで、データベースの対立遺伝子クエリフォームを開き、被験者の最初の対立遺伝子名を検索ボックスに入力します。「Search for Alleles Now」をクリックし、画面に表示されている一致する対立遺伝子名を見つけます。「Allele」をクリックし、タンパク質配列をコピーしてテキスト文書の対立遺伝子名ヘッダー行の下に貼り付け、対立遺伝子名をFASTA形式で順番に並べます。すべてのシーケンスが識別されたら、FASTA 形式のシーケンスをコピーして Cluster Omega Web サイトの Enter your input sequences ボックスに貼り付け、[標準パラメーター設定を使用してジョブを送信] をクリックします。次に、[送信] をクリックします。シーケンスのアラインメントが表示されます。ドナー固有の不一致をマークするには、アラインメントテキストをコピーして新しいテキストドキュメントに貼り付け、区別フォントの色を使用して、ドナーに一意に属するアラインメントされたシーケンス内の各不一致ドナー固有の残基をマークします。マークされたドナー特異的ミスマッチの上下に14残基を伸ばすドナー配列のすべての文字に下線を引き、下線が引かれた配列をテンプレートとして使用して、シリーズ内の任意の2つの隣接する配列間で4残基重なるシリーズ内の短い15アミノ酸配列を順次導出します。これらの15個のアミノ酸配列をコピーして、ドナー対立遺伝子の対応する名前を含む表記列を添えた列形式でスプレッドシートに貼り付けます。カスタム配列レイアウトを設計するには、20行30列の対応する対立遺伝子コールを持つペプチド配列のスプレッドシートを生成します。次に、配列を各アレイ細胞にインプットし、スポットシンセサイザーを使用して自動ペプチドアレイ合成を実行します。アレイを設計する際には、抗原セットを導出するためのテンプレートとして、個々のドナーのHLA配列を使用することが重要です。アレイが合成されたら、ト

personalized-peptide-arrays-for-detection-hla-alloantibodies-organ

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

抗原特異的T細胞の誘導と拡大のための新しいDCの独立した方法が記載されている。 HLA A2 - Igはベースの人工的な抗原提示細胞（aAPC）が効率的に多様な抗原特異性のCTLを拡大するHLA -...

HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で</emヒトCTLの>拡大

このビデオは、臓器レシピエントの抗ドナーHLA同種抗体を検出するアッセイを示しています。ペプチドアレイは、抗体を介した臓器拒絶反応の潜在的なエピトープを表すために合成されます。アレイは、標的エピトープに結合する同種抗体を含むレシピエントの血清とインキュベートされます。抗体結合は、化学発光を使用して検出され、同種抗体の反応性を誘導するドナー特異的なHLAエピトープを同定します。...

臓器レシピエントにおける抗ドナーHLA同種抗体のペプチドアレイベースの検出

このビデオでは、ペプチドマイクロアレイ技術を適用して、ヒストンペプチド上の翻訳後修飾(PTM)を認識する抗体の特異性をプロファイリングする技術を示しています。既知のPTMの組み合わせを持つ固定化された蛍光色素標識ヒストンペプチドを含むマイクロアレイスライドを、標的PTM特異的抗体で処理します。このプロセスは、標的に対する抗体の特異性と、非標的PTMとの潜在的な交差反応性を特定するのに役立ちます。...

抗体の特異性プロファイリングのためのペプチドマイクロアレイ技術

組換えヒトMHC II分子と生化学的アッセイは、免疫​​原性エピトープ同定、削除、または設計に迅速かつ定量的な洞察を提供することができます。ここで、384ウェルプレートにスケーリングペプチド-MHC II結合アッセイが記載されている。この費用対効果の高い形式は、タンパク質の脱免疫やワクチンの設計と開発の分野で有用であることを証明する必要があります。...

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

無傷のクラスI HLA /ペプチド複合体は、潜在的な関連癌バイオマーカーを表す、癌細胞により流されている。ラベルフリー検出技術を利用し、T細胞受容体はモノクローナル抗体を模倣し、小屋MIF / HLA-A * 02の検出：MDA-MB-231細胞の上清中の01複合体、ヒト血清にスパイクし、そして患者の血漿をの開発を可能にする、実証されている小説癌診断プラットフォーム。...

ラベルフリーバイオセンサー技術を活用乳癌におけるヒト白血球抗原バイオマーカーの検出

この記事は、定義された同種抗原に特異的に応答するヒトT細胞クローンの生成と増殖の方法について説明しています。このプロトコールは、さまざまなペプチド-MHCリガンドに特異的なヒトT細胞のクローニングに適合させることができます。...

末梢血からのヒトアロ抗原特異的T細胞の生成

ここでは、ヒトとマウスの血清IgGとIgMの自己抗体を同時に検出するために使用できるカスタマイズ可能な抗原マイクロアレイを生成する方法について説明します。これらのアレイにより、目的の抗原やエピトープに対する抗体をハイスループットかつ定量的に検出することができます。...

IgGおよびIgM自己抗体の同時検出のための二色抗原マイクロアレイの生成

ここでは、著者らは、精製されたモノクローナル抗体とドットブロットハイブリダイゼーションによるペプチドスキャンを使用して、線状抗原エピトープを定義するためのシンプルで効率的なプロトコルを提示します。同定されたエピトープは、その後、治療および診断アプリケーションに使用できます。...

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

この原稿では、ヒストンとその翻訳後修飾を認識する抗体の特異性プロファイリングにペプチドマイクロアレイ技術を適用する方法が記載されています。...

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

ここでは、高品質な免疫ペプチド化データを提供するマウスおよびヒト細胞株からのMHCクラスIおよびクラスIIペプチド複合体の精製プロトコルを提示する。プロトコルは、市販の抗体を使用したサンプル調製に焦点を当てています。...

免疫ペプチドミクス:マウスとヒトMHCクラスI-およびII関連ペプチドの分離による質量分析

学ぶカスタム抗原アレイ法による臓器移植におけるHLA同種抗体の検出。個別のドナーHLA配列に基づくパーソナライズされた抗原セットを用いて、移植拒絶に関与する免疫エピトープを特定し、移植成績向上への貢献を目指す。

臓器移植における HLA 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み

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