Name: ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: 学ぶショウジョウバエの胚と組織における高解像度蛍光in situハイブリダイゼーション法。チラミドシグナル増幅と96ウェルプレートを用いて、RNAの空間分布を高感度・低コストで検出する手法です。

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HMK (モップ 133473 付与) 健康研究のカナダの協会に助成金によって提供されたサポートはこのプロジェクトのための資金調達。

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li>
<li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li>
<li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li>
<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
<li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilk%2C+R+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22">Current Protocols Essential Laboratory Techniques</a>. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).</li>
<li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li>
<li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li>
<li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li>
</ol>

著者は競合する金融興味を持ってないです。

記述のプロトコルは、固定のショウジョウバエの胚または組織のほとんどの Rna の検出のための再現性、高感度、・経済的な方法を提供します。もっと昔からアルカリホスファターゼ プローブ検出法より少し複雑、魚によって得られる解像度がはるかに大きいと感度が同等または強化された7,8。全体または部分的なマイクロタイター プレートを使用して、プロトコルは、大規模なまたは限られた興味の遺伝子解析に使えます。生成されたプローブで検出可能性があります、複数のトラン スクリプト スプライス フォーム プローブは具体的には設計されていない限り、それは注意してください (すなわち、単一エクソン)。我々 は合理的な成功を収めて 200 ヌクレオチドのような小さなプローブをテストしている、小さいプローブをより少なく有効にする傾向がある、特定性の低い可能性があります。明らかに、このプロトコルは、エクソン、小さなイントロンの検出には適していませんまたはマイクロ Rna を処理します。
このアプローチでは、酵素のステップを使用して、信号の強度を高めるが、ターゲット遺伝子の発現発現レベルの比較的線形および広い範囲に比例すると信号強度が表示されます。高倍率で信号が涙点や斑点として見られている細胞や組織内。比較的まれな成績のためだけにいくつかの小さな涙点が見られています。トラン スクリプト豊富なるにつれて、これらは、数とサイズに成長します。単一分子魚 (smFISH) と同様単一の小さな涙点は単一の Rna に対応するものがまた容易に定量化するイメージングおよび情報ソフトウェアを使用しています。同じターゲットのキュレーションが我々 の画像と smFISH を使用して得られる公開された画像の比較では、これはより厳密な比較によってテストされる必要がありますが全体的に、感度と解像度の 2 つのメソッドは比較的同様に、示唆しています。SmFISH の非常に高い出費を考えると、ここで用意されているメソッドは、コストのほんの一部で同様の結果を与える必要があります。しかし、目標を小さな成績証明書または成績証明書の異なる部分を検出する場合は、smFISH をお勧めします。
いくつかの魚のプローブの小さなサイズのため、このメソッドは大規模なまたは重要な障壁貫通の組織の方もあります。ただし、高い洗剤レベルと組織の固定・透過の引っ張ることの私達の使用はこの問題を解決しているに表示されます。最後に、ショウジョウバエのティッシュの開発が、切り裂かれたティッシュのここで説明した高洗浄バッファーもショウジョウバエの胚と同様に他のほとんどの生物や組織のために動作するはず。

RNA シーケンスなど新たなゲノム RNA 検出方法は大きく何レベル1いつ、どこの遺伝子の表現の知識を拡大しています。ただし、これらは時間的・空間的解像度が比較的低いを提供します。In situ ハイブリダイゼーション RNA は、こうして細胞および細胞レベル下のローカリゼーション2の詳細を明らか固定組織で観察される視覚的に成績の分布をことができます。蛍光そのままの交配 (魚) を使用すると、さらに多くの空間分解能共焦点と光シート顕微鏡3などの強力な顕微鏡の技術の使用をことができます。4細胞の関係を確立するなど DAPI の蛍光マーカーが使えます。魚も細胞レベルで重複の明確な兆候と同時に複数の Rna とタンパク質の観察が容易になります。ユニークな試薬および二重分類に必要な手順は、次の参照3,5で見つけることが。
ここで説明する手順は、cDNA テンプレート制作 (コロニー PCR)、RNA プローブ生産 (T7、T3 または SP6 ポリメラーゼ依存流出転写を使用して)、 in situハイブリダイゼーションを含むすべての手順については、96 ウェル マイクロ プレートを利用し、蛍光信号開発。胚または組織の十分な数がそれぞれに追加されます一貫性そして可変性の評価を許可する 96 ウェル プレートのも。それぞれはそれでは異なるプローブを受け取ります。信号開発後胚または各ウェルから組織を顕微鏡分析のための個々 の顕微鏡スライドで配列します。
プローブ検出のためのパスチラミドシグナル信号増幅 (TSA) の使用は、細胞内に優れた分解能5,6,7,8堅牢な信号を生成します。Rna の細胞内の局在が事実上すべて Rna 4,,1011で発生することが表示されます重要な規制メカニズム9 。これらの解析では、RNA シーケンスで検出されない多くの転写産物が魚8によって容易に検出されたことが示されています。96 ウェル プレートに交配その場でRNA の適応一度に興味の最大 96 遺伝子の解析 (出来れ追加プレート使用)、大規模なデータセットの分析を可能します。小さいセクションにプレートを切断することによってメソッドも簡単にいくつかのサンプルに適応されます。提供されるプロトコルは、組織のほとんどの種類の RNA の分布の解析に適しています。示されていませんが、非 -ショウジョウバエのティッシュと同様に適応されます。

<table><tbody><tr><td>15 ml ポリプロピレン円錐形遠心分離管</td><td>Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>認定 DNase および RNase フリー</td></tr><tr><td>2x PCR マスターミックス 染料 (Ambiogene)</td><td>Biomart (カナダ)</td><td>141106-1K</td><td>認定 DNase および RNase フリー</td></tr><tr><td>50 ml ポリプロピレン円錐形遠心分離管</td><td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td><td>認定 DNase および RNase フリー</td></tr><tr><td>96 ウェルろ過プレート (1.2 um、親水性 PVDFメンブレン</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>フロッティングティッシュ</td></tr><tr><td>96ウェルPCRプレート(200 &mu;l)</td><td>デンビル</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>アクロディスク シリンジ フィルター (0.2 u)</td><td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>アクロディスク シリンジ フィルター (0.45 u)</td><td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>バイオショップ</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>AXYGEN 96 ウェル アッセイ ストレージ プレート</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>細菌性グリセロール ストック</td></tr><tr><td>AXYGEN アルミニウムプレートシール</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>To seal plates</td></tr><tr><td>AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>To transfer samples</td></tr><tr><td>Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin</td><td>Jackson ImmunoResearch Lab</td><td>200062156</td><td>in situ (ストック濃度 1 mg/ml, ワーキング濃度 2.5 &mu;g / mlまたは1/400希釈。</td></tr><tr><td>ブランド 8チャンネルマニホールド(オートクレーブ可能)</td><td>BrandTech Scientific Inc.</td><td>704526</td><td>96ウェルPCRプレートの上部から液体を除去するには</td></tr><tr><td>、クロラムフェニコール</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C1919</td>ストック<td>濃度34 mg / mlを溶解し、0.2μ;100% EtOHでろ過されたm(1/1000として使用)</td></tr><tr><td>シアニン3チラミド(Cy3-TSA)</td><td>自家製</td><td></td><td>Perkin-Elmer Cat#から注文することができます#SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO(1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2522</td><td>封入剤中の退色防止試薬</td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-uridine-5'-三リン酸</td><td>ロシュ</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>胚収集ケージ</td><td>ホームN</td><td>/A</td>製 <td>サイズ:ポリメチルメタクリレートで作られている 75cm×75cm×75cm</td></tr> エ<tr><td>ッペンドルフ</td>モデル<td>5804</td><td>A-Z-DWPローター上の96ウェルプレート用遠心分離機</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>バイオショップ</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>バイオショップ</td><td>GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>バイオショップ</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr>ヘ<tr><td>パリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>ストック:50 mg/ml. ハイブリダイゼーション溶液中の作業濃度 1 mg/ml</td></tr><tr><td>ラボアーマービーズ</td><td>DiaMed</td><td>LAA42370-001</td><td>加熱ユニットの充填</td></tr><tr><td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-347</td><td>サンプルミキシング</td></tr><tr><td>メッシュ - 100 micons</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>胚収集用</td></tr><tr><td>メッシュ - 800 ミクロン</td><td>SEFAR -Nytex</td><td>06-780/53</td><td>ゆるいティッシュを捕まえるため/図4の特殊チューブに使用できます。</td></tr><tr><td>マイクロカバーメガネ</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>サイズ:22 X 22 mm</td></tr><tr><td>マイクロスライド、frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>サイズ:25 X 75 mm</td></tr><tr><td>マルチウェルプレート 真空マニホールド</td><td>ポールコーポレーション</td><td>P/N 5017</td><td>96ウェルフィルタープレートの底から液体を除去</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>バイオショップ</td><td>PAR070.500</td><td>固定</td></tr><tr><td>PCRマシン</td><td>バイオ・ラッド</td><td>モデル:DNAエンジン PTC-200</td><td>96ウェルプレート PCRおよびプローブ変性</td></tr><tr><td>ピクリン酸溶液</td><td>Sigma-aldrich</td><td>80456</td><td>組織固定用 I溶液</td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCL)</td><td>Bioshop</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>PP 96ウェルプレート用蓋、100/ケース</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-LID-PP</td><td>プレート保存用蓋</td></tr><tr><td>Progene 使い捨て試薬リザーバー (50 ml、滅菌)</td><td>UltiDentScientific</td><td>825-1-50-5S</td><td>リキッドハンドリング</td></tr><tr><td>Progene ピアス可能なアルミホイル</td><td>UltiDent Scientific</td><td>87-CFILM-AL</td><td>シール 96ウェルプレート、DNaseおよびRNaseフリー</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2308- 5MG</td><td>胚透過化</td></tr><tr><td>リボロック リボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 Unit/ul</td></tr><tr><td>リボヌクレオシド三リン酸(NTP)セット</td><td>ロシュ</td><td>11277057001</td><td>RNAプローブsythesis</td></tr><tr><td>RNaseフリーウォーター</td><td>GIBCO</td><td>10977015-500ml</td><td>RNAプローブsythesis</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td> サケ精巣からの<td>RNase汚染の除去</td></tr> 一<tr><td>本鎖DNA</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9156</td><td>ハイブリダイゼーション溶液用</td></tr><tr><td>スキムミルク(無脂肪電力)</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>ワーキング濃度は、ブロッキング試薬として1 X PBTまたはPBTTの1%です</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム(NaOAc)3 M、pH = 5.2(RNaseフリー)</td><td>Bioshop</td><td>SAA333</td><td>ワーキング濃度は、DNAまたはRNA沈殿</td></tr><tr><td>SP6 RNAポリメラーゼ Thermo</td><td>Scientific</td><td>EP0131</td><td>20 Unit/ul</td></tr><tr><td>Stainless Steel Shot for Sand Bath</td><td>VWR</td><td>13259-274.</td><td>暖房ユニットを充填するには</td></tr><tr><td>実体顕微鏡&グースネック光源</td><td>ライカ</td><td>モデルMZ6</td><td>組織解剖とマウンティング</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート</td><td>分子プローブ</td><td>S911</td><td>二次抗体ストック:1 mg/ml、1/1000希釈(1 &mu;g/ml) を in situ に使用しています。</td></tr><tr><td>T3 RNAポリメラーゼ</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td>20 Unit/ul</td></tr><tr><td>T7 RNAポリメラーゼ</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td>20 Unit/ul</td></tr><tr><td>チップステーション (10 ul)</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK-S</td><td>Certified DNase and RNase free</td></tr><tr><td>Tip station (200 ul)</td><td>Sorbio</td><td>27770T</td><td>Certified DNase and RNase free</td></tr><tr><td>Tips ( 1ml)</td><td>Sorbio</td><td>10200</td><td>CertifiedDNaseおよびRNaseの自由な</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td>働く集中はティッシュのその場Tween 20のための1 X PBTの0.3%である</td></tr><tr><td></td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td>働く集中は胚のin situ Whatmanの質的な濾紙のための1 X PBTの0.1%である</td></tr>、<tr><td>グレード3</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHA1003917</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td>Preparation</td></tr><tr><td>DABCO(1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン価)グリセロール退色防止封入剤</td><td></td><td></td><td>DABCO(1.25 g)、グリセロール(35 mLまたはv/v 70 %)および1 X PBS(15 mlまたはv/v 30 %)。寒い部屋で暗く、岩を保ちます。-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>1 X PBT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS と 1 ml Tween 20 (0.1 %)</td></tr> <tr><td>1 X PBTT (1L)</td><td></td><td></td><td>1 X PBS と 1 ml Tween 20 (0.1 %) と 3 ml の Triton-X-100 (0.3 %)</td></tr> <tr><td>1 X PBTB (1L)1 X PBTB (1L)</td><td></td><td></td>1 <td>%</td></tr> <tr><td>1 X PBTT にスキムミルク</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光in situハイブリダイゼーション

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

当社オリジナル蛍光原に数多くの修正および改善を開発した式のパターンとショウジョウバエゲノムに基づいて Rna の細胞内の局在を決定するための努力と様々 な組織では、の交配 (魚) のプロトコル。スループットと費用対効果を容易にするには、プローブ信号検出、世代から、すべての手順は、エクソンの 96 ウェル マイクロ プレートを使用して実行されます。Digoxygenin (掘る)-ラベル アンチセンス RNA プローブは、テンプレートとして cdna やゲノム DNA を使用して生成されます。ティッシュの固定、透過後興味のトラン スクリプトにプローブを交配し、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) に共役し、蛍光標識ストレプトアビジンに共役抗 DIG 抗体の連続を使用して検出されました。パスチラミドシグナル、HRP の存在下ですぐに隣接する蛋白質の電子密度の高い領域に結合する反応性の高い中間体を生成します。増幅およびローカリゼーション手順は、両方の細胞および細胞内局在のトラン スクリプトのローカライズを容易にする堅牢で非常にローカライズされた信号を生成します。提供されるプロトコルは、さまざまな組織や発達段階に特異性の高い信号を生成する最適化されています。参照は同時に複数の成績証明書または成績証明書と蛋白質の同時検出を許可する追加のバリエーションもあります。

図 6は、この手順を使用して得られた結果の例を示します。トップ 3 のパネルを表示初期ショウジョウバエ胚 (図 6A ~ C のパネル)、次の 3 の例パネル例後半の信号とショウジョウバエの胚 (amnioserosa、筋肉、中枢神経系の各組織のそれぞれ (図 6、パネル D F)。次に、3 日齢から例幼虫組織 (図 6パネル G J)。K と L パネル表示アダルト生殖腺から代表的なイメージ (卵巣と精巣、それぞれ)。画像の数百をアップロードして注釈を検索私たちの '蛍光その場でフルーツ フライ database' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca))。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
図 1。その場で蛍光交配 (魚の) プロトコルおよびキー装置の概要。(A) cDNA の PCR の拡大。特定遺伝子のアンチセンス掘る-を生成する(B) の in vitro転写 96 ウェル プレート (b に示すようにプレートの写真) の RNA プローブを分類しました。(C)および(D):大人 (女性: 男性比率 2:1. 300-400 ハエ/ボトル) ハエの 3-4 日間チームメイトに同伴します。25 ° C で標準的なコーンミール料理に一晩コレクションから胚は換気の良いプラスチック ボックスに転送されます (1 L サイズのコンテナーにコーンミール料理: 8"X 8"× 3"LWH) または適切な幼虫の密度を維持する新しいボトルに。組織コレクションのアクティブな酵母粉末は 24、48 h (AEL) 産卵後に食品の上に振りかけられる必要があります。(H E):蛍光の in situハイブリダイゼーション実験では、以上 3 日間連続実行されます。8 ch 吸引 (写真 c)、写真 b のように胚またはフロートしない組織は、96 ウェル PCR プレートを使用します。フロート、幼虫のほとんどのティッシュのような組織フィルター底プレート (写真 d) を使用し、低圧 (写真 e) を使用して吸気アスピレータで下から液体を削除します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
図 2。RNA プローブの収穫の決定。1% の agarose のゲル (5 μ L/レーン) に観察されるアンチセンス RNA プローブを合成しました。収量は、(バンドの強度に基づいて) 分類できます '低収量' 3 と 10 レーン、レーン 1、4、5、6、8、' 典型的な収量' または '高収率の 2、7、9、11、および 12 の車線として。'典型的な収穫」のサンプル、各現場で実験のため交配ソリューションの 100 μ L で希釈したプローブの 10-15 μ L を使用します。'プローブ' 強度に対するバンド強度に従って追加交配ソリューションとプローブの '高収率」でサンプルを希釈します。各ウェル内のほぼ最終的なプローブ濃度を持って目指してください。矢印は RNA プローブの 1 つ、各レーンに高いバンドは元の DNA のテンプレートです。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
図 3。主要な大規模な胚のコレクションおよび固定のための手順を実行します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
図 4。幼虫または浮動の組織から液体を除去するため自家製管します。いくつかの幼生及び成体組織固定中のソリューションのフロートします。このシンプルなツールは、続いて 1 mL 先端を吸引器に接続するアダプターとして先端をカット 200 μ L で開催されたナイロン メッシュで構成されます。液体は、任意の組織を失うことがなく安全に削除できます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
図 5。パスチラミドシグナル信号増幅します。(アンチセンス RNA プローブを 1) 掘るラベルは、内因性感覚 RNA と交配させます。(一次抗体のビオチン化と掘る UTP 2) 免疫親和性結合。(3) HRP 標識ストレプトアビジンビオチン バインド。(HRP 4) は、短命のシアニン 3 パスチラミドシグナル ラジカルを形成するシアニン 3 パスチラミドシグナルと過酸化水素の反応を触媒します。(シアニン 5) 3 パスチラミドシグナル ラジカルは、近く蛋白質チロシン残基にバインドします。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
図 6。代表の in situハイブリダイゼーション画像。各パネルは、異なる RNA (シアンで表示) と核の染色 DAPI (赤色で表示) の例を示します。(A ~ C)ショウジョウバエの初期胚の例です。(D, F)ショウジョウバエの後期胚の例です。(G J)第 3 の例はショウジョウバエ幼虫組織令 (malphigian 細管、腸、唾液腺、筋肉それぞれ)。(K) 大人の卵巣。(L) 成人の精巣。各パネルにプローブを交配遺伝子の名前が表示されます。スケール バー = 10 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

記載されている RNAその場で交配のプロトコルでは、全体のショウジョウバエの胚または切り裂かれたティッシュで RNA の検出をことができます。96 ウェル マイクロ プレートとパスチラミドシグナル信号増幅を使用して、高解像度、感度、および、スループットと比較的低コストで成績証明書が検出できます。

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

本手順の全体的な目的は、細胞および組織内におけるRNA転写物をその場（in situ）で検出することです。この手法は、細胞、組織、または胚内のどこにRNAが位置しているかなど、細胞生物学や発生生物学の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、他の手法と比較して低コストでありながら、高い解像度と感度でRNAの空間分布を検出できることです。我々は当初、可能な限り多くのショウジョウバエのRNAについて細胞内分布を研究するために本プロトコルを開発しました。これは、細胞内分布の範囲と多様性を明らかにすることを目的としていました。プロジェクトの開始時は胚を用いていましたが、その後、幼虫および成虫から解剖した組織を用いてハイスループットに解析できるよう、プロトコルの適合と最適化を行いました。本手順において最も困難な点は、ステップ数が多くそれに伴いエラーが発生する可能性があること、およびプローブ作製中にRNAが混入しないように徹底する必要があることです。スループットの向上とコスト効率化を図るため、本ビデオで実演する手順では、すべてのステップに96ウェルマイクロタイタープレートを使用しています。また、プレートを8ウェルまたは12ウェルのストリップに分割することで、より少数のサンプルにこの方法を容易に適応させることができます。まず、新しい96ウェルPCRプレートの各ウェルにおいて、10 µLの一晩培養した細菌培養液を90 µLのオートクレーブ滅菌済み2回蒸留水で希釈します。サーモサイクラーを用い、95 °Cで5分間DNAを変性させます。その後、直ちにプレートを氷上に置き、少なくとも5分間静置します。新しい96ウェルPCRプレートを用いてPCR反応をセットアップします。適切なユニバーサルプライマーを使用し、各ウェルにPCRマスターミックスを48 µLずつ分注します。各ウェルに、変性させたプラスミドDNAテンプレートを2 µLずつ加えます。96ウェルPCRマシンを用いて増幅を行います。増幅完了後、エタノール・酢酸ナトリウム混合液を用いてPCR産物を沈殿させます。サンプルを−80℃で30分間保存します。96ウェルプレートを4°Cで2,250 ×g、45〜60分間遠心分離します。ペレットを吸い込まないようにチップがウェルの底に届かない構造の8チャンネル真空マニホールドピペットを使用し、上清を慎重に取り除きます。冷やした70%エタノール 160 µLで1回洗浄します。4°Cで2,250 ×gにて10分間遠心分離します。96ウェルプレートをペーパータオルの上でそっと反転させ、各ウェルの最後の一滴まで液体を取り除き、室温で1時間放置してDNAペレットを風乾させます。沈殿したDNAを25 µLのRNaseフリー水で再懸濁します。アガロースゲル電気泳動により、PCR産物のサイズと収量を調べる。新しい96ウェルPCRプレートの各ウェルに適切な成分を添加し、in vitro 転写反応を準備する。各対応するウェルに7.5 µLのDNAテンプレートを添加する。プレートをシーリングテープで覆います。プレートを37°Cで3.5時間から4時間インキュベートします。次に、DEPC処理済み二回蒸留水、100%エタノール、および3 M 酢酸ナトリウムで構成されるマスターミックスを各ウェルに加えます。−80°Cで30分間保存します。プレートを遠心分離し、既述の手順でウェルを洗浄します。沈殿したプローブを25 µLのDEPC処理済み二回蒸留水で再懸濁します。 newly-synthesized antisense RNA probes を1%アガロースゲルで電気泳動し、完全性と収量を確認しました。バンドの強度に基づき、収量を低収量、標準的収量、または高収量として評価できます。各プローブ 5 µL をアガロースゲル電気泳動に使用した後、残りの 20 µL を 100 µL のハイブリダイゼーション溶液と混合し、使用時まで -80 °C で保存します。この手順を開始するために、20から30匹の幼虫をfix one溶液を含む冷PBSを入れたペトリ皿に入れ、氷上で2分間冷却して幼虫の運動性を低下させます。解剖顕微鏡下で幼虫を解剖します。鋭いピンセットを用いて前方から慎重に開き、組織を後方から前方に向かって押し出します。最大15分後、摘出した組織を固定用の1.5 milliliterチューブに移し、氷上に置きます。PBSを除去し、800 microlitersのfix one溶液を加えます。以前に採取し固定中の他の組織とともに、ベンチトップミキサーで30分間インキュベートします。組織を800 µLのPBTTで1回洗浄し、他の組織の採取および固定が行われている間、チューブを氷上に保持します。採取したすべての組織を、蓋にメッシュが付いた1本の15 mLプラスチックチューブにまとめます。蓋のメッシュを通して過剰な液体を吸引除去します。10 mLのPBTTで洗浄し、10 mLのPBSでリンスします。内因性ホースラディッシュペルオキシダーゼ活性を消失させるため、0.3%過酸化水素含有PBSを5 mL加え、室温で15分間インキュベートします。10 mLのPBTTで2回洗浄します。あらかじめ冷却した80%アセトンを10 milliliters加え、マイナス20 degrees Celsiusで10分間インキュベートして、組織を透過処理します。PBTTを10 milliliters用いて2回洗浄し、組織を再水和させます。テキストプロトコルに記載の方法で組織を洗浄した後、ハイブリダイゼーション溶液中でマイナス20 degrees Celsiusで保存します。翌日までに使用しない場合は、フィルターアセンブリを通常のキャップに交換してください。組織を1ウェルあたり約20 µLずつ、氷上の96ウェルPCRプレートに分注します。8チャンネルマルチチャンネルピペットを用いて、組織からハイブリダイゼーション溶液を除去します。各ウェルに、調製したての変性ハイブリダイゼーション溶液を100 µL加え、シーリングテープで密閉します。メタルビーズを入れたドライバス加熱ユニットを用い、組織を56 °Cで最低2.5〜3時間前ハイブリダイゼーションさせます。96ウェルPCRプレート内で、調製したプローブ100 µLを80 °Cで5分間変性させます。直ちに氷上で5分間冷却します。組織から前ハイブリダイゼーション溶液を取り除き、各サンプルに変性させた遺伝子特異的プローブを添加します。アルミシールテープで密閉し、ドライバス加熱ユニット内でメタルビーズを用いて56°Cで16〜18時間、一晩ハイブリダイゼーションを行います。プローブ検出手順を開始する前に、必要なすべての溶液を56 °Cの加熱ユニットで予熱します。ハイブリダイゼーション済みの組織を、マルチウェルプレート用真空マニホールドに適合する96ウェルプレートに慎重に移します。これらのプレートのウェルは底面がメンブレンになっており、真空状態で内容物を除去することが可能です。96ウェルプレートからプローブを取り除き、56 °Cの加熱ユニット内で、本表に示される手順に従ってハイブリダイゼーション溶液とPBTTの混合液でサンプルを洗浄します。PBTTによる3回目の洗浄後、96ウェルプレートを加熱ユニットから取り出し、PBTT溶液を除去して、ベンチトップミキサーを用いて室温で20分間PBTTBで組織をブロッキングします。各ウェルに100 µLの抗体溶液を加え、ベンチトップサンプルミキサー上で2時間インキュベートします。本文のプロトコルに従ってPBTTBで洗浄した後、各ウェルにStreptavidin horse radish peroxidase溶液を100 µLずつ加え、室温で1時間30分間インキュベートします。PBTTBで5分間ずつ2回洗浄します。その後、本文のプロトコルに従って、組織をDAPI溶液でインキュベートします。この手順は、サンプルをTyramide溶液とともにインキュベートすることから始め、ベンチトップミキサーを用いて暗所で2時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、組織からTyramide溶液を取り除きます。テキストプロトコルに従ってPBTおよびPBSで洗浄した後、1ウェルあたり150 µLの抗退色封入剤を加えます。組織がウェルまたはチューブの底に沈降するように、サンプルを4°Cで一晩保持します。翌日、サンプルを顕微鏡スライドに封入し、カバーガラスで密閉します。最後に、蛍光顕微鏡を用いてサンプルの画像を撮影します。ここでは、本手順を用いて得られた、羊膜漿細胞、筋肉、および中枢神経系にシグナルを持つショウジョウバエの初期胚および後期胚の結果例を示しています。各パネルには、プローブがハイブリダイズした遺伝子名が表示されています。次に、3齢幼虫の組織、マルピーギ管、中腸、唾液腺、および筋肉の例を示します。最後に、成体卵巣および成体精巣の代表的な画像を示します。習熟し、効率的に実施できれば、この手法は最短2日間で完了させることができます。本手順を行う際は、RNase-freeなベンチで、RNase-freeのチップ、チューブ、プレート、溶液を使用し、手袋を着用して作業することが重要です。大量のサンプルやプローブを扱う場合は、手順を急がないようにしてください。また、作業の進捗状況を忘れないための工夫を凝らすことも重要です。本手順に従う際、複数のプローブの検出や、タンパク質や細胞マーカーを併用したプローブの検出など、他の手法と組み合わせることも可能です。これらを用いることで、相対的な発現パターン、細胞および細胞内コンパートメントの同定、ならびに異なる遺伝的背景や疾患における影響などの追加的な問いに答えることができます。このビデオを視聴することで、あらゆる種類の組織または胚において、ほとんどのタイプのin situハイブリダイゼーションを行う方法を十分に理解できるはずです。ホルムアルデヒド、過酸化水素、ホルムアミドなどの試薬の使用は極めて危険であるため、手順の実施中は、適切な取り扱いや廃棄などの予防策を常に講じることを忘れないでください。

high-resolution-fluorescent-situ-hybridization-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin...

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

メゾスコピック蛍光トモグラフィは、組織切片の蛍光顕微鏡の浸透の制限を越えて動作します。技術は、マルチプロジェクション照明と光子輸送記述に基づいています。我々は、生体内でのGFP発現翼成虫ディスクの形態形成の全身3次元可視化を実証...

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

ここでは、ホールマウント蛍光を記述...

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

我々は、色の沈殿物を対照することによって三つの異なるmRNAの分布パターンの同時および特定の検出を可能にする、完全なショウジョウバエの胚におけるマルチターゲット発色性ホールマウントin situハイブリダイゼーション （MC-WISH）の手順を説明します。...

マルチターゲット発色ホールマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。...

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

初期のショウジョウバエの胚では、多くの細胞小器官は運動性である。原則として、それらは特定の蛍光プローブを介して生きたまま画像化することができるが、卵殻は胚への直接適用を妨げる。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介してそのようなプローブを導入し、次いで粒子画像速度測定を介してバルクオルガネラ運動を分析する方法を記述している。...

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

ここでは、ショウ ジョウバエ...

拡大顕微鏡を用いたショウ ジョウバエ の胚全体拡大による超解像イメージング

このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ...

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)は、拡大顕微鏡法と蛍光in...

Expansion-assisted iterative Fluorescence In Situ Hybridizationを用いたInsact Drosophila Brainにおける遺伝子発現のマルチプレックス検出

このプロトコルは、ショウジョウバエのメラノガスター幼虫視葉におけるハイブリダイゼーション連鎖反応蛍光性交配(HCR-FISH)を行うために必要な手順を説明しています。プローブ設計、ハイブリダイゼーション、増幅、組織マウントの手順が詳細に記載され、発達中の視葉の可視化を容易にします。...

発達中の ショウジョウバエ の視葉におけるハイブリダイゼーション連鎖反応FISHの

学ぶショウジョウバエの胚と組織における高解像度蛍光in situハイブリダイゼーション法。チラミドシグナル増幅と96ウェルプレートを用いて、RNAの空間分布を高感度・低コストで検出する手法です。

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

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