代謝サポートの切除、生体脳磁気共鳴顕微鏡集録時に

この手順の全体的な目標は、磁気共鳴顕微鏡データの収集中に生体組織サンプルに好ましい代謝条件を提供することです。この方法は、生細胞やその他の顕微鏡的組織成分のMR造影特性を明らかにすることにより、医用画像処理の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点は、MRスキャナー内の灌流条件を正確に制御し、画像取得中でも灌流液の連続的な流れを可能にすることです。

コイルプローブと酸素供給器ハードウェアの組み立ては複雑で説明が難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることは非常に重要です。人工脳脊髄液(aCSF灌流液)を実験用に準備するには、事前に調製したaCSFを周囲温度まで平衡化し、95%カルボジンで直接バブリングして少なくとも1時間ガス化します。aCSFが目的の温度とカルボゲン飽和度に達したら、pHメータープローブをaCSF液に挿入して、pHが生理学的範囲内にあることを確認します。

健康な組織代謝に適した溶存酸素含有量とpH条件を維持するために、実験中はガスを直接灌流液リザーバーに泡立て続けます。プライミング手順を開始する前に、プロフュージョンラインの配置がプローブ本体の組み立てやプローブのボアへの挿入を妨げないことを確認してください。プロフュージョンラインをプライミングするには、ペリスタルティックマイクロポンプに接続されたインレットチューブを調製したaCSFに沈めます。

次に、酸素供給器デバイスとプロフュージョンラインをマグネットボアとグラジエントコイルスタックに上から下に通します。プローブが組み立てられるまで、コイルを脇に置きます。CSFの廃液を捕らえるには、ビーカーの上に酸素供給器を吊るします。

目的の2ミリリットル/分の流量を選択して確認します。ポンプのスイッチを入れて、プロフュージョンラインの充填を開始します。空のインラインバブルトラップを反転させることにより、aCSFで内部の空気を置換します。

次に、酸素供給器のガスポートを2番目のカルボゲン源に接続し、1分間に16リットルの流量を設定します。カルボゲンが酸素供給器のガス交換膜上を流れていることを確認するには、酸素供給器の上部にある排気ポートを水に浸します。aCSFがプロフュージョンチャンバーから滴り始めたら、流入ラインを手動で攪拌して、目に見える気泡を放出します。

次に、プロフュージョンチャンバーから流れるaCSFに酸素電極を沈め、酸素供給器が正常に動作していることを確認します。安楽死させたラットの頭蓋骨から脳を取り除いた後、テキストプロトコルに記載されているように、腹臥位に戻します。脳の中央部分を含む海馬を分離するには、直角のカミソリを使用して横面に沿って2つの切り込みを入れ、横方向の裂傷と線毛に吻側に甘やかされているすべての組織を取り除きます。

次に、シアノアクリレート接着剤を使用して、中央部分の最も小さな平面をビブラートームカッティングバスの中央に固定します。氷冷したカルボゲン泡状aCSFを加え、ナイロン保持金具をビブラートームカッティングバスの中に置きます。次に、300マイクロメートルの厚さのスライスをカットして、半球ごとに3〜4枚の使用可能なスライスを作り、合計6〜8枚のスライスになります。

メスとマイクロ鉗子を使用して、1つの半球から海馬または皮質切片を分離し、マイクロコイルの直径5ミリメートルの組織ウェル内に収まるようにスライスをトリミングします。マイクロコイルを調製するには、トランスファーピペットを使用して、ビブラートームのカッティングバスからの酸素化aCSFを組織チャンバーに充填します。次に、トランスファーピペットを使用して、トリミングした脳サンプルをマイクロコイルの組織ウェルに入れます。

解剖顕微鏡を使用して、マイクロコイル上に関心領域を配置します。イメージング実験全体でサンプルの位置を保持するには、ナイロンワッシャーに貼り付けたナイロンメッシュネットなどの組織保持デバイスを挿入します。保持成分を挿入した後、サンプルの正しい配置を視覚的に確認することは、組織の位置を調整する最後の機会となるため、非常に重要です。

次に、改造したマイクロコイルアセンブリをテーブルクランプに固定し、酸素発生器のアセトールサポートペグをマイクロコイル上部の穴に挿入します。次に、プロフュージョンチャンバーをマイクロコイルの組織ウェルの上に置き、それらを一緒に握りしめてプロフュージョンシステムをシールします。ワイヤーカッターを使用して、余分なケーブルタイをトリミングします。

シーリングが成功すると、aCSFは流出ラインを通って収集チューブに滴下し始めます。マイクロコイルと酸素供給器アセンブリをイメージングプローブ本体の上部に取り付けます。最後に、グラジエントスタックをアセンブリの上にスライドさせ、グラディエントをプローブの上に固定します。

組み立てたプローブをマグネットボアに挿入するには、まずプローブ本体を磁石の下部にある分光器ボア開口部の近くに置きます。次に、余分な長さの灌流ラインを磁石上部のボア開口部に通します。利用可能なスラックをすべてプロフュージョンラインから取り除いたら、プローブ本体をベースのマグネットボアに進めます。

同時に、ボアの上部からプロフュージョンラインからより多くのたるみを取り除きます。次に、プローブの基部にあるシムスタックの対応するスロットに2本の固定ネジを固定します。先に進む前に、流出ラインを廃棄物リザーバーに固定し、CSFの流出を確認して、プローブの挿入中に灌流ラインが挟まれたりねじれたりしていないことを確認します。

プローブ本体を接続したら、画像収集を開始します。インボア酸素供給器が正常に機能している場合、ここに示すように、aCSF灌流液の溶存酸素の割合は、供給ガス中の酸素濃度の割合と一致する必要があります。酸素濃度が変動するカルボゲン混合物を供給ガスとして用いた場合、組織増殖時の酸素飽和度は、用いた混合物中の酸素濃度の100%に近づきました。

拡散シグナルの安定性試験を実施し、スーパーフュージョンスライス、固定コントロール、および非灌流コントロール間で比較しました。異なる灌流条件にさらされた4つの皮質スライスにおける正規化された拡散信号値は、安楽死後15.5時間の間安定しており、また、非灌流皮質とは対照的に、陽性対照としてのホルムアルデヒド固定皮質においても安定している。サンプルの適切な配置はMR顕微鏡にとって重要であり、より高速および低解像度のパイロットスキャンで視覚的に確認することができます。

この予備スキャンでは、拡散の重み付けが低いと、錐体細胞層と海馬の隣接組織との間のコントラストが低くなります。拡散ウェイトが高いと、錐体細胞層と海馬の隣接組織との間のコントラストが増し、錐体細胞層は隣接する組織よりも暗くなり、サンプルが正しく中央に配置され、解剖スコープの下に配置されてからシフトしていないことが確認されます。この手順を試みる際には、スライスの生存率を最大化するために、できるだけ早く超融合を開始することを忘れないでください。

このビデオを見た後、MR顕微鏡検査を受けている切除された脳組織に代謝サポートを提供する方法についてよく理解しているはずです。灌流液と溶存ガスの変更により、代謝要件が異なる他のタイプの生きた切除組織を調査することができます。.