Name: 単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶ単球のホーミングと末梢動脈疾患マウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡観察法。Matrigelマトリックスと細胞標識を用いたリアルタイムイメージングにより、単球の動態と血管新生メカニズムを可視化する革新的アプローチを解説。

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この作品は、ELSE Kröner 財団によって支えられたと、 (ドイツ研究振興協会、ドイツ研究振興協会) DFG SFB 854 (Sonderforschungsbereich、共同研究センター)。ハンス ・ ホルガー ・ Gärtner、Audiovisuelles Medienzentrum、オットー ・ フォン ・ ゲーリケ大学マクデブルク Magdeburg, ドイツの, のおかげで特別なテクニカル サポート。

ドイツ動物保護法の第 8 章によるとザクセン = アンハルト州 Landesverwaltungsamt ハレの状態の許可を得て本研究を行った。(8、18.05.2016 - BGBI から動物保護のためのドイツの法律の項を参照。1206 を s. 13.08.2013 からの § 31 TierSchVersV 1313).
 注: ここで実験のため 12 週古い男性 balb/c マウスに 8 が使用されたと献血者からひと単球使用した生体顕微鏡による単球の可視化。
 1 ですセル準備 注: 単球の分離、参照してください私たちの以前公開されたビデオ ゼウスについて: &#34; 分離と静脈内注射のマウス骨髄由来。単球 &#34; ワグナー ら によって 4 注: とき汚染を避けるために滅菌する必要があります、セルのすべての手順を操作します。
<ol><li>細胞染色 3, 3 &#39;-Dioctadecyloxacarbocyanine 過塩素酸 <ol><li>1 x 10 6 セル/mL の濃度と血清フリー培地の細胞を再懸濁します 。
		注: のみ血清の自由な媒体により、効率的な染色、脂溶性色素に既に血清の脂溶性成分によってキャプチャされるそれ以外の場合からです</li>。
		<li>1 mM 3, 3 の追加の 5 μ L &#39;-細胞懸濁液 1 mL にジメチルホルムアミド中 Dioctadecyloxacarbocyanine 過塩素酸と慎重に再懸濁します</li>。
		<li>加温 20 分の 37 ° C で携帯ソリューション</li>
		<li>37 ° C で 500 x g で 5 分間細胞を遠心分離</li>
		<li>上清を除去し、37 ° C 暖かい胎仔血清添加培地で細胞を再懸濁します</li>。
		<li>1.1.4 と 1.1.5 の手順を 2 回繰り返します</li>。
		<li>は、数式でセルをカウント: 
		<img alt="Equation 1"src="/files/ftp_upload/56290/56290eq1.jpg"/></li> <li>150 μ L 滅菌 0.9 %nacl 水溶液の細胞を再懸濁します</li>。
		<li>尾静脈にセルを挿入します</li>。
	</ol></li></ol> 2。麻酔 <ol><li>吸入麻酔 <ol><li>化学物質安全フードの下で閉鎖した箱に 5% の濃度を使用して気化器の助けを借りて、イソフルラン気化します</li>。
		<li>マウスを慎重に扱う、ビンに入れて</li>。
		<li>それは移動が停止した後、後頚部の皮膚で動物を処理します</li>。
	</ol></li> <li>腹腔内麻酔 注: 使用イソフルラン麻酔、手順 2.1、腹腔内投与を行う。高速リカバリとイソフルラン麻酔の麻酔効果を短時間作用、マウスを処理し、腹腔内麻酔を注入する簡単です。
	<ol><li>腹腔内投与の 2.4 mL ケタミン (10%)、0.8 mL (2%)、キシラジンと 6.8 mL 塩化ナトリウム (0.9%) のソリューションを使用します</li>。
		<li>麻酔薬を適用する前に動物の重量を量ます 。
		注: 数式が麻酔薬です: <img alt="Equation 2"src="/files/ftp_upload/56290/56290eq2.jpg"/></li> <li>1 mL インスリン注射器 30 G の針を使用して、左の下腹部に薬液を注入します</li>。
		<li>はその檻の中にマウスを置くし、麻薬効果を待つ 。
		注: 注入が成功した場合、麻酔の効果は通常表示 5 分以内。通常、制御呼吸率と同様、蓋反射またはつま先ピンチへの反作用の不在によって麻酔の正しい深さを決定ことができます</li>。
	</ol></li></ol> 3。基底膜のようなマトリックスの注入 注: 単球注入後腫瘍の血管新生の研究に私たちのグループによってこのメソッドを使用します。実験によって成長因子は基底膜のようなマトリックスに追加できます。マウスの側面に腫瘍を注入する前に大腿動脈の結紮を行った。マトリックスは、注入のための 4 ° C の温度が必要です。この温度で行列が液ゲルが体温 (37 ° C) で固体に固まります。皮下行列の優れた視認性プラグ、注射部位にマウスの皮膚を削る。
 注: オプション: 追加 100 ng 塩基性繊維芽細胞成長因子、300 ng 血管内皮増殖因子、および基底膜のようなマトリックスを無菌条件下で 26 i. u. ヘパリン。
<ol><li>使用まで 30 G インスリン注射器と氷のストアに行列の 1 つの mL を読み込む</li>。
	<li>動物をテーブルに置き、側面に注射部位の横にマウスの皮膚を保持します</li>。
	<li>が基底膜のようなマトリックスの 500 μ L を皮下注入します 。
	注: 実用的な理由から必要だコンパクト皮下の分散を避けるために 1 つの場所で基底膜のようなマトリックスを挿入します。実験の終わりにマウスを犠牲にした後、組織から人工の腫瘍を取り除くために容易になります</li>。
</ol> 4。尾静脈注射 注: 実験前に実験動物の NaCl 水溶液で尾静脈注射の練習します。単球は、尾静脈に十分に注入できない場合、は、全身に及ぼす影響は担保されません。このプロトコルでは、250 万球を注入されます。体重の以上 5 μ L/g を注入しよう。
<ol><li>[ステップ 1.1.8 250 万単球を含む準備単球ソリューションを使用します</li>。
	<li>注射用 30 G 針、1 mL インスリン注射を使用します</li>。
	<li>慎重にマウスを処理、落で動物を抑制、マウスで害がない、呼吸に十分なスペースを確認してください</li>。
	<li>尾プレートに接触することができます加熱パッドで、落を配置します</li>。
	<li>尾の側面にある尾静脈を識別します</li>。
	<li>尾静脈が尾の上側に表示されますので尾 90 ° を有効にします</li>。
	<li>単球を注射する前に注入側でウイルス駆除します</li>。
	間違いなく直面している針の傾斜面と平らな角度の単球溶液を注入しようとする <li> 
	これは失敗した注入の兆候として注意: は水疱がある場合注入を停止します。上記の手順をもう一度より近位</li>。
	<li>約 60 尾に穏やかな圧力を適用することによって、注射部位の出血を停止します</li>。
	<li>全身性副作用を監視し、そのケージにマウスを置くと動物は完全に回復した後に 30 分のための動物を観察します</li>。
</ol> 5。生体顕微鏡 <ol><li>準備 <ol><li>粘着テープで一定の温度を維持し、場所に足を修正加熱パッド (37 ° C) の麻酔下のマウスを配置します</li>。
		<li>脚や顕微鏡に使用される側面のサイトで皮膚を消毒します</li>。
		<li>髪との干渉を避けるためより良いハンドリングのための関心領域を剃る</li>。
		<li>滅菌メスと 0.5 × 0.5 cm の正方形の領域の微細鉗子で皮膚を切除します 。
		注意: 湿った; 関心領域を保つことが重要です。それ以外の場合、画像や組織の品質が低下します。食塩は地域を湿らせて使用できます</li>。
		<li>2 つの調節可能なスタンプの間の脚を置き、スタンプの上にカバーガラスを配置します</li>。
		<li>組織が濡れているとガラスとの接触が確保します</li>。
		<li>Inject 50 μ L ローダミン デキストラン球より良い可視性のための血管の静脈系にします</li>。
		<li>顕微鏡を起動し、必要な場合は、脚の位置を調整します</li>。
	</ol></li> <li>生体顕微鏡を設定 <ol><li>顕微鏡、コンピューター、電子インターフェイス、およびレーザーをオンにします</li>。
		<li>培養室の暖房ユニットをオンにおよび/または加熱ステージ (プレート/パッド) と温度を 37 に設定 ° C</li>
		<li>は、集録ソフトウェアを起動します。顕微鏡には共振型スキャナーが装備されている場合はこの高速スキャン モードを選択します</li>。
		<li>待機温度に達する一定レベル (35-37 ° C) まで 
		注: 安定した温度は重要である: (a) マウスを麻酔下で体の温度を (b) 回避するか、少なくとも最小限に抑える焦点ドリフトを制御できません。これは周囲の条件 (例えば、空調システム、人々 を含む部屋の熱源の数) によって、数時間に 1 h を取ることができます。浸漬の目的を使用している場合、レンズとカバーガラス (または組織) 間の接触領域は不安定性の代表的なソースです。レンズを客観的ヒーターで加熱してください。また、オート フォーカス システムと顕微鏡を強く推奨します</li>。
		<li>実験の解像度の要件を満たす高数字絞り値との倍率のレンズを選択 (このセクションの末尾にあるメモを参照してください).</li>
		<li>利得、チャネル設定、スキャン速度、ピクセルの解像度、奥行きのボリューム、ステップ サイズ、およびステージで実験動物を配置する前に平均に関して顕微鏡設定を最適化します</li>。
		<li>取得時間を短縮する双方向をスキャンします</li>。
		<li>顕微鏡が安定した状態に達しているし、ダミーの助けを借りて、設定をテストされている後 prewarmed 顕微鏡ステージ上麻酔下マウスを配置します</li>。
		<li>明るい照明を使用してフォーカスに基底膜のようなマトリックス内の関心領域をもたらすと紫外線応用 fluorophores の十分なフィルター設定を簡単に毛細血管を調べる</li>。
		<li>スキャン モードに切り替える 256 x 256 低解像度モードでスキャンを開始、ゲインを高めるし、レーザー出力信号はモニターに観察されるまで</li>。
		興味の構造に焦点を <li>。すべての詳細が表示されるまで拡大します</li>。
		<li>定義 &#34; 開始 &#34; と &#34; エンド &#34; 軸方向位置</li>。
		<li>スキャンを停止します</li>。
		<li>ステップ サイズ (例えば、0.5 μ m) と焦点面 (例えば 10-20) の数を定義します</li>。
		最高の動きに合った移動細胞内構造や細胞選択スキャンの速度に応じて最終的なピクセル解像度 (512 x 512 または 1,024 × 1,024) <li>スイッチ速度 (スキャン周波数)スタックの取得を固定する双方向のスキャンをお勧めします 。
		注: は、十分な画像品質を与えるスキャンの最高のスキャン レートを選択します。典型的なスキャナーは、400 Hz と 1.4 kHz の間の速度を提供します。共鳴スキャナーは、追加の 8 kHz または 12 kHz を提供します。Y 方向の行数を減らして、スキャン レートをさらに増やすことができます (一般的な値は、512 x 512, 512 x 256 または 512 x 200 ピクセルの解像度)。信号対雑音比によって 1 つは 2 と 4 の間の平均線を追加することで画像の品質を改善するために試すことができます。通常、8 KHz 共振型スキャナーの場合; 使用双方向モードで 18 ms の取得時間/フレームの平均結果なしで 512 x 200 の設定512 x 200 と平均 x 4、それはフレームあたり 56 ms まで遅くなります</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , 
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<li>Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bone+marrow+derived+monocytes%3A+a+novel+approach+for+augmentation+of+arteriogenesis+in+a+murine+model+of+femoral+artery+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+translational+research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation.</a> American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).</li>
<li>Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+purification+of+mouse+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes.</a> J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).</li>
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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ここで説明する方法は、担保動脈の開発、これらの血管の単球の挙動と arteriogenesis の過程に光を投げかけています。このプロトコルを適用するための手順が簡単に学び、科学の他の分野で使用することができます。これらの利点にもかかわらず、いくつかの欠点があります。例えば、顕微鏡装置は、記載された方法を実行する必要です。1 つの実験のための機器を取得は、デバイスを共有するその他の機関と協力する上で重要な持続可能なではないです。
練習を避けることがこのプロトコルで接続されているその他の困難があります。初めに、顕微鏡でマウスの位置の問題があることし、画質がこのような状況の下で苦しむことができます。もう一つの重要なポイントは、尾静脈注射です。単球静脈内に見られるは正しく挿入された場合のみ。したがって、マウスの前に注射を練習することをお勧めします。
単球の分離も重要です。単球は、しばしば様々 な結果やセル利回り12,13</su...

冠動脈疾患や末梢動脈疾患などの心血管疾患で死亡の最も一般的な原因は、グローバル1。細胞治療は、外科的介入を受けることができない人に特に心血管疾患の治療に有望なアプローチです。治療ツール2,3、灌流を改善し、虚血性と underperfused 組織の機能を維持する全体的な目標として細胞やその分泌物質を使用するいくつかのアプローチがあります。この目標を達成するために 1 つの試みは、担保動脈の開発を高める arteriogenesis を改善することです。単球は、担保に関連付けられている重要な細胞タイプです。当社グループは、特に虚血およびそれに続く炎症6を誘発する後肢虚血モデルを用いた単球の炎症4、5、地区の影響を研究に集中しています。単球の炎症の故郷であり、担保7の開発につながる複雑な全身反応を起こします。
生体顕微鏡を使って、我々 は、これらの細胞の生体内での挙動を調べるし、炎症の領域に注入された単球のホーミングを観察できます。ほとんどの元の研究では、事後解析、組織学的成果物および準備のために必要な動物の多数の導入を含む不利な点を保持するのみについて説明します。私たちのアプローチで免疫学プロセスを調べることができます、複数の時点で担保の形成を介してライブ イメージング。
担保動脈虚血領域での開発に加え単球も腫瘍の成長に影響します。これらのプロセスを調べるためには、Engelbreth ・ ホルム群マウス肉腫、腫瘍細胞外マトリックス蛋白質8で豊富なから抽出した基底膜のようなマトリクスを注入し、生体顕微鏡による分析します。この行列は内皮細胞ネットワーク形成や血管新生の抑制を介して抗腫瘍療法のスクリーン テストの分子に使用します。この場合、私たちは単球細胞療法9,10,11のための潜在的な腫瘍血管新生を評価します。
このプロトコルの目的は、生体内でモデルの虚血によって引き起こされる免疫学プロセスを勉強する簡単で効率的な方法を示すことです。事後筋肉組織の組織学的精密検査と比較して、現実的なテスト環境を生成します。

<table><tbody><tr><td>10% 子牛胎児血清 (FCS)</td><td>Sigma Aldrich、ハンブルク、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma Aldrich、ハンブルク、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1mL Omnifix -F insuline syringe</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml syringe&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany</td><td></td><td>Injectomat- syringe 50 ml with canule</td></tr><tr><td>6-well-ultra-low-attachement-plates</td><td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8- 12 週齢, オス, C57BL/6, BalbC マウス&nbsp;</td><td>チャールズ川、ズルツフェルト、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>粘着テープ</td><td>TESA SE、ハンブルク、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>取得ソフトウェア</td><td>ライカ、ヴェッツラー、ドイツ&nbsp;</td><td></td><td>Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF);バージョン:2.7.3.9723</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun、Melsungen AG、Melsungen、ドイツ</td><td></td><td>29G、30G</td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>Greiner Bio-One GmbH、フリッケンハウゼン、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養培地</td><td>Medium199、10%子牛胎児血清、1%抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン)</td><td></td>遠心分離機ベックマンコールターGmbH、クレーフェルト、<td></td></tr><tr><td></td><td>ドイツ</td><td></td><td>アレグラ X-15R 遠心分離</td></tr>機 <tr><td>脱毛クリーム</td><td>Veet、マンハイム、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>Invitrogen ユージーン、オレゴン州、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>消毒剤</td><td>Sch&uuml;lke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨てメス No.10&nbsp;</td><td>羽毛安全カミソリ Co.Ltd、大阪、日本&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, ハンブルク, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer フラスコ</td><td>GVB, Herzogenrath, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール 70%</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml;cken, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Rubis, Stabio, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flurophor/Rhodamindextran</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>Katalognummer: D-1819</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>R&ouml;sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>暖房パッド&nbsp;</td><td>Labotect GmbH、G&ouml;ttingen, ドイツ&nbsp;</td><td></td><td>ホットプレート062</td></tr>ヒト<tr><td>マクロファージコロニー刺激因子</td><td>Sigma Aldrich、ハンブルク、ドイツ</td><td>SRP3110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Humane leucocyte filters</td><td>Blood preservation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig;ハイム、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ケタミン(10%)</td><td>Ketavet、Pfizer Deutschland GmbH、ベルリン、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>白血球分離チューブ(フィルター付きチューブ)&nbsp;</td><td>Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡&nbsp;</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany</td><td></td><td>Axiovert 40 C</td></tr><tr><td>Lymphocyte separation medium LSM1077</td><td>GE Healthcare, Pasching, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミディアムM199&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microbiological work bench</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany</td><td></td><td>Hera safe</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>Art. Nr. 1879</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーターと加熱ユニット付き顕微鏡スタンド</td><td>&nbsp;Leica DMI 6000、Pecon、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>単球洗浄バッファー</td><td>単一成分</td><td></td><td>PBS、0,5%BSA、2mM EDTA</td></tr><tr><td>マウス拘束装置</td><td>で</td>私たちのグループによって製造されました さまざまな<td></td><td></td></tr><tr><td>多光子顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ、ヴェッツラー、ドイツ&nbsp;</td><td></td><td>ライカSP5共焦点顕微鏡、Cameleon、Coherent</td></tr><tr><td>NaCl(0,9%)</td><td>Berlin Chemie AG、ベルリン、ドイツ</td><td></td><td></td>ノ</tr><tr><td>イバウアー計数室&nbsp;</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml;ニグスホーフェン、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>Leica HC PL APO 10x/0.4 CS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies GmbH, ダルムシュタット, ドイツ</td><td></td><td>ph 7,4 滅菌済み</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma Aldrich, ハンブルク, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>単一成分</td><td></td>で当社グループが製造 <td>90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, &rho;= 1,064 g cm-3</td></tr><tr><td>Percoll solution</td><td>GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>Eppendorf AG, ハンブルク, ドイツ</td><td></td><td>10&micro;L / 100&micro;L / 200&マイクロ;L/1000&micro;L</td></tr><tr><td>Pipettes serological</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>&nbsp;Cellstar2ml、5ml、10ml</td></tr><tr><td>ピペッティングヘッド</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetus</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol tube</td><td>Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>メトラーPM4800デルタレンジ、メトラー・トレドGmbH、Gie&szlig;en, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸引ユニット</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Germany</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 0,4 %</td><td>Sigma Aldrich, ハンブルク, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キャップ付きチューブ</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>15ml, 50ml Cellstar</td></tr><tr><td>キシラジン(2%)</td><td>Ceva Tiergesundheit GmbH、D&uuml;ドイツ、</td><td></td><td></td>ッセルドルフ</tr></tbody></table>

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

末梢動脈疾患と虚血性心疾患の治療の目的は、血行動態の狭窄による虚血性の領域への血流を増やすことです。血管手術は、痛み、重症虚血肢、または生活に大きな混乱を休むか、または作業の進行など手術の適応のない患者が選択した場合は、実行可能な選択肢は、彼らの病気を軽減するためのほとんどの可能性がありません。担保の形成の刺激による単球が強化された血流を介して細胞療法は、非侵襲的ないくつかのオプションの 1 つです。
当社グループは、後肢の虚血モデルを用いたマウスに単球移植後 arteriogenesis を調べます。以前は、破傷風刺激同系単球移植を使用して後肢灌流の改善を説明してきました。担保の形成に及ぼす影響、に加えて腫瘍の成長はこの療法にも影響が。これらの効果を調べるためには、大腿動脈の閉塞後マウスの側面に Engelbreth ・ ホルム群れ肉腫の細胞外マトリックスを注入することにより基底膜のようなマトリクス マウス モデルを使用します。
後人工腫瘍学、生体顕微鏡を使用して、生体内で腫瘍の血管新生と担保動脈内ホーミング球を検討します。以前の研究では、事後の成果物をその後の分析を前提とする動物モデルの組織学的検討を説明しています。我々 のアプローチ リアルタイム シーケンスで担保の領域に単球のホーミングを可視化する、実行するために簡単ですし、arteriogenesis と腫瘍血管新生の生体内のプロセスを調査。

生体顕微鏡を用いた腫瘍と単球によって引き起こされる血管成長の検討は、arteriogenesis と腫瘍血管新生の分子機構の新局面を明らかに助けることができます。セルは準備する必要があります、プロトコルの手順を慎重に使用を注入します。違いは単一の実験の間のバリエーションにつながります。単球は、静脈システム (図 1) 全身の効果を維持し、塞栓、動脈系の注入を行った場合に発生する可能性を避けるために注入する必要があります。
基底膜のようなマトリクスを使用する場合は、さらに組織学的検査のためプラグ植に役立つ分散を避けるためにゆっくりと注入 (図 2、 図 3)。マウスを犠牲にすることの後のような基底膜マトリックスのプラグはマウスの側面から仔が。基...

単球は、末梢動脈疾患のコンテキストでの arteriogenesis の重要な伝達物質です。単球のホーミングと腫瘍関連血管新生は、大腿動脈結紮マウスモデルにおける単球注入後基底膜のような行列と生体顕微鏡を使用して、このプロトコルを調査します。

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

こんにちは、クリスティアン・デフゲです。私はマグデブルク大学病院の医師であり、Herold博士とBraun-Dullaeus教授の心血管研究グループに所属しています。私たちは、側副血行路の発達の増強について研究しています。したがって、我々はイメージングを用います。このビデオでは、我々の手法について説明します。細胞を、密度 1×10⁶ cells/mL の無血清培地で再懸濁させてください。1 mMのDIOおよびジメチルホルムアミド5 µLを1 mLの細胞懸濁液に加え、慎重に再懸濁します。細胞溶液を37 °Cで20分間インキュベートします。細胞を500 gで5分間遠心分離します。上清を除去し、37 °Cに加温したFCS添加培地で細胞を再懸濁します。この工程を2回繰り返します。ノイバウエル血球計数器と光学顕微鏡を用いて細胞数を計測します。塩化ナトリウム溶液で細胞を再懸濁します。細胞を尾静脈に注射します。Matrigelマトリックスは、扁平上皮肉腫から抽出された再構成基底膜製剤です。本法では、血管内皮細胞ネットワークの形成、または血管新生抑制による抗がん治療のいずれかについて、テスト分子のスクリーニングを行います。細胞治療への利用を目指す単球の腫瘍血管新生能を再評価します。無菌条件下で、100 nanogram BFGF、300 nanogram VEGFA、および 26 international units heparinをMatrigelに添加します。溶液をボルテックスした後、1 mL インスリン用注射器に満たし、使用時まで氷上に保管します。皮下の Matrigel プラックをより鮮明に観察するため、マウスの注射部位の除毛を行います。鋭利なメスまたは除毛クリームを使用してください。動物を台の上に置き、脇腹の注射部位の隣にあるマウスの皮膚を保持します。Matrigelを500 µL皮下注射します。実用上の理由から、皮下での分散を避けるため、Matrigelを1箇所に凝集させて注射する必要があります。実験終了後にマウスを安楽死させた後の方が、組織からMatrigelマトリックスを除去しやすくなります。実験を開始する前に、塩化ナトリウム溶液を用いて単球の注入練習を行ってください。単球を全身的に投与できない場合、全身的な効果は得られません。本プロトコルでは、250万個の単球を注入しました。注入量は1gあたり5 µLを超えないようにしてください。処置の間、ヒートパッドを使用してマウスを保温させてください。細胞を全身投与するには、保定器、1 mL インスリン用注射器、30 G 針、および塩化ナトリウム溶液に再懸濁した単球が必要です。マウスを慎重に扱い、保定器で固定します。マウスが傷つかず、呼吸のための十分なスペースが確保されていることを確認してください。拘束具をヒーティングパッドの上に置き、尾がプレートに接触するようにします。感染を防ぐため、注射部位を必ず消毒してください。尾の外側に位置する尾静脈を確認します。尾を90度回転させ、尾静脈が尾の上側にくるようにします。単球溶液を緩やかな角度で注入するようにしてください。その後、全身性の副作用がないか、30分間動物を観察します。動物が完全に回復した後、マウスをケージに戻します。顕微鏡が安定状態に達し、ダミーを用いて設定の確認を行った後、麻酔をかけたマウスを予熱した顕微鏡ステージ上に置きます。足先を粘着テープで固定します。顕微鏡観察に使用する脚または側腹部の皮膚を消毒します。操作性を高め、被毛による妨げを避けるため、目的の領域を剃毛します。目的の領域は湿らせた状態に保ってください。そうしないと、画像と組織の品質が低下します。脚を2本の調節可能なステムの間に配置します。ステムの上にカバーガラスを置きます。顕微鏡を起動し、必要に応じて脚の位置を調整します。顕微鏡の設定は使用するソフトウェアによって異なります。詳細についてはプロトコルを参照してください。我々のデータは、生体内顕微鏡（イントラバイタル・マイクロスコピー）が、小動物モデルの血流内における移植モノサイトを可視化するための強力なツールであることを示しています。全身的な効果を維持し、動脈系への注入で起こりうる塞栓症を避けるため、モノサイトは静脈系に注入する必要があります。Matrigelを使用する場合、分散を避けるためにゆっくりと注入することで、その後の組織学的検討のためのプラーク摘出が容易になります。Matrigelプラグ内において、異なる実験条件下での毛細血管数をカウントすることにより、血管新生を測定することが可能です。生体内顕微鏡観察の結果は、組織学的検査によって検証できます。生体内顕微鏡観察で検出された単球は、すべての組織切片内で確認することができます。画像の取得に時間がかかる場合、血管内のrhodamine dextranの量が減少します。血管の視認性を高めるには、rhodamine dextranの投与を繰り返す必要があります。Matrigel上の細胞に対するポジティブプローブを使用することで、最適な設定を得るのに役立ちます。末梢動脈疾患または虚血性心疾患の治療目的は、血行動態学的な狭窄によって生じた血流不足に対し、他の灌流領域への血流を増加させることです。側副路形成の促進による単球強化灌流を用いた細胞治療は、手術適応のない患者にとって非侵襲的な選択肢となります。また、単球は虚血領域における側副動脈の発達だけでなく、腫瘍の増殖にも影響を及ぼす可能性があります。これらのプロセスを調査するために、私たちは生体イメージング（intravital microscopy）と組み合わせてMatrigel注入法を用います。本プロトコルの目的は、in vivoモデルにおいて虚血によって引き起こされる免疫学的プロセスを研究するための、簡便かつ効率的な方法を提示することです。この新しい手法を用いることで、死後筋肉組織の組織学的解析と比較して、より現実的な試験環境を構築することが可能になります。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

軟膜微小循環の時間的空間的血行動態および炎症性イベントに追従するように生体顕微鏡。...

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

このビデオでは、リポ多糖を腹腔内に注入したマウスモデルの腸間膜静脈における血液細胞と内皮の相互作用をリアルタイムで可視化する方法を示します。...

炎症マウスモデルにおける血球-内皮相互作用を分析するための生体内顕微鏡法

ここでは、血管の炎症や生きたマウスにおける血栓形成の間に活性化内皮上の異血小板、好中球の相互作用を可視化する蛍光生体顕微鏡の実験手法を報告する。この顕微鏡技術は、血管疾患の分子メカニズムを研究することが、病態生理学的な条件下での薬理学的薬剤をテストするためにも役立ちます。...

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

トランスジェニックレポーターマウスと注射可能な蛍光標識を使用することにより、長期の生体内スピニングディスク共焦点顕微鏡法は、ApcMin/+結腸直腸癌モデルにおける骨髄細胞の挙動を腸腺腫に直接可視化することを可能にします。...

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージングのApc最小/ +腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

この簡略化されたマウスの腸間膜静脈の生体内顕微鏡検査は、白血球-内皮および血小板-白血球の相互作用を観察するためのさまざまな炎症モデルで使用できます。...

マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

私たちは、麻酔をかけたマウスの生体内共焦点顕微鏡を使用して、定常状態および炎症条件下で腸間膜静脈の好中球と単球の挙動を監視するためのプロトコルを詳述しています。...

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

このプロトコルは細胞特異的蛍光マーカーを発現するトランスジェニック マウスの生体イメージングを説明します。生体イメージングは、プロセスの顕微可視化が可能な埋込型の windows...

腫瘍関連血管系を使用しての生体顕微鏡が背高度な蛍光トランスジェニック マウスの皮下脂肪のウィンドウの部屋

この原稿は、トランスジェニック レポーター マウスの使用は、アンジオテンシン II...

白血球ローリングとアンジオテンシン II に注入されたマウスにおける付着の可視化: 技術と落とし穴

マウスにおける高分子量(155kDa)デキストランの静脈注射を用いて、転移(TMEM)戸口機能および癌細胞イントラバシスの腫瘍微小環境に関連する一過性血管透過性を評価する2つの方法について述べた。この方法には、生きた動物におけるインビタルイメージングと免疫蛍光を用いた固定組織分析が含まれる。...

インビタルイメージングと固定組織解析を用いた癌細胞播種に伴う転移戸管媒介血管透過性の腫瘍微小環境の評価

白血球および血小板の動員は、動脈形成中の側副動脈の効果的な成長に必要な必須成分を構成する。多光子顕微鏡は、動脈形成中の白血球の動員と血管外漏出を研究するために、 in vivoで...

マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

本プロトコールは、FVBマウスにおいて後肢壊疽を誘導するための一酸化窒素合成酵素阻害剤の投与と大腿動脈動脈および静脈電気凝固を組み合わせた末梢動脈疾患のユニークで臨床的に関連するモデルを記載する。心臓内DiI灌流は、その後、足蹠血管系の高解像度、3次元イメージングに使用されます。...

マウス後肢壊疽モデルにおける足蹠血管系の高解像度3次元イメージング

学ぶ単球のホーミングと末梢動脈疾患マウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡観察法。Matrigelマトリックスと細胞標識を用いたリアルタイムイメージングにより、単球の動態と血管新生メカニズムを可視化する革新的アプローチを解説。

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

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