Name: 炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶ 肺炎球菌由来SP0092タンパク質の生化学的・構造解析手法。蛍光安定性アッセイとSEC-MALSで最適緩衝液とオリゴマー状態を同定し、X線結晶構造解析で原子レベル構造を解明する効率的プロトコルです。

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我々 は、クローニング、ジェンマ ハリス秒モールとビームライン I03、I04 ダイヤモンド光源での科学者のための支援のため OPPF 英国を認めます。

注: 信号ペプチドが削除されますコーディング シーケンスは次の標準的な融合のプロトコル pOPINF ベクトルでクローンとして作ら; ネイティブ蛋白質は 大腸菌 BL21 ロゼッタ細胞彼タグ融合で表されます 28, 29. メーカー 30 によると標準的な方法を次のバリアントをラベル セレノメチオニンを表現。SBP は前述精製組換え説明 31 , 32。
 1 生化学 <ol><li>熱 0 から 0.5 M まで 9.5 および NaCl 濃度 <ol><li>準備 48 緩衝溶液の pH は 4.0 からの試金をシフトし 96 ウェル プレートで 40 μ l を分注で説明したよう。テーブル 1 33.</li> <li>1-2 mg/mL の濃度で SBP ソリューションの各も 5 μ L を加える</li>。
		<li>蛋白質 (材料の表 を参照してください) の蛍光染色 x 20 の各も 5 μ L を加える</li>。
		<li>ピペッティングによるソリューションをミックス、透明な接着フィルムを使用してプレートをシール、室温で 112 x g で 2 分間スピンします</li>。
		<li>リアルタイム マシンで実験を実行: 10 秒保持時間で 99 ° C に 4 から 3 ° C/分の温度ランプを設定し、483 nm 励起と放射 568 ですべて 0.5 ° C 蛍光を読み取る nm</li>。
		<li>の派生物の最小値として溶融温度 (T m) を識別するすべてのバッファー状態の蛍光発光曲線分析します 。
		注: この手順は、最高の緩衝液タンパク質の安定性の改善を支援するための良い指標です。Ph と塩濃度の高い T m バッファー条件に基づいて選択し、グリセロールと 0.5 mM の 2.5% (v/v) を追加 tris(2-carboxyethyl) ホスフィン (TCEP) 次の手順 (秒バッファー) の緩衝液を定義します</li>。
	</ol></li> <li>MALS と分析秒 <ol><li>脱ろ過された水 (様々 な分子量 24 mL カラムを使用) で包装済みのゲル濾過のコラムの 2 列ボリューム洗浄を実行します</li>。
		<li>光散乱検出器にカラムを接続し、熱シフト試金から断固としたな秒バッファーとコラムを平衡させ</li>。
		<li>注入 100 μ 秒バッファーの釣合い秒列とフロー 1 列ボリュームに 5 mg/ml 精製 SBP</li>。
		<li>単一または複数のピークの溶出クロマト グラムを確認し、モル質量とすべての種の分散インデックスを取得、解析ソフトウェアを用いた散乱データを確認します 。
		注: すべてのピークは、オリゴマーの種に対応する、有益だ分散を確認するモル質量質量/モル質量の分子 (Mw/Mn) の数で加重の加重として指数が計算されます。分散値が 1 に近い単分散ピークを示します 。
		注: すべての重合種を定義した後、タンパク質濃度依存性の研究に有用高い濃度はより大きいオリゴマー形成を好むかもしれないです</li>。
		<li>複数分析秒動作する実行; 平衡ゲルろ過カラム (様々 な分子量 5 mL カラムを使用) に濃度 (0.1 - 10 mg/mL) 精製 SBP の 100 μ L を注入し、たび秒バッファーの 1 つの列のボリュームの流れ</li>。
		<li>単一または複数のピークの溶出クロマト グラムをチェックし、280 吸光強度を分析開始タンパク質濃度に対応する曲線の nm。別のピークの相対強度が一定である場合オリゴマーの種の間の相互変換が存在しません。異なる濃度の相対的強度の変化はタンパク質濃度に依存しているオリゴマー異種間相互変換の表示 。
		注: この評価手順は、結晶化に適している種を定義に不可欠です。確かに、個別単種、定義された濃度で安定したオリゴマーの状態にある場合は結晶になりやすい</li>。
	</ol></li></ol> 2。タンパク質の合成と結晶化 <ol><li>分取秒 <ol><li>1 列ボリューム後洗浄脱ろ過された水を持つ平衡秒バッファーと (広い範囲の分子重量 120 mL 分取プレパック ゲルろ過クロマトグラフィ列).</li>
		<li>5-50 mg/ml 精製 SBP の 1 ~ 5 mL を注入秒バッファーの平衡ゲルろ過カラムと流れ・ 1 列ボリューム</li>。
		<li>1 mL の一部分で列の流れを介して収集します</li>。
		<li>単一径のピークに対応する分数をプール; 1,500 g で 15 mL 遠心分離フィルターのサンプルをスピンし、目的の濃度に到達するまで濃度を定量化 (通常 50-100 mg/mL SP0092 のため).</li>
	</ol></li> <li>結晶化 <ol><li>メーカーの使用説明として前の結晶化テストを用いた結晶化実験の最適な濃度範囲を決定する: <ol><li>調剤 0.5 - 1.0 mL の 4 つの結晶化テスト24 ウェル リビングの別タンクのソリューションは結晶化プレートをドロップします</li>。
			<li>リザーバー溶液 1 μ L でのタンパク質溶液 1 μ L を混合することによって結晶化ドロップを準備、プレート、シールおよび (より信頼性の高い結果が一晩インキュベートした後) h 1 以上の室温でインキュベートします</li>。
			<li>は、それぞれの濃度は 10 倍の倍率の顕微鏡を使用してのドロップ品質を確認します 。
			注: テスト少なくとも 3 つの異なるタンパク質濃度: (I) ほとんどの残りの明確な低下を示すタンパク質は結晶化; あまりにも希薄(II) の滴の大半に重い沈殿物の存在意味、過度に高濃度明確な滴の沈殿物 (良いライト) (III) バランスのとれた発生テスト濃度は結晶化のために好ましい良い兆候です</li>。
		</ol></li> <li>結晶化プレート 96 ウェル リビング ドロップの準備; 各貯水池も 34 , 35 , の異なる商業結晶化溶液 100 μ L を分注 36, 37.</li> <li>結晶化ロボット システムを使用してすべての結晶化ドロップの井戸で以前に定義した濃度 (ステップ 1.1.6) で蛋白質のサンプルの分注 100 nL</li>。
		<li>別の貯水池の調剤 100 nL ソリューションに対応する結晶化ドロップ ステップ 2.2.3 でタンパク質と混合する井戸。蒸発を避けるために、貯水池、結晶化ドロップの平衡化を有効にすると結晶化プレート シールです</li>。
		<li>チェック (最初 1-2 日ごと、週後で) 定期的に値下がりしました 10 x を使用して (少なくとも) 結晶の形成と成長を評価する倍率顕微鏡 。
		注: 自動イメージング システム蛋白質結晶化するための可視化と削除キャプチャします</li>。
	</ol></li></ol> 3。結晶評価技術、x 線データ コレクション <ol><li>結晶マウント <ol><li>(初期の水の 25% を交換したがって結晶化条件にグリセロール (最終濃度) の 25% (v/v) を追加することによって凍結のソリューションの準備混合物) 38.</li>
		<li>泡を埋める液体窒素デュワーにユニ パックのサンプルのエンクロージャの一部の場所とデュワー。液体窒素の温度に冷却することを許可します</li>。
		<li>カット、シーリング テープ結晶化プレートからの結晶が形成されるドロップの上削除します</li>。
		<li>ターゲットのドロップの近くで coverslide に各種凍害保護液の 1 μ L の滴を配置します</li>。
		<li>磁気杖 39 , 40 にマウントされている背骨の標準ベースのナイロンのクライオ ループを使用して各種凍害保護ソリューション ドロップ元のドロップから選択した結晶を転送します</li>。
		<li>ユニ パック サンプル ホルダーの最初の空の位置にループを配置すること、液体窒素に凍結のドロップから結晶をすばやく転送します</li>。
		<li>(シーリング テープ カット ステップ) から繰り返して、すべての必要な結晶が収穫され、ユニ パック サンプル ホルダーに格納します</li>。
		<li>場所ユニ パック パックの杖を使用してユニ パックに基づいて、(液体窒素条件) ビームラインにパックを取る 。
		注意: 低温!</li>
		<li>クライオ トングとパックを使用してユニをロードするデュワー読み込みツール-puck(s) ビームライン サンプル チェンジャー ロボットにデュワー。ユニ パック サンプル ホルダーがサンプル ループ ホルダーをサンプル ロボットの直立したまま基本の蓋からデタッチ デュワー従って液体窒素に公開およびサンプル チェンジャー ロボットにアクセスします</li>。
	</ol></li> <li>結晶評価技術 注: どちらか実験室の x 線源を用いた回折品質やシンクロトロン放射光 (SR) x 線源で、収穫された結晶を選別しことができます。(MX) 高分子結晶構造解析ビームラインは、構造解析のための異常な回折を利用する調整可能なエネルギー源を提供します。次のセクションにダイヤモンド光ソース MX ビームラインの実験的機能に沿った作業指示書のシリーズを提案すると、しかし、これらのガイドラインは、世界中の他のシンクロトロンで MX ビームラインにも合わせることが。
	<ol><li>最初のステップとしていずれかを確認または結晶における異常散乱を識別すると便利です。これは便利な結晶からの x 線蛍光スペクトルを測定することによって実現できます。まずビームラインの x 線エネルギーは高分子結晶の通常予想されるすべての要素を刺激するには十分に高く設定されているを確認 (14 keV 以上).</li>
		<li>ビームライン制御ソフトウェアを使用してサンプル チェンジャー ロボットによるマウントするサンプルを選択します; ループは x 線ビームで自動的に中央揃えし、結晶の中心をビームライン制御ソフトウェアを使用して手動で確認できます</li>。
		<li>ビームライン制御ソフトウェアを使用して x 線蛍光スペクトルを記録する: ユーザーは、露出時間を選択し、測定が開始され (蛍光/蛍光スペクトル設定 &#8594; 実行すると、 図 2 a)。ビームライン制御ソフトウェアは、自動的に x 線の蛍光検出器を置き、蛍光検出器の読み取り可能な信号を取得する x 線フラックスの最小の事件を決定を配置します。得られたスペクトルが自然発生する装備の放出ピークで自動化された方法で分析され、生物学的要素。GDA (www.opengda.org) 当社、シンクロトロン ヨーロッパ 41 , 42 中ビームライン制御ソフトウェア グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) の内でこれらのルーチンがあります</li>。
		適切な要素が指定されている場合は <li>異常回折実験のために悪用される可能性が、結晶からの異常な回折データのコレクションの最適な波長を決定する x 線吸収端エネルギー スキャンを実行: ビームライン上制御ソフトウェア、要素を選択し、スキャンを開始 (蛍光/蛍光スキャン設定、&#8594; 原子名 &#8594; 実行すると、 図 2 b). 
		注: 単一の異常な回折実験異常散乱を最大限に吸収端のピークが使用されます。多波長異常回折実験に関する実験的考察は、以前詳細 43 きた</li>。
		クリスタル ユニット セルのパラメーター、対称性、および回折限界を決定する <li>振動法を用いた 45 ° 間隔で 3 つの x 線回折パターンの測定 (データ コレクション/スクリーニング &#8594; 現在、実行 図 2)。ビームライン制御ソフトウェアは、各種振動角と露光時間と x 線ビームの割合転送を設定する能力を持つユーザーを提供します。標準クリスタル スクリーニング振動角 0.5 度、0.5 s, と 5 %x 線ビーム伝送の露光時間が推奨されます。測定された回折像エドナ パイプラインによって自動解析し、完全なデータ セット 22 のコレクションのための戦略のセットを返します</li>。
	</ol></li> <li>X 線データ収集 注: 標準的な発振モードまたは時間, x 線量と同じ吸収動作約すぐ記録するフリーデル仲間を可能にする逆梁モードでデータを収集するユーザーを選択できます異常の違いのより正確な測定を許可します。異常な差が期待されておよび/またはサンプルは、異常な回折実験を行う放射線に敏感な場合は特に、後者は役に立つ。最高のデータ収集方法を使用する上の考慮事項が総合的に見直し 22 , 23 , 44 , 45 をされています。, 46, 47. <ol><li>ビームライン制御ソフトウェアを使用してインポートを提供する戦略プログラムが推奨する、データ コレクションのパラメーター: ω の回転軸の i. 開始位置 ii。各回折像の角度を ω 軸回転の振動幅 iii。各回折像の露出時間 iv。(直接データ コレクション全体の総 ω 軸回転角度で定義しない) 完全なデータセットのイメージの数 とびと放射線被害を避けるために x 線ビームの減衰の割合 (動) 注: 当院でのデータ コレクションを実行すると、収集したデータの自動化された処理のためのソフトウェア パイプラインは、確立されている: (i) 回折データ (インデックス付き、統合・拡張) 削減 xia2 パイプラインによってユーザーの反射 mtz ファイルを生成します。段階的に廃止し、構造のソリューション/洗練された 48 の入力として。(ii) 重大な異常信号が検出された場合、データ解析時に実験による重原子構造を解決しようとして、最初急速自動構造ソリューション (fast_ep) を使用してパイプライン発生してしまう段階、段階的な電子密度マップを提供可能であれば。2 番目のより包括的な構造ソリューション パイプラインは自動的に解決し、登録を構築する試みを引き受ける独立系ソフトウェア スイート 49 , 50 , 51 , 52; を使用して再これが成功した場合、ユーザーは、初期のモデルと電子密度マップで行われます。これはユーザーが絞り込みを完了し、選択した結晶構造解析ソフトウェア スイートを使用してモデルを検証するための基礎を提供します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

本稿では、記述し、肺炎球菌感染からの蛋白質に特定重点を置いて炭水化物 SBPs の生化学的および構造特性評価のための統合されたプロトコルを検証します。それにもかかわらず、異なった有機体から他の SBPs と他の関係のない水溶性の蛋白質の分析の標準的な手順としてこのこれを使用できます。
プロトコルの最初の部分は、タンパク質の安定性および蛋白質のサンプルの結晶化の準備のために利用できる第四紀構造に生化学的情報を提供に努めています。熱シフト試金のセクションでは、pH、NaCl 濃度変動この手順の一般的な性質を維持するためにのみについて説明します。それにもかかわらず、他の多くのバッファーの状態でテストできます同様に、たとえば、安定の添加物として使用される任意の化学化合物を含む: 特に特定 SBP に結合する実際の ligand(s)、Tを増やすことで非常に効果的な m少数の摂氏31で。いくつかのケースで変化曲線は、低信号または蛋白質の集合または部分的な展開によって引き起こされる高い蛍光バック グラウンドによる不十分な定義できます。これを避けるためには、蛋白質: 色素の滴定は不明の変化曲線を最適化するために実行できます。改善が得られない場合、蛋白質の安定性を改善することができます様々 な添加物をスクリーニングすることをお勧めしますと適切な画面は前述の54をされています。
通常、ほとんど SBPs は彼らの自然環境における単量体が示したとおり多量体形成の結晶化実験で使用されるより高い濃度で発生することが、こうして MALS と SEC によって提供される重合動作特性は結晶化のための最も有利な安定した単分散重合状態を評価するために不可欠であります。それにもかかわらず、それは蛋白質の重合に及ぼす結晶化条件に含まれている別の化学物質の影響を予測するは難しい。秒、MALS 試験には、蛋白質のサンプルの豊富な集計が表示されている場合は、この発生する可能性を減らすには、次をお勧め: (ない凍結融解) 新鮮なタンパク質サンプルを使用し、熱と安定化分析を展開ゲルシフト試金、集計を最小限に抑えるための最後のリソースとして可能な限り添加物および穏やかな洗剤をテストします。結晶化の高スループット疎行列商業結晶化スクリーニングを使用してこのプロトコルの一般的な性質を維持するための基本指針を提案します。ただし、繰り返し微調整沈殿の濃度、pH、温度、化学添加剤の添加について結晶化条件を最適化する必要があります高分解能 x 線回折によるタンパク質結晶を取得し、クリスタル ドロップと貯留層16,17の間変化する平衡ダイナミクスの他の要因します。
プロトコルの 2 番目の部分では、悲しい段階の異常データの集録に特定の焦点と x 線回折データ収集のための最適な戦略を定義するためにタンパク質結晶の特性について説明します。SBPs 維持と同様の一般的なアーキテクチャ (潜在的モデルの開始として使用可能な多くの堆積の 3 D 構造があると)、たとえこれらの蛋白質の分子置換法による段階的簡単ではありません常の変動のため、二次構造の要素は、これらの蛋白質の本質的な柔軟性。したがって、悲しい方法を提案し、, これらの蛋白質が既にが本質的にバインドされている金属または金属の実際に非特異的結合結晶化バッファー条件は、異常の回折要素の範囲を提供することができますから、強調表示、私たちの一般的なプロトコルの標準的なステップです。
結論としては、このプロトコルは、加速し同様、構造決定の成功率を高めるに悪用することができます SBPs の生化学的および構造的機能の詳細な説明を有効にするプロシージャの標準ガイド付きワークフローを定義します一般的に SBPs の構造キャラクタリゼーション。

肺炎球菌感染(肺炎)、中耳炎、肺炎、敗血症、敗血症を引き起こして通常無菌のニッチに移行する能力を持つヒトの気道の気道上部性感在住グラム陽性菌と髄膜炎1,2。また、肺炎球菌感染症は臨床的, 経済的負担世界3,4に貢献するコミュニティ-取得肺炎の主要な原因であります。肺炎球菌感染の抗生物質耐性菌の世界に広がっているし、7 価、13 価肺炎球菌蛋白結合型ワクチンに役立っていますが、置換系統の抗菌薬耐性の率を減らすワクチン使用は浮上しているし、肺炎球菌疾患5,6,7,8の新しい治療法の開発に研究のための需要の増加につながっています。
肺炎球菌は、炭素ソース9,10; としてホストから輸入糖に依存します。確かに 32 異なる炭水化物11,12,13の輸送にその輸入機械の 30% を充てています。これらの輸入業者には、少なくとも 8 つの ABC トランスポーター13が含まれます。ABC トランスポーターは、細胞外の SBPs はリガンドの特異性を決定し、セルの吸収における積分膜トランスポーターに提示で基本的な役割を果たします。表面タンパク質と細胞プロセスの重要な役割であるために、SBPs は新しいワクチンや抗菌剤の設計に有効なターゲットを表しています。
ターゲット プロテオミクス解析と配位子のポケットなど、ドメイン間の柔軟性の構造機能の詳細な説明は、構造基づかせていた薬剤の設計14,15便利なツールを提供します。X 線結晶構造解析は原子分解能、近くでタンパク質の構造解析に適した方法が、結晶化プロセスは予測不可能な時間がかかり、常に成功していません。体系的な方法は成功率を改善しているし、重要な要因は、サンプルの質と安定性。結晶化の成功率は、タンパク質化学的性質およびサンプル準備方法論によって影響されます。これらの効果を評価し、生化学16,17で通知できます。
構造設計の更なる合併症は、対処する必要があります結晶構造相の問題です。多くの蛋白質の構造が利用可能になったが、多くの構造は相同構造物18を必要とする分子置換法によって解決できます。SBPs は現在柔軟なドメイン構造、分子置換によって挑戦19はまた証明するかもしれない。ターゲット蛋白質に十分に似ている構造モデルが使用できない場合、テクニックの数を使用して、実験的位相20を取得できます。これらのうち、単一の波長異常分散 (SAD) メソッドは主要な手段として浮上しているし、21段階の問題を解決するために広く使用されています。悲しいメソッドを使用は、さらにハードウェア、ソフトウェア、検出と22,23,を段階的に廃止のため弱い異常信号の使用を許可するデータ収集方法の改善と進められている24. さらに、直接法の進歩で過去に原子分解能回折データに必要な高分子の構造を解決今、プログラムに実装されているたとえば、立体化学の知識を組み合わせることで利用できるためARCIMOLDO25。結晶構造解析の位相の問題を解決するための方法の有用なレビューは、テイラー26によって与えられます。
ここでプロトコルを提案合理化糖質輸送 SBP、肺炎球菌感染の SP0092 の生化学的および構造技術 (図 1) を統合します。このステップ バイ ステップのプロトコルは、一般に、SBPs の構造研究の成功率を改善するために生命のすべての王国にある戦略の有用な例のテスト _ ケースを提供します。特に、プロトコルは、迅速かつ効果的な方法で、ソリューションの蛋白質の最も安定したオリゴマーの状態を特性化の重要性を強調、結晶化実験のためのフォロー アップに最高の種を識別できます。以上 500 SBP 構造蛋白質のデータ ・ バンクの27の報告はありますが、分子置換はヒンジ領域19によって接続される 2 つの α/β ドメインの本来の柔軟な性質から難しい。したがって、プロトコルの 2 番目の部分で説明します SBPs で一般的なセレノメチオニンの定款及びセレン (Se) の使用である連結の金属イオンから段階的に悲しい方法を使用して悲しい段階的に廃止します。

<table><tbody><tr><td>セレノメチオニンミディアムコンプリート</td><td>分子寸法</td><td>MD12-500</td><td>L-メチオニンを除くグルコース、ビタミン、アミノ酸を補給した合成M9最小限の培地に基づいています。他の同等の製品は、他の会社によって市販されています。</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96ウェルプレート</td><td>Applied Biosystems</td><td>4306737</td><td>Applied Biosystems MicroAmp Optical 96ウェル反応プレート(バーコード付き)は、比類のない温度精度と均一性を提供するように最適化されており、迅速かつ効率的なPCR増幅を実現します。このプレートは、96ウェル形式の単一の硬質ポリプロピレン片から構成されており、Applied Biosystems&reg;96ウェルリアルタイムPCRシステムとサーマルサイクラー。</td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Molecular Probes</td><td>S6651</td><td>SYPRO Orange Protein Gel Stain は、1D ゲル中のタンパク質用の高感度ですぐに使用できる蛍光染色剤です。疎水性領域用の非常に普遍的で確立されたタンパク質色素です。</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学接着フィルム</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>Applied Biosystems MicroAmp 光学接着フィルムは、マイクロプレートに塗布すると、ウェル間の汚染やサンプルの蒸発の可能性を低減します。バックグラウンドが低いため、光学測定に最適です。</td></tr><tr><td>7500 Fast Real-time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4362143</td><td>Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System は、標準的な96ウェルフォーマットの高速サーマルサイクリングを可能にし、定量的リアルタイムPCRアプリケーションの実行時間を大幅に短縮し、約30分で結果を提供します。アップグレードキットは、フィールドサービスのインストールを通じて、標準の7500リアルタイムPCRシステムをFast Configurationにアップグレードするために利用できます。他のRT-PCR装置も使用できます。古いデータ分析ソフトウェアでは、データのエクスポートは容易ではありません。</td></tr><tr><td>Superdex 200 increase 10/300 GL カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL は、小規模(mg)分取精製におけるサイズ排除クロマトグラフィーや、分子量が 10,000 から 600,000 のタンパク質(抗体など)の特性評価と分析に適した汎用性の高いプレパックカラムです。高分解能生物物理学的手法に最適な分離。</td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II</td><td>ワイアット</td><td></td><td>DAWN HELEOSIIは、溶液中の高分子とナノ粒子の分子量とサイズの絶対特性評価のための最高のマルチアングル静的光散乱(MALS)検出器です。DAWNは、最高の感度、最も幅広い分子量、サイズ、濃度を提供し、能力強化のための構成とオプションモジュールの最大の選択肢を提供します。ワイアット以外の他社の他のMALS検出システムはテストされていないため、追加のフィードバックを提供することはできません。</td></tr><tr><td>Superdex 200 5/150 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906561</td><td>Superdex 200 は、生体分子の高分解能、小規模分取、分析分離用のプレパックサイズ排除クロマトグラフィーカラムです。Superdex 200は、分子量が10,000〜600,000の分子の分離範囲を備えています。ピーク分離は「増加」バージョンほど最適ではありませんが、このモデルは標準的な日常的な使用には理想的です。</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade は、高分解能分取ゲルろ過クロマトグラフィー用に設計されたプレパック XK カラムです。</td></tr><tr><td>24ウェル「ビッグ」シッティングドロップ結晶化プレート</td><td>MiTeGen</td><td>XQ-P-24S-A</td><td>24ウェル「ビッグ」結晶化プレートは、主にシッティングドロップ蒸気拡散技術によるタンパク質結晶スクリーニング、および結晶化条件の最適化に使用されます。それに手動操作および大きい蛋白質の結晶の成長を好む非常に大きい貯蔵所の井戸およびサンプル容器があります。さらに、その平らな表面は、透明なテープやカバースリップで簡単に密封できます。</td></tr><tr><td>PCT予備結晶化試験</td><td>ハンプトン</td><td>HR2-140</td><td>PCT予備結晶化試験は、結晶化スクリーニングに適したタンパク質濃度を決定するために使用されます。</td></tr><tr><td>96ウェル CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>6098xx</td><td>スクエアウェルプレートは、リザーバーごとに3つの結晶化ウェルを備えており、プレートあたり288個のサンプルをテストできます。一般的には、その四角いエッジがクリスタルの釣りを困難にするため、最初のスクリーニングにのみ使用されます。</td></tr><tr><td>ユニパック</td><td>分子寸法</td><td>MD7-601</td><td>ユニバーサルV1パック(ユニパック)は、世界中の自動サンプルマウントシステムの大部分で使用するためのサンプルピンストレージおよび輸送用コンテナです - ACTOR、SAM、CATSシステムなど(ダイヤモンド、ソレイユ、SPring-8、フォトンファクトリー、CLSIおよび米国全土)</td></tr>スタンダード<tr><td>フォームデュワー</td><td>分子寸法</td><td>MD7-35</td><td>直径5.7インチ、深さ2.8インチ、800mLの容量。</td></tr><tr><td>マウントされたCryoLoop - 20ミクロン</td>の<td>Hampton</td><td>HR4-955</td><td>直径20ミクロンのナイロンでマウントされたCryoLoops。これらのナイロンループは、中空のステンレス鋼MicroTubes&tradeに接着されています。これは、氷晶体解析手順およびX線データ収集中に結晶を取り付け、凍結、および固定するために使用されます。さまざまなサイズが存在し、長さを調整できます。それらは非常に用途の広いツールです。</td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>パックデュワーローディングツール</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-607</td><td>このツールは、ユニパックを分離してロボットデュワーにロードするために使用されます。テフロン管部分と金属棒部分の2つの部分で構成されています。</td></tr></tbody></table>

炭水化物輸送基質結合タンパク質 sp0092 の生化学的および構造特性

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

肺炎球菌(肺炎) の新しい抗菌薬やワクチンの開発は、多剤耐性株の急速な上昇を停止させるのに必要です。炭水化物基質結合タンパク質 (SBPs) 細胞局在と肺炎球菌の代謝、糖輸入の中心のため蛋白質基づかせていたワクチンと新しい抗菌薬の開発のための有望なターゲットを表すそれぞれ。ここで説明は、肺炎球菌や他の細菌から他の炭水化物 SBPs に延長することができます SP0092 の包括的な評価を実施する合理化統合プロトコルです。この手順は、蛋白質のこのクラスの阻害剤の構造設計を助けることができます。サンプルの均質性を監督し、多角度光散乱 (MALS) とサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) の安定性を最適化する熱シフト試金による生化学分析のためのプロトコルは、この原稿の最初の部分で提示結晶化試験などは、成功の確率を高めます。この手順の 2 番目の部分は、結晶化したタンパク質を解決する使用することができます測定データの可変波長異常回折放射光ビームラインおよびデータ コレクション プロトコルを用いた SBP 結晶の特性をについて説明します構造体です。

この統合されたプロトコルは 4 で成功する証明されている (公開 2 つおよび 2 つの未発表の構造) 6 炭水化物の肺炎球菌から標的タンパク質を結合までに32,53分析しました。このセクションでは SBPs の構造の研究を一般に導くための代表的な結果として SP0092 の生化学的および構造的性質を提案します。
浄化された蛋白質が熱シフト試金を使用してバッファーの安定性のため行った SBP SP0092 の表現および32を以前定義されている精製後: SP0092 展示増加 Tm ph 6.5 と塩化ナトリウムの存在下で 0 〜 0.2 M濃度範囲 (図 3 a)。この点を踏まえて、次の手順の緩衝液として定義されました: 0.02 M MES pH 6.5 0.2 M 塩化ナトリウム、グリセリン 2.5% (v/v)、0.5 mM TCEP。SP0092 の異なる重合状態の絶対モル質量が MALS 秒 187.2、140.8、97.0、49.4 kDa の分子量を測定 4 量体、三量体と二量体、単量体の種に対応する結合で測定した (それぞれ図 3 b)。異なるタンパク質希薄で秒プロファイルの解析が増加蛋白質の集中より大きいオリゴマーが通常で使用されるよりも高い濃度でより安定していることを示唆して、重合がトリガーされることを明らかにしました。結晶化。確かに、浄化された大きいオリゴマー種結晶化試験監督正常に作り出されたタンパク質結晶中にモノマー種はしませんでした。
ネイティブから得られた最適化された結晶と Se メチオニン SP0092 のフォームのラベルは、x 線回折により特徴づけられた.両方のケースで明らかにこれらの結晶からの x 線の蛍光性の測定はタンパク質だけ期待どおりに Se メチオニン結晶の Se が検出されました、バインドされている亜鉛放出ピーク。その後、Se と Zn 端 x 線吸収のスキャンを行い、異常信号を最大にする結晶 Zn または Se のそれぞれの x 線吸収端に入射 x 線の波長を調整する実験データを直接提示を提供します。結果データ (図 4 a-B) から得られる。
低伝送で 3 つの回折パターンを測定した後、完全な異常データ セットはエドナ (図 4) によって提案されたデータ収集戦略を使用して得られました。現在異常信号トリガー サブ構造を決定するビームライン自動位相パイプラインと派生した初期の実験段階に基づいて、生成初期マップ、モデル、その後、洗練された、検証することができます (図 4).
要約すると、技術の潜在的な落とし穴は、主に結晶の可用性と品質を中心と。タンパク質の安定性を改善するためにバッファー条件の最適化と同様に、ソリューションでは、1 つ以上のオリゴマーを識別するときに使用する蛋白質の最も適したオリゴマー状態の同定は、結晶化の障害のリスクを減らすことができます。ステージ。初期の段階で識別されるバインドされた金属イオンの使用を悪用することができます構造ソリューションをスピードアップし、分子置換メソッドが失敗したときにタンパク質をラベル セレノメチオニンの不必要な生産を避けるため。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg"> 
図 1。炭水化物 SBPs の生化学的および構造解析のためのワークフローの図。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg"> 
図 2。GDA の結晶評価技術.(A) GDA ビームライン制御ソフトウェアの x 線蛍光制御] タブのスクリーン ショット。(B) GDA の x 線エネルギー エッジ スキャン コントロール タブのスクリーン ショット。(C) GDA データ コレクション クリスタル スクリーニング] タブのスクリーン ショット。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg"> 
図 3。SP009239 491の生化学的解析します。(A) 3 D 曲面グラフが緩衝液の NaCl 濃度と pH の関数として SP009239 491の融解温度をプロットします。(B) 秒、MALS SP009239 491の結果。吸収 280 nm が青で表示されます。異なる重合状態のモルの固まりは赤で表示されます。(B) パネルは、32から変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg"> 
図 4。SP009239 491の構造キャラクタリゼーション。(A) と (B) x 線吸収エネルギー SP009239 491結晶 Zn と Se の端をスキャンします。ブルーとシアン、計算される f Zn と結晶を含む Se から測定された蛍光を示す ' と f"異常散乱分数、緑と赤、それぞれ。SP009239 491結晶からの x 線回折パターン (C) 例が収集されます。(D) SP009239 491ダイマー構造の表現の漫画します。1 つの単量体は、白い色と他のマゼンタ (残基 39-366) とバイオレット (残留 367-491)、および異常散乱原子、それぞれ Zn、Se、青とシアンのボールとして表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.1 M クエン酸 pH 4.0</td>
			<td>0.1 M クエン酸 pH 4.5</td>
			<td>0.1 M リン酸塩 pH 5.0</td>
			<td>0.1 M クエン酸 pH 5.5</td>
			<td>0.1 M Bis トリス pH 6</td>
			<td>0.1 M ADA pH 6.5</td>
			<td>0.1 M モップ pH 7</td>
			<td>0.1 M HEPES pH 7.5</td>
			<td>0.1 M イミダゾール pH 8.0</td>
			<td>0.1 M トリス pH 8.5</td>
			<td>0.1 M CHES pH 9</td>
			<td>0.1 M CHES pH 9.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0 M</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
</tr></tbody></table>			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
		
		<tr>
			<td>NaCl 0.1 M</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>食塩 0.2 M</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>塩化ナトリウム 0.5 M</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
			<td>40 Μ L</td>
		</tr>
	

表 1。熱シフト試金のためのバッファー組成物。

肺炎球菌から炭水化物基質結合タンパク質の豊富な生化学的および構造解析を実行するための合理化されたプロトコルが表示されます。

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

この手順の全体的な目標は、肺炎連鎖球菌由来の炭水化物基質結合タンパク質の生化学的および構造的特性評価です。この方法は、バッファーの安定性プロファイル、オリゴマー化状態、原子構造の同定など、基質結合タンパク質の教育研究に役立つ重要なデータを提供するのに役立ちます。この手順の利点は、基質結合タンパク質の結晶化および構造溶液の成功率を堅牢かつ簡単な方法で向上させることができるデータを提供することです。まず、pH範囲が4.0〜9.5、塩化ナトリウム濃度が0〜0.5モルの範囲の48種類の緩衝液を調製します。各溶液の40マイクロリットルを96ウェルプレートに分注します。選択した基質結合タンパク質の精製溶液を得る。各ウェルに5マイクロリットルのSBP溶液を加えて、1ミリリットルあたり1〜2ミリグラムの濃度にします。次に、20倍濃縮された蛍光染色液を5マイクロリットルずつ各ウェルに加えます。ピペッティングで上下に動かして溶液を混合します。プレートを透明粘着フィルムで密封します。プレートをGの112倍にして室温で2分間遠心分離します。リアルタイム PCR システムを、10 秒のホールドタイムで 1 分あたり 3 度の速度で摂氏 4 度から 99 度まで上昇するように設定します。半度ごとに蛍光を読み取るようにシステムを設定します。蛍光フィルターの設定を行います。をクリックし、サンプルを割り当てます。実験を実行し、融解温度が最も高いバッファー条件を特定します。次に、選択したpHと、2.5体積%のグリセロールと0.5ミリモルのTCEP濃度を含む塩化ナトリウム濃度の緩衝液を調製します。精製したSBPを、マルチアングル光散乱を用いた分析サイズ排除クロマトグラフィーで特性評価します。結晶化に適した最も安定した分子種を特定し、前処理SECを使用してそれらの分子種の純粋な画分を取得します。結晶化前試験を実施して、結晶化に最適なタンパク質濃度を決定します。結晶化ロボットシステムを使用して、目的の市販の結晶化溶液を光学式96ウェルシッティングドロッププレートの溶液リザーバーに分注します。次に、システムを使用して、100ナノリットルのタンパク質溶液を各結晶化液滴ウェルに分注します。各結晶化溶液100ナノリットルを貯留層ウェルから対応するウェルドロップに移します。プレートを光学接着フィルムでシールします。顕微鏡または自動イメージングシステムを使用して、2週間は1〜2日ごとに、その後は週に1回、結晶の形成と成長を評価します。十分に大きく、良好な形状の結晶が形成されたら、凍結保護剤として機能するグリセロールの25体積%を追加で結晶化溶液のバッチを準備します。次に、フォームデュワーに液体窒素を入れます。ユニパックサンプルエンクロージャーを液体窒素に浸し、エンクロージャーを冷まします。次に、目的の結晶を含む一滴の上でフィルムを切り取ります。0.5マイクロリットルの凍結保護剤を、液滴の近くまたは可能な場合は同じ条件の空の液滴チャンバーにカバースライドに堆積させます。SPINE標準ベースに取り付けられたクライオループを磁気ワンドに取り付けます。クライオループを使用して、目的の結晶をクライオプロテクタントの滴下に移します。次に、クライオループを使用して、結晶をクライオプロテクタントから水中のユニパックサンプルエンクロージャの最初の空の位置に移します。このプロセスを繰り返して、追加のクリスタルを収集します。目的のすべての結晶をサンプルエンクロージャーにロードしたら、パックワンドを使用してユニパックベースプレートをエンクロージャーに置きます。液体窒素中のユニパックをビームラインに輸送します。クライオトングとパックデュワーローディングツールを用いて、ユニパックをビームライン試料チェンジャーデュワーに装填し、試料筐体を取り外してください。次に、ビームラインソフトウェアでサンプルを選択してロードし、サンプルをX線ビームの中央に自動的に配置します。X線蛍光スペクトルを取得し、異常回折実験に使用できる元素を特定します。X線吸収エッジエネルギースキャンを実行して、異常な回折データを収集するための最適な波長を決定します。次に、標準発振モードで45度間隔で3つのX線回折パターンを取得し、結晶単位セルのパラメータ、対称性、回折限界を自動的に決定します。推奨データ収集パラメータをビームラインソフトウェアにインポートし、必要に応じて単一または多波長の異常回折実験を実施します。さまざまな塩緩衝液中の基質結合タンパク質SP0092の安定性を評価して、最適な緩衝液を特定しました。最も高い融解温度は、pH が 6.5 で、塩化ナトリウム濃度が 0 から 0.2 モルの範囲のバッファーで見られました。この手順には、pH 6.5、塩化ナトリウム濃度0.2モルの緩衝液を選択しました。SP0092のさまざまなオリゴマー化状態を同定し、SEC-MALSで分離しました。さまざまなタンパク質濃度でのSECプロファイルの解析では、タンパク質濃度の増加がオリゴマー化を引き起こすことが示され、より大きなオリゴマーは高濃度でより安定していることが示唆されています。これと一致して、大きなオリゴマーは結晶化試験で結晶を生成しましたが、モノマーは生成しませんでした。未変性結晶とセレノメチオニン標識SP0092結晶の両方の蛍光X線は、両方の形態でタンパク質に結合した亜鉛を示しました。異常な信号は、入射X線の波長を亜鉛またはセレンのいずれかのX線吸収端に調整することにより最大化されました。その後、完全な異常データセットを取得し、異常シグナルの存在によってトリガーされた自動解析により、タンパク質構造の初期マップを生成しました。これらの初期マップに組み込まれたモデルは、最終的なモデルを生成するために改良および検証されました。このビデオを見れば、基質結合タンパク質や潜在的なタンパク質ターゲットの包括的な構造特性評価を完了する方法について十分に理解できるはずです。この技術の意味は、ミロコックス性疾患の新しい治療法の開発にまで及び、このクラスのタンパク質に対する阻害剤の構造ベースの設計に基本的な洞察を提供します。これらの方法は、他の生物由来の基質結合タンパク質にも適用でき、あらゆる種類のタンパク質に使用できる可能性があります。

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Research

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