Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス
2019年1月7日
Thy1で二国間一次体性感覚 corticies (S1) 上記デュアル光学窓から神経細胞の活動を測定するための実験手順について述べる-2 光子 (2 P) 顕微鏡による生体内でを使用して GCaMP6s トランスジェニック マウス。
この方法は、マウスの両側皮質領域全体の神経活動を、生体内で長期間にわたって記録および定量化することが可能である。この2つの光子技術は、長期間にわたって大きなニューロン集団または分散したニューロン集団において同時に活性を検出するという利点を有する。この技術の意味は、生きている脳の異なる領域で定義された神経集団の活動パターンの調査に及んだ。
処置を開始する12時間前に、70%エタノールで50°Cで光学窓を温めます。光学窓は、直径5ミリメートルの丸い上部カバーガラスと、直径3ミリメートルの丸いカバーガラスを含む底部から構成されています。温暖化インキュベーションの終わりに、麻酔をかけた20〜25グラム1 1/2〜2 1/2ヶ月齢のThy1 GCaMP6sマウスのつまみつまみに対する応答の欠如を確認し、動物の目に軟膏を塗布する。
無菌ドレープで覆われた加熱パッドの上にマウスを置き、マウス用のヘッドホールディングアダプタを使用してヘッドを安定させる。頭皮の大部分を二重端カミソリで剃り、シーケンシャルな無菌アルコール調製パッドとポビドネヨウ素溶液スクラブで露出した皮膚をきれいにします。その後、はさみのペアを使用して、頭蓋骨の右側の頭皮に3ミリメートルカット長方形の2を作ります。
綿棒を使用して、皮膚を脇に押し出して直径3ミリメートルを超える露出領域を作成し、鈍い微小外科ブレードを使用して頭蓋骨に取り付けられた結合組織を穏やかに取り除きます。歯科ドリルでは、S1エリアの周りに直径3ミリメートルの円を静かにマークします。頭蓋骨の左側に同様の円を作った後、シアノクリレートスーパーグルーの薄い層を骨の両側に塗布し、歯科用セメント塗布のベースを提供します。
解剖顕微鏡の下で、高速マイクロドリルを使用して、S1領域の周りの頭蓋骨の右側にある円形の溝を薄くして滑らかなエッジを作成し、必要に応じて真空で骨の破片を吸引します。約2/3の骨深さが達成された後、円形の骨のフラップが周囲の頭蓋骨から完全に解放されるまで、骨の残りの1/3をゆっくりと慎重に薄くする。5/45鉗子のペアを使用して、円形の骨片をゆっくりと慎重に取り除き、硬膜を露出させ、パイル容器を損傷しないように注意してください。
同じように頭蓋骨の左側から骨フラップを取り除いた後、頭蓋骨の右側の光学窓を滅菌生理食い物ですすみ、ステレオ顕微鏡で不完全性がないか確認します。脳脊髄液の存在下で、頭蓋骨の上部分と頭蓋骨開口内の底部に置いた開頭蓋骨と底部に光窓を設置します。シアノアクリル酸スーパーグルーを使用して、光学窓の端の上部を頭蓋骨に密封します。
接着剤が乾燥したら、ガラスの端に黒い歯科用セメントを塗布し、露出した頭蓋骨の右側の残りの部分、および傷のマージンを光を遮断します。その後、左光学窓をインストールし、動物が完全な債務まで監視して回復できるようにします。処置の7~10日後、麻酔動物を2光子顕微鏡下の加熱パッドのヘッドホールディングアダプタに入れ、顕微鏡の光学窓と右側の頭蓋骨の右側が顕微鏡の光軸に垂直に向くように注意する。
4倍の倍率で明視野照明を使用して、頭蓋窓の初期参照マップ画像を取得します。同じ対象領域の複数の画像を取得した後、左半球のS1領域内のカルシウムダイナミクスを画像化し、頭蓋骨の両側の関心領域ごとの蛍光の変化を計算します。これらの代表的な画像では、EGFP発現マウス内の樹状突起および血管を、光学窓の設置の翌日にS1領域の層2の異なる深さで可視化した。
Z投影画像は、光学窓移植後1日目と7日目に撮影され、実験期間中の樹状枝および脊椎の数と位置が著しく安定していることを示した。Thy1 GCaMP6sトランスジェニックマウスにおける細胞内カルシウム過渡性の測定により、ピアの下500マイクロメートル以上の深部に位置する5つの錐体ニューロンの自発的なカルシウム活性と集団の定量化と、時間の経過にとらえた自然応答の平均数の計算が可能になります。頭蓋窓調製と生体内2光子カルシウムイメージング技術の両方で訓練を受けた研究者は、頭蓋骨の両側の100〜200ニューロンの記録を1日あたり1〜2匹の動物で得ることができるべきである。
この方法は、頭蓋骨の両側に開いた光学窓を使用して、対称哺乳類の脳領域全体の神経活動を記録し、生体内での長期かつ安定したカルシウムイメージングを可能にする。この方法はまた、末梢または中枢神経系への一方的な傷害後の皮質活性および可塑性を研究するために使用することができる。このビデオを見た後、Thy1 GCaMP6sトランスジェニックマウスで2光子顕微鏡を使用してカルシウムダイナミクスを測定するための両側頭蓋窓を設置する方法をよく理解する必要があります。
概要
この記事では、デュアル光学ウィンドウと二重光子顕微鏡法を用いてThy1-GCaMP6sトランスジェニックマウスの神経活動を測定する方法について説明します。この技術により、両側一次体性感覚皮質にわたる神経活動の長期的なin vivo記録が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 神経イメージング
- カルシウムイメージング
背景
- 二重光子顕微鏡法により、大規模な神経細胞集団の活動を同時に検出できます。
- この方法は、特定の神経細胞集団の活動パターンを研究するのに適しています。
- Thy1-GCaMP6sマウスは神経細胞のカルシウムダイナミクスの可視化に使用されます。
- 記録技術は、傷害後の皮質活動を評価するために適用できます。
研究の目的
- in vivoイメージング用の頭蓋窓の設置のための詳細なプロトコルを提供すること。
- 皮質ニューロンの自発的カルシウム活動の定量化を可能にすること。
- 生きた脳組織における神経細胞ダイナミクスの研究を促進すること。
使用された方法
- 光学ウィンドウの準備と開頭術の手術。
- 一次体性感覚皮質上の光学ウィンドウの設置。
- カルシウムダイナミクスのイメージングのための二重光子顕微鏡法。
- 神経活動を定量化するための蛍光変化の分析。
主要な結果
- 時間の経過に伴う樹状突起分枝と脊椎の安定なイメージング。
- 1日に100から200のニューロンから記録する能力。
- 層5のピラミッドニューロンにおける細胞内カルシウムトランジエントの発現量。
- 傷害後の皮質可塑性を研究するのに適用可能な方法。
結論
- デュアル光学ウィンドウ法により、効果的なin vivoカルシウムイメージングが可能になります。
- この技術は、皮質における神経活動の理解を向上させます。
- 脳機能と可塑性の研究に価値あるツールを提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables prolonged, stable in vivo imaging of neural activity across symmetric brain regions, supporting target validation in neuroscience drug discovery. By quantifying calcium dynamics in defined neuronal populations, it provides mechanistic de-risking for CNS-targeted therapeutics. The bilateral imaging capability enhances predictive confidence in pathway modulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring spontaneous calcium activity in layer five pyramidal neurons.
- Operational Value: Supports functional target validation through stable imaging of dendritic structures over 7 days.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by quantifying intracellular calcium transients in deep cortical neurons (>500 µm).
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation via dual optical window implantation.
- Quantitative Output: Enables fluorescence change calculations from regions of interest for activity quantification.
- Scalability: Allows recording of 100–200 neurons per side per day in 1–2 animals.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studying cortical activity and plasticity after unilateral peripheral or central nervous system injury.
- Translational Continuity: Connects discovery imaging to preclinical validation of neuronal dynamics in living brain tissue.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by stabilizing imaging of dendritic branches and spines over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology through hypothesis testing and pathway clarification in symmetric cortical regions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantification of neural activity in bilateral S1 regions.
- Screening: Delivers assay readiness via stable calcium imaging windows for prolonged in vivo recordings.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence measurements to compare conditions across hemispheres.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling post-injury cortical plasticity studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal neural activity monitoring across studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through quantification of spontaneous calcium activity.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via stabilized dendritic imaging over experimental periods.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling mechanistic de-risking of CNS targets.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via longitudinal neural activity tracking in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cranial window preparation and in vivo two-photon calcium imaging.
- Needs instrumentation for two-photon microscopy and surgical tools for bilateral craniotomy.
- Demands cross-team standardization for optical window installation and fluorescence analysis.
- Involves adaptation considerations when applying to other brain regions beyond S1.
- Limited by the need for postoperative recovery period (7–10 days) before imaging.
