Name: In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぼう、ミトファジーのin vitroおよびin vivo検出法を。ヒト細胞、Caenorhabditis elegans、マウスを用いたロバストな測定技術により、神経変性疾患や老化研究におけるミトコンドリア機能異常の理解と新規治療戦略の開発に貢献します。

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Mt 桂馬プラスミドを共有、宮脇敦史博士と博士リチャード j. もちろん感謝、mt 桂馬は Hela 細胞を統合します。原稿の重要な読書、Raghavendra a. Shamanna と博士デボラ ・ l ・ croteau さんに感謝します。この研究は、NIH (VAB) の学内研究によって支えられた、2014-2015 と同様、高齢化、国立研究所と 2016-2017 NIA の内研究室 (EFF、VAB) を付与します。EFF は HELSE SOR OST RHF によって支えられた (プロジェクト No: 2017056)、ノルウェーの研究評議会 (プロジェクト No: 262175)。
著者の貢献:
EFF は、原稿を設計し、下書きを準備KP、NS、EMF、RDS、ジャンパー スカート、SAC、YH、エドを書いた用紙の別のセクションNT、JP、HN、VAB 原稿し、専門知識を提供します。

<ol><li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+DNA+damage+signalling+to+mitochondria+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).</li>
<li>Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+the+mitochondrial+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protecting the mitochondrial powerhouse.</a> Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).</li>
<li>Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/molecular-cell/pdf/S1097-2765(16)00081-2.pdf">The Mitochondrial Basis of Aging.</a> Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).</li>
<li>Shadel, G. S., Horvath, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+signaling+in+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis.</a> Cell. 163 (3), 560-569 (2015).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
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<li>Kerr, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+Alzheimer%27s+Disease%3A+Cellular+and+Molecular+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms.</a> Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).</li>
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<li>Kerr, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+Alzheimer%27s+disease%3A+cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms.</a> Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).</li>
<li>Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+autophagic+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of autophagic activity in mammalian cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).</li>
<li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li>
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<li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mitophagy+in+XPA+via+PARP-1+hyperactivation+and+NAD%28%2B%29%2FSIRT1+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction.</a> Cell. 157 (4), 882-896 (2014).</li>
<li>Diot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+quantitative+assay+of+mitophagy%3A+Combining+high+content+fluorescence+microscopy+and+mitochondrial+DNA+load+to+quantify+mitophagy+and+identify+novel+pharmacological+tools+against+pathogenic+heteroplasmic+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA.</a> Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).</li>
<li>Schiavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-Starvation-Induced+Mitophagy+Mediates+Lifespan+Extension+upon+Mitochondrial+Stress+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans.</a> Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).</li>
<li>Sargsyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+parallel+measurements+of+macroautophagy+and+mitophagy+in+mammalian+cells+using+a+single+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor.</a> Sci Rep. 5, 12397(2015).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltun%2C+ZF+%22WormAtlas%22">WormAtlas</a>. , (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Mitophagy+Monitoring+in+Caenorhabditis+elegans+to+Determine+Mitochondrial+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).</li>
<li>Palikaras, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Mitochondrial+Selective+Autophagy+in+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).</li>
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<li>Eiyama, A., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+Mitophagy+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assays for Mitophagy in Yeast.</a> Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).</li>
<li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).</li>
</ol>

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Mitophagy の正確な測定は技術的に要求しています。ここでは、我々 は mitophagy の両方の定性的検出と最も一般的な実験室の実験モデルで mitophagy レベルの定量化を可能にする堅牢な手法を提示しています。
レプリケート可能なデータを取得するには、少なくとも 3 つの生物学的繰り返しで実験デザインが必要です。実験や解析に関与するすべての研究者は、実験グループの id に盲目にする必要があります。さらに、映像分野選ばれなければならないランダムに画像取得中。細胞培養および線虫の研究は、生物学的に少なくとも 3 つの繰り返しを実行してください。Mt 桂馬マウス研究は、統計的有意性を達成するためにマウスの十分な数を使用することをお勧めします。哺乳類セルの各実験のための 30-100 個の細胞を分析し、少なくとも 3 つの実験を実行します。品質管理の手順でにより、レプリケート可能な結果です。酵母における mitophagy の検出は最近要約他25。
M...

Mitophagy は、ミトコンドリアのメンテナンスは欠かせません。ミトコンドリアは複数の細胞シグナル伝達経路が交差して普遍的な細胞内小器官カルシウム恒常性1,2,3、 、細胞の代謝、細胞のエネルギー生産を担当4. ミトコンドリア絶えず、活性酸素種 (ROS) やミトコンドリア毒性など内因性と外因性の源からの課題,「高齢者」および機能不全のミトコンドリアの生成に 。傷害ミトコンドリアの蓄積は有害な活性酸素の量を増加させながら ATP 生産効率を低下させる、広告、代謝性疾患など加齢に伴う疾患にリンクされていると PD1,5,6.誘導ミトコンドリア細胞機能障害を防ぐためには、細胞に必要な特に認識してミトコンドリアを損傷し効率的に細胞プロセスを削除するはミトコンドリア オートファジー (mitophagy) と呼ばれます。これは mitophagy の健康の重要性を実証し、病気が mitophagy を検出する正確かつ効率的な方法の必要性を示していますの in vitroとin vivoの両方。
Mitophagy は、多くのタンパク質やタンパク質複合体5,7、8を含む複数段階のプロセスです。簡単に言えば、破損したミトコンドリアがまず認識および9,10膜、小胞体、ゴルジ複合体、核、またはミトコンドリア自体から起きることができる二重機能を担った phagophore によって包まれています。球状 phagophore を延長し、最終的にミトコンドリア ミトコンドリア オートファゴソーム (mitophagosome) を構成する内部のシールします。Mitophagosome、劣化、破損したミトコンドリアは劣化とリサイクル7、8autolysosome の形成のリソソームと融合しています。Mitophagy にも関与する主要なオートファジー蛋白質を含める: オートファジー関連 7 (atg 7生) と Beclin1 (開始)、Microtubule-Associated 蛋白質 1A 1B 光チェーン 3 (LC3 II) ( C. elegans で LGG-1) と p62 (phagophore のコンポーネント) とリソソーム膜糖タンパク質 2 (LAMP2)6,7。また、mitophagy、PTEN による推定のキナーゼ 1 (ピンク 1)、Parkin1、核ドット蛋白質 52 kDa (NDP52)、BCL2 の相互作用蛋白質 3 のような (炎の使い手ニクス/BNIP3L) (DCT 1線虫)、緑内障などにユニークないくつかの重要な蛋白質があります。他の人の間で5,6,11。
オートファジーのレベルの変化を検出する共通の方法は LC3-II/LC3 I または II/LC3 アクチンの比です。ただし、この方法は非特異的、この比率の増加は、増加の開始またはリソソーム12mitophagosome の障害の融合を反映可能性があります。(例えばLC3) のオートファジーのマーカーおよびミトコンドリア蛋白質 (例えばTranslocase の外側ミトコンドリア膜 20 (TOMM20、プロテアソームによって低下する可能性があります)) 間の共存を評価する別の方法です。ただし、合計 mitophagy レベルの変化を示すだけことができます、手順を区別できないどの閉塞で発生します。これは並列 mitophagosomes の蓄積を引き起こすライソゾーム阻害剤 (例えばE64d + ペプスタチン A EP と呼ばれる) を使用して明らかにすることができます。ベースラインで mitophagosomes の数と次の EP と治療 mitophagosomes の数の違いは、mitophagy を示すことができます。これらの制限は、新規 mitophagy 検出技術の開発を求めています。人間の病気の広いスペクトルの mitophagy の増加の関連性の観点から研究者の役に立つかもしれないいくつかの堅牢な mitophagy 検出手法を提案する.我々 は両方の in vitroとin vivoのテクニックをカバーし、mitophagy の変更を確認する複数のテクニックを組み合わせることをお勧めします。

<table><tbody><tr><td>mt-Keima mouse</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent</td><td>Thermofisher</td><td>#11668027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>#31985062</td><td>無血清培地</td></tr><tr><td>mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima</td><td>addgene</td><td>#72342</td><td></td></tr><tr><td>COXII 抗体 (マウス)</td><td>abcam</td> <td>#ab110258</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 抗体 (ウサギ)</td><td>波長</td><td></td> 568 nm の赤色蛍光タンパク質 (RFP) の NOVUS <td></td></tr> #CD107b <tr><td>ヤギ抗ウサギ</td>サー<td>モフィッシャー</td> <td>#Z25306</td> 波長 488 nm の緑色蛍光タンパク質 (GFP) の <td>Alexa Fluor 568 色素</td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗マウス</td>サー<td>モフィッシャー</td> <td>#Z25002</td><td>Alexa Fluor 488 色素</td></tr>は <tr>DAPI <td>Invitrogen</td> <td>で金色褪色を延長</td>します <td>#P36931</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>SIGMA Corning Costar</td> <td>#CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>4ウェルチャンバースライド</td><td>THermofisher, Nunc Lab-Tek</td><td>#171080</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F 96-well plate</td><td>Thermofisher</td><td>#152038</td><td></td></tr><tr><td>LC3B antibody rabbit</td><td>NOVUS</td> <td>#NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>DNA antibody</td><td>Progen Biotechnik</td> <td>#anti-DNA mouse monoclonal,AC-30-10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サーモフィッシャー</td> <td>#D1306</td> DAPI IN付き<td>退色防止封入剤</td></tr><tr><td>セルアナライザー(蛍光リーダー) GE</td><td>ヘルスケアライフサイエンス</td> <td>#IN セルアナライザー 2200</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000e 共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td> <td>#TE-2000e</td><td></td></tr><tr><td>共局在ソフトウェア</td><td>Volocity</td> <td>#Volocity 6.3</td><td>代替 Zeiss ZEN 2012 ソフトウェア</td></tr><tr><td>IN Cell Investigator Software</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>#28408974</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養培地</td><td>Thermofisher</td> <td>#DMEM&ndash;Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermofisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#12003C-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture Incubator</td><td>Thermofisher</td> <td>#Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio Imager Z2</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>オリンパス</td><td></td><td>オリンパス DP71</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td> ツァイス <td>Axio Observer Z1</td></tr><tr><td>共焦点ソフトウェア</td><td>ツァイス</td><td></td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>Image J</td><td>共局在解析など</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>統計解析ソフトウェア</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td><td></td><td>ワームピックを作るためのGraphPadプリズムソフトウェアパッケージ</td></tr><tr><td>材料</td><td>Surepure Chemetals</td><td>#4655</td><td>ピックは30ゲージ90%プラチナ10%イリジウムワイヤー</td></tr><tr><td>で作られていますIR:N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]</td><td>Tavernarakis Nektarios</td><td></td> への材料照会 <td>トランスジェニック動物を 20 °C に維持します。C</td></tr><tr><td>IR:N2;Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]</td><td>Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pmyo-3 TOMM-20::Rosella</td><td>への資料照会 Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pdct-1 DCT-1::GFP</td><td>資料照会 Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pmyo-3 DsRed::LGG-1</td><td>Tavernarakis Nektarios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraquat ソリューション</td>への材料照会 準備 <td></td><td></td>M9 バッファー<td>の補足データを参照</td></tr><tr><td></td><td>M9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-レバミゾールバッファー</td>の準備<td>の</td><td></td><td></td>補足データを見る</tr> ガラス<tr><td>顕微鏡スライドとカバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td> <td>#B9992000 ック</td><td></td></tr><tr><td>外科用鉗子</td><td>STERIS アニマルヘルス</td><td>19ピース 犬用避妊去勢手術パック エコノミー</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>19</td><td>ピース 犬用避妊薬パック エコノミー</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>サーモフィッシャー</td> <td>#AM9625</td><td>10x PBSはddH2Oシェーカーを使用して1x PBSに希釈する必要があります</td></tr><tr><td></td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>#11-676-178</td><td>Thermo Scientific MaxQ HP 卓上軌道小型オープンエアプラットフォームシェーカーパッケージ</td></tr><tr><td>2% アガロースパッド</td><td>準備</td><td></td><td></td>のための補足データを参照</tr><tr><td>Vibrosliceブレード</td><td>ワールド精密機器</td> <td>#BLADES-2</td><td>片刃</td></tr><tr><td>金属板</td><td>MSC</td><td>#78803988</td><td>厚さ 0.012 インチ x 幅 6 インチ x 長さ 12 インチ、430 ステンレス鋼板</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>洗剤</td></tr><tr><td>メチルビオロゲン二塩化物水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#856177</td><td>paraquat</td></tr><tr><td>線虫用インキュベーター</td><td>AQUALYTIC</td><td></td><td>インキュベーター 20 &deg;C</td></tr><tr><td>解剖実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>線虫用(ステップ2)</td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager Z2</td><td>線虫用(ステップ2)</td></tr><tr><td>UV架橋剤</td><td>Vilber Lourmat</td><td>BIO-LINK &ndash;BLX-E365</td><td>UV光源; 356 nm</td></tr></tbody></table>

in vitroとin vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス mitophagy の

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

ミトコンドリアは細胞の強豪であり、ATP の形で細胞のエネルギーを作り出します。ミトコンドリアは、生物学的老化、代謝性疾患、早期老化症候群とアルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD) などの神経変性疾患を含む疾患のさまざまな貢献しています。ミトコンドリアの健康維持は、ミトコンドリア生合成と mitophagy を介して機能不全のミトコンドリアの効率的な通関に依存します。動物モデルで特にオートファジー/mitophagy を正確に検出するための実験方法は、開発に挑戦されています。Mitophagy の分子機構の理解に向けての最近の進歩は、新しい mitophagy 検出技術の開発を可能にしました。ヒトの細胞、線虫mitophagy を監視するいくつかの汎用性の高いテクニックをご紹介 (例えばローゼラと DCT 1/LGG-1 系統)、およびマウス (mt 桂馬)。クロス種の評価を含む、これらの mitophagy 検出手法の組み合わせが mitophagy 測定の精度の向上し、健康および病気の mitophagy の役割の理解に 。

ひと細胞における Mitophagy の検出:
ここに示す手順を使用して、人間の HeLa 細胞は mt 桂馬プラスミドを導入させた。健康な細胞を示したよく組織化されたミトコンドリア ネットワーク (GFP、488 nm) と mitophagy のいくつかの発生率 (RFP、561 nm)。しかし、細胞ミトコンドリア ランプ FCCP 前処理 (3 h の 30 μ M) mitophagy 発生率 (図 1 a) の深遠な増加を展示します。Mitophagy はまた LAMP2 と COXII (図 1 b) の間の共局在を使用して測定しました。
線虫の Mitophagy の検出
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Mitophagy、クリア破損しているミトコンドリアのプロセスはミトコンドリアの恒常性と健康維持のため必要です。この記事は最新の mitophagy のいくつかに、ひと細胞、線虫マウスの検出方法を示します。

In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

これらの実験の全体的な目標は、ヒト細胞、C.elegans、およびマウスのマイトファジーのレベルを評価することです。マイトファジーは、神経変性、代謝性疾患、老化の交差点において非常に重要な概念となっており、ここで紹介する方法論とこれらの将来の使用への洞察は、この重要な分野での進歩に役立つ可能性があります。この技術の主な利点は、堅牢かつ効率的な方法でマイトファジーを検出し、in vitroとin vivoの両方でマイトファジーを検出できることです。ここで紹介するこの手法は、研究者が新しい洞察を開発し、ミトコンドリアの機能障害があることがわかっているアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経再生性疾患に対する治療のための新しい戦略を開発するのに役立ちます。これらの方法は、マイトファジーの分子メカニズムに関する洞察を提供するだけでなく、マイトファージ誘導体のスクリーニングを通じて新規薬剤候補の発見につながる可能性があります。マイトファジーのレベルは、C.elegansとマウスの両方で実験条件の変化に非常に敏感であるため、これらの方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。35ミリメートルのガラス底のマイクロウェル皿、10ミリメートルのマイクロウェル皿に300,000〜100万個の細胞を播種し、細胞が翌日に70%のコンフルエントに達するようにします。細胞を完全な細胞培養培地に保持し、摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターでインキュベートします。翌日、15マイクロリットルのDNAトランスフェクション試薬を150マイクロリットルの無血清培地で希釈します。また、mito-KeimaプラスミドDNAの2〜5マイクログラムを150マイクロリットルの無血清培地で希釈します。希釈したDNAトランスフェクション試薬に希釈したmito-Keimaプラスミドを加え、混合物を10秒間ボルテックスします。次に、混合物を室温で10分間インキュベートします。次に、DNAトランスフェクション試薬混合物を細胞に滴下し、プレートを5〜10秒間穏やかに振とうして溶液を混合します。この時点で、細胞をインキュベーターに戻し、24時間インキュベートします。翌日、培地を新鮮で完全な細胞培養培地に交換し、トランスフェクションした細胞をさらに24時間インキュベートします。トランスフェクションした細胞を共焦点顕微鏡でイメージングします。40倍の倍率で20の領域をランダムに画像化し、各ウェルで合計100〜200個の細胞を文書化します。1日目に、DCT-1 GFPおよびDSRed LGG-1の両方を体壁筋細胞に発現するトランスジェニック動物のL4幼虫を摘み取り、OP50播種線虫増殖培地プレート上に置く。少なくとも3つのプレートを使用して、各3.5センチメートルのプレートに5〜10個のワームを置きます。終了したら、線虫を摂氏20度でインキュベートします。次に、5日目に、15〜20匹のL4トランスジェニック幼虫を選択し、それらを新鮮なOP50播種プレートに移すことにより、線虫を同期させます。各実験条件には少なくとも5枚のプレートを使用してください。7日目に、関心のある薬物に影響を与えるマイトファジー用の車両プレートの一部と、ポジティブコントロールとして使用するための車両プレートを準備します。次に、大腸菌を播種したプレートを222マイクロワット/センチメートルの二乗の強度で15分間UV光にさらし、プレート上のマイトファジー誘導化合物が細菌によって代謝されないようにします。次に、シードされたプレートの上部に 10 マイクロリットルの化合物を添加し、ネガティブコントロールとして同量の化合物ビヒクルをビヒクルプレートに追加します。マイトファジー誘導の積極的な制御のために、ミトコンドリア毒物であるパラコートを追加します。溶液が表面全体を覆うまでプレートを静かに渦巻き、蓋を閉じた状態で室温でプレートを少なくとも1時間乾燥させます。乾いたら、生後2日齢の成体トランスジェニック動物10〜20匹をプレートに移します。それらを摂氏20度で2日間インキュベートします。9日目に、2%アガロースパッドを準備し、パッドごとにM9に20ミリモルレバミゾールの液滴を1つ追加します。.トランスジェニック動物をM9レバミゾールドロップに入れることにより、イメージングのために固定します。次に、ドロップの上部にカバースリップをそっと置きます。サンプルを共焦点顕微鏡ステージに置き、63倍の拡大でZスタック画像を撮影することにより、単一体壁筋細胞を画像化します。新鮮で単離されたmito-Keimaマウスの肝臓を冷やした金属板の氷上に置いて、組織を急速に冷却します。mito-Keimaタンパク質からのシグナルは氷上で最大1時間安定しているため、組織をできるだけ早く処理しながら、その状態に保ちます。次に、湾曲した鉗子のペアを使用して肝臓サンプルを持ち上げ、5ミリリットルの氷冷PBSですすぎます。最後に、共焦点顕微鏡を使用して組織切片を画像化し、2つの連続励起を行います。ここで紹介した手順を用いて、ヒトHeLa細胞にmito-Keimaプラスミドをトランスフェクションしました。健康な細胞は、マイトファジーの発生率がほとんどない、よく組織化されたミトコンドリアネットワークを示しました。しかし、ミトコンドリアアンカプラーFCCPで前処理した細胞は、マイトファジーの発生率の大幅な増加を示しました。マイトファジーは、LAMP2とCOXIIの共局在を使用しても測定されました。C.elegansのマイトファジーのin vivo検出のために、体壁筋細胞にMTロゼラを発現するトランスジェニック線虫を8ミリモルのパラコートで処理しました。pH感受性蛍光比の低下によって示されるマイトファジー誘導のレベルは、パラコートで処理された線虫で有意に減少することがわかった。さらに、DCT-1融合GPFとDSR融合LGG-1との間の共局在イベント数の増加は、酸化ストレスに応答したマイトファジー刺激を意味しています。最後に、これらの画像は、mito-Keimaマウスの肝臓と小脳からのmito-Keima信号を表しています。組織は冷たく保ち、できるだけ早く画像化する必要がありますが、適切に準備すれば、正常および病態生理学的状態におけるマイトファジーについての洞察を提供するために使用できます。この技術の使用は、神経変性生物学とミトコンドリア生物学の幅広い分野の研究者が、培養細胞、線虫、C.elegans、マウスモデルなどのさまざまなモデルシステムでミトコンドリア機能を探求する道を開きました。このビデオを見た後、C.elegansとマウスの両方のマイトファジーレベルの定量的評価に使用する複数の方法を把握できるはずです。

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