Name: 組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 学ぶ 組換えタンパク質の部位特異的糖基化手法。システイン残基を導入し、in vitroで糖を付加し、構造変化と効率を評価する。この方法は糖鎖修飾がタンパク質機能に与える影響を解明し、がんや神経変性疾患の治療戦略開発に貢献する。

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この研究は、自然科学と工学研究会のカナダ (時は PBS に 05239) のためのカナダの財団によって支えられた革新/オンタリオ研究基金 (する時は PBS)、前立腺がんと戦う財団 - (時は PBS) にお父さんとオンタリオ州の telus 社のソフトウェアに乗る大学院奨学金 (Y.J.C.、n. s.)。

タンパク質の糖鎖修飾は翻訳後修飾糖が共有結合ポリペプチド アミノ酸側鎖に結合を通して主に接続されています。哺乳類のタンパク質の 50% がグリコ54、どこ糖蛋白質は生体分子結合親和性を変更することから効果の多様な範囲を持つことができますその後、蛋白質折りたたみ、チャネルの利用状況の変更、ターゲットに影響を与える劣化と携帯 (33の見直し) 少数を示すため、人身売買のための分子。哺乳類の生理学における糖鎖の重要な役割は、哺乳類の糖鎖構造33最大限の多様性を構築する進化したタンパク質のいくつかの数百人が明らかです。N- を変更し、 O糖鎖修飾パターンと関連している前立腺の (増加・減少) の乳房 (増加・減少) など多数の病気の状態 (増加) の肝臓、卵巣 (増加)、膵臓 (増加)胃癌 (増加) 55.さらに、huntingtin、タウの糖鎖 α-シヌクレインがアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病の疾患<...

運営のカルシウム (Ca2 +) を格納エントリ (SOCE) が主要な経路で、免疫細胞は、細胞質への細胞外スペースから Ca2 +を取る。T リンパ球の細胞膜 (PM) に位置する T 細胞受容体は抗原蛋白質のチロシンのキナーゼ ( 1,2,3見直し) を有効にするをバインドします。リン酸化カスケード ホスホリパーゼ-γ (PLCγ) その後ジアシルグリセ ロールとイノシトール 1,4,5-三リン酸 (IP3 にホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) 膜の加水分解反応を媒介するの活性化につながる).IP3は、IP3受容体に結合 (IP3R) 小胞体 (ER) にこの受容体チャネルを開くし、Ca2 +を許可に流れる小胞体から濃度勾配を小さな拡散性メッセン ジャー(文献4) 細胞質へルーメン。受容体 G タンパク共役型とさまざまな他の興奮性および非興奮性細胞型鉛の受容体型チロシンキナーゼから IP3の同じ生産し IP3Rs の活性化。
有限 Ca2 +の容量 ER、IP3のため-仲介されたリリースと細胞内 Ca2 +の増加は遷移的です。ただし、この枯渇、小胞体内腔 Ca2 +深く間質相互作用分子 1 (STIM1) 型の効果-私は膜貫通 (TM) タンパク質は小胞体膜5,6,7主発見します。STIM1 にはルーメン指向 Ca2 +センサー ドメイン EF 手ペアと滅菌 α-モチーフ (EFSAM) が含まれています。(文献8) 単一の TM ドメインで EFSAM から 3 つのゾル性細胞質指向コイルド コイル ドメインが分かれています。小胞体内腔 Ca2 +枯渇、時に、EFSAM は TM とコイルド コイル ドメイン10の構造語順換えを引き起こす不安定化共役重合7,9を経る。これらの構造変化の ER PM 接合11,12,13,14 PM イノシトールリン脂質15,との対話を通じて STIM1 のトラップで絶頂に達する16と Orai1 サブユニット17,18。Orai1 タンパクは、フォーム Ca2 +チャンネル19,の20,21,22にアセンブルする PM サブユニットです。ER PM 接合で STIM1 Orai1 の相互作用を容易にする、開いて Ca2 +活性化リリース Ca2 + (クラック) チャネルの構造から高濃度の細胞質への Ca2 +の動きを可能にする、細胞外スペース。免疫細胞の CRAC チャネルを介して持続的なゾル性細胞質の Ca2 +標高は、Ca2 +-カルモデュリン/カルシニューリン依存の脱燐酸化活性化 T 細胞の核に入るその後核因子を誘導してT 細胞活性化1,3を促進する遺伝子の転写調節を開始します。STIM1 23,24アゴニストによる小胞体内腔 Ca2 +の枯渇を経由して結果持続的な細胞内 Ca2 +上昇 CRAC チャネル活性化のプロセスは、SOCE 25総称して呼びます。SOCE T 細胞の重要な役割は、STIM1 の Orai1 変異が重症複合免疫不全症候群3,19,26,を引き起こす可能性を示す研究によって明白である27です EFSAM は最終的に自己会合の不安定化結合7,につながる、正規の EF ハンドで Ca2 +調整の損失を介して小胞体内腔 Ca2 +枯渇を検出後 SOCE を開始。28,29。
グリコシル化反応、キャラクタリゼーションとオリゴ糖構造、小胞体とゴルジ体 ( 30,32,33見直し) の様々 な生合成手順をとして知られている糖鎖の処理です。真核生物における糖鎖の 2 つの支配的なタイプがある: N-リンクとO-リンクすると、特定のアミノ酸とリンケージをブリッジ原子によって。糖鎖、糖鎖を asn、側鎖のアミドに添付し、ほとんどのケースで開始ステップが ER で発生したポリペプチド鎖にルーメン34に移動します。糖鎖の最初のステップはから成っている (Glc) グルコース、マンノース (男) とn-アセチルグルコサミン (GlcNAc) (すなわち Glc3男9GlcNAc2)ER から 14 砂糖コア構造の転送酵素35,36による膜脂質。胸の谷間やグルコース残基の転送など、これ以降の手順は、小胞体の特定のグリコシダーゼと糖転移酵素によって触媒されます。いくつかのタンパク質は小胞体とゴルジ装置に移動は加工37をさらにすることができます。O糖鎖は通常 Ser または Thr の残基の側鎖水酸基に、糖鎖の付加、ゴルジ複合体33,34完全にこの変更が発生します。ガラクトース、フコース、 n-アセチルグルコサミン作ることができるいくつかのO型糖鎖構造があり、各単糖とシアル酸は33を順次追加。
一般的なコンセンサス配列をNに関連付けられている多くの種類O糖鎖修飾のための前提条件として特定の順序が特定されていない中-リンク修正: Asn-X-Ser/木/システインは、X が任意のアミノ酸をすることができます除いてプロ33。STIM1 EFSAM にはコンセンサスN- 糖鎖がこれらの 2 つが含まれています: Asn131-Trp132-Thr133 と Asn171-Thr172-Thr173。確かに、以前の研究では、EFSAM が Asn131、Asn171 38,39,40,41哺乳類細胞における糖鎖のNをすることができますを示しています。しかし、SOCE に糖鎖の結果の前の研究が一致されている、抑制を示唆増強または SOCE 活性化38,のこの翻訳後修飾による影響なし「外部参照」を = > 39,40,41。したがって、EFSAM N糖鎖の基になる生物物理・生化学・構造の影響に関する研究は、この変更の規制の影響を理解することが重要です。これらの in vitro実験の均質な蛋白質の高レベルの要件のため EFSAM に共有結合糖鎖を付けるサイト選択的なアプローチが適用されました。興味深いことに、Asn131 と Asn171 の糖鎖 EFSAM コア内で収束し、STIM1 を介した SOCE 42を促進する生物物理特性を高める構造の変化の原因。
糖グループのシステインのチオール基の化学添付ファイルはまずタンパク質関数43グリコシル化反応のサイト固有の効果を理解するこの酵素無料アプローチの有用性を示した種子の仕事によって確立されています。,44。 最近、STIM1 に関して Asn131 と Asn171 残基がシステインに変異したと共有無料チオール42にグルコースをリンクする glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] が使用されました。ここでは、突然変異誘発を使用して、サイトの変更、特定のシステイン残基を組み込むだけでなく、急速に変更の効率化と構造の両方を評価するためにソリューションの核磁気共鳴 (NMR) 分光法もこのアプローチについて述べる糖付加の結果として摂動。特に、この一般的な方法は、簡単にどちらかのO- の効果を研究に適応またはいずれかのN-グリコシル recombinantly 蛋白質を生産します。

<table><tbody><tr><td>Phusion DNAポリメラーゼ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F530S</td><td>ステップ1.3で使用します。</td></tr><tr><td>Generuler 1kb DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1163</td><td>ステップ1.6で使用します。</td></tr><tr><td>DpnI制限酵素</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>R0176</td><td>ステップ1.8で使用します。</td></tr><tr><td>プレストミニプラスミドキット</td><td>ジーンエイド株式会社</td><td>PDH300</td><td>ステップ1.16で使用します。</td></tr><tr><td>BL21 DE3コドン(+) 大腸菌</td><td>アジレントテクノロジーズ(株)</td><td>230280</td><td>手順 2.1 で使用します。</td></tr><tr><td>DH5a 大腸菌</td><td>Invitrogen, Inc.</td><td>18265017</td><td>手順1.9で使用します。</td></tr><tr><td>0.22 mm シリンジフィルター</td><td>Millipore, Inc.</td><td>SLGV033RS</td><td>手順2.3で使用します。</td></tr><tr><td>HisPur Ni2+-NTAのアガロース樹脂</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88221</td><td>ステップ3.3で使用。</td></tr><tr><td>3,500 da MWCO 透析チューブ</td><td>BioDesign, Inc.</td><td>D306</td>ステップ<td>3.8、3.16、4.2、4.5、および4.6で使用します。</td></tr><tr><td>ウシトロンビン</td><td>バイオファームラボラトリーズ株式会社</td><td>SKU91-055</td><td>ステップ3.9で使用します。</td></tr><tr><td>5 mL HiTrap Q FF 陰イオン交換カラム</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5156-01</td>ステップ<td>3.11で使用します。</td></tr><tr><td>グルコース-5-MTS</td><td>トロント・リサーチ・ケミカルズ社</td><td>G441000</td><td>手順4.1で使用します。</td></tr><tr><td>ビバスピン20限外ろ過遠心濃縮器</td><td>ザルトリウス株式会社</td><td>VS2001</td><td>ステップ 3.11、4.2、4.5、4.6 で使用します。</td></tr><tr><td>PageRuler 未染色ブロードタンパク質ラダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>26630</td><td>ステップ3.7、3.10、3.15での使用</td></tr><tr><td>HiTrap Q FF 陰イオン交換カラム</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5053-01</td>ステップ<td>3.12で使用します。</td></tr><tr><td>AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System</td><td>GEヘルスケア株式会社</td><td>29018224</td><td>手順3.14で使用します。</td></tr><tr><td>600 MHz Varian Inova NMR分光計</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td>手順 5.2 と 5.5 で使用します。</td></tr></tbody></table>

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

間質相互作用分子 1 (STIM1) は型-私膜貫通型タンパク質は、小胞体 (ER) と膜 (PM) に位置しています。小胞体 STIM1 プリンシパル Ca2 +シグナリング プロセスです免疫反応を駆動する作動させたカルシウム (Ca2 +) のエントリを格納として知られているプロセスの午後 Orai1 チャネルの活性を調節します。STIM1 は、ドメイン内で Ca2 +センサー分子の 2 つの内腔 Asn サイトで翻訳後修飾N- グリコシル化反応を受けます。しかし、生化学、生物物理、 Nグリコ STIM1 の構造生物学的効果が同種のN- 糖タンパク質の高レベルが容易に取得できないのため最近までよくわかっていないと。ここでは、特定の蛋白質サイト該当するタンパク質の構造と機構の糖鎖の根本的な効果を理解するために糖鎖のついた体外化学アプローチの実装について述べる.ソリューションの核磁気共鳴分光法を用いた単一サンプルのブドウ糖添付ファイルの構造の結果だけでなく、変更の両方の効率を評価する.このアプローチは、自然は、無数の糖蛋白質を研究する容易に適合できます。

このアプローチの最初のステップは、ブドウ糖 5 山地 EFSAM を使用して変更可能なことができるシステイン残基に候補糖残基の変異体には内因性のシステイン残基がないので特別な考慮事項を前に可能にする必要はありません必要があります、突然変異誘発。ただし、ネイティブのシステイン残基は、記述されている化学を実行する前に非変更可能な残基に変異する必要があります。ネイティブ構造体に影響を与える最低限、興味の蛋白質のグローバル配列アラインメントを実行する勧めし、他の残基であるを決定する最も頻繁で内因性システイン位置を発見しました。他の生物の自然発生するこれら他の残基に Cys 変異は蛋白質の構造の影響を最小限があります。内因性の Cys 残基は厳重に保存されている場合は、Cys に最も構造的に類似している Ser に書き換えることをお勧めします。図 1は、典型的な PCR の突然変異誘発ゲル PCR に使用された増幅されていないテンプレート ペット-28 a DNA 量制御よりも数倍高い強度を示す増幅された DNA のサンプ...

糖タンパク質の生化学的および構造解析では、均質な試料の比較的大量を必要とします。反応システイン チオール化合物をターゲットに細菌から精製組換えタンパク質の部位特異的糖鎖の効率的な化学的方法を紹介します。

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

この手順の全体的な目標は、天然のグリコシル化部位での部位特異的突然変異誘発によってタンパク質にシステイン残基を組み込み、in vitroグルコース結合および評価アプローチを採用して、グリコシル化の効率と構造的効果を評価することです。この方法は、タンパク質のグリコシル化の構造的影響は何か、これらの修飾が機能の根底にあるメカニズムにどのように影響するかなど、構造生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、グリコシル化の研究や取り扱いに容易に適応できることです。これは非常に効率的であり、構造の摂動と効率の両方を迅速に評価できます。この技術の意味は、グリコシル化パターンの変化がいくつかの癌や神経変性疾患と関連しているため、疾患の治療にまで及びます。この方法は、天然のグリコシル化タンパク質の影響についての洞察を提供するだけでなく、グリコシル化パターンをどのように変更するかについて非常に必要な情報を提供する可能性もあり、この範囲の疾患に寄与する可能性があります。発現ベクターに単一のシステイン変異を導入するには、2本の個別のPCR反応チューブを調製します。最初のチューブに前方変異原性プライマーを追加し、2番目のチューブに逆変異原性プライマーを追加します。最終濃度の1X PCRバッファーを両方のチューブに加えます。次に、2つの別々のPCR反応チューブに5サイクルプログラムを設定します。5 番目のサイクルの終わりに、摂氏 72 度で 7 分半の延長時間を追加します。5サイクルが完了したら、2つの別々のPCR反応を1つのチューブで混合し、チューブを約3秒間遠心分離し、同じPCR条件に従ってさらに20サイクルを繰り返します。次に、15マイクロリットルのサンプルを1%DNAアガロースゲルに120ボルトで40分間泳ぎます。次に、0.5ミリグラム/ミリグラム/リットルの臭化エチジウムを含む水にゲルを浸し、室温で30分間振とうします。次に、波長302ナノメートルのUV光下でのテンプレートの増幅を確認します。その後、残りの25マイクロリットルのPCR反応ミックスに0.5マイクロリットルのDPN1制限酵素を加えます。混合物を摂氏37度で2時間半インキュベートし、メチル化テンプレートDNAを消化します。次に、消化した混合物の約5〜10マイクロリットルを100マイクロリットルの熱ショック可能な大腸菌細胞に加え、氷上で60分間インキュベートします。次に、乾燥したヒートブロック上で細胞-DNA混合物を摂氏42度で45秒間熱ショックします。次に、すぐに混合物を氷上で3分間インキュベートします。次に、900マイクロリットルのLBブロスを細胞に加え、懸濁液を滅菌済みの14ミリリットルの丸底チューブに移します。摂氏37度でインキュベートし、190rpmで90分間絶えず振とうします。次に、遠心分離した細胞ペレットを抗生物質を添加した寒天プレートに広げます。プレートを摂氏37度で16時間インキュベートします。翌日、プレートから 1 つのコロニーを 5 ミリリットルの抗生物質添加 LB 培地に無菌的に接種します。次に、摂氏37度で一晩で、絶えず振とうしながら培養物を成長させます。システイン残基変異プラスミドをヒートショック処理により大腸菌細胞に形質転換し、続いて抗生物質を添加したLB培地で一晩培養します。翌日、カナマイシン添加LB寒天プレートに150マイクロリットルの細胞懸濁液を直接広げ、プレートを37°Cで一晩インキュベートします。翌日、三角フラスコで20ミリリットルのLB培地に1つのコロニーを無菌的に移し、摂氏37度で一晩インキュベーションします。翌日、一晩の培養物を50ミリリットルの円錐管に移します。次いで、一晩の液体培養物を2,400倍Gで15分間遠心分離することにより、細胞をペレット化する。次に、10ミリリットルのM9最小培地を細胞ペレットに加え、次いで、カナマイシンを含むM9培地1リットルに細胞混合物を懸濁する。600ナノメートルの光学密度が約0.6〜0.8に達するまで、約190rpmで一定の振とうをしながら、M9液体培養物を摂氏37度で増殖させ続けます。次に、200マイクロモルのIPTGをM9培養物に加えてタンパク質発現を誘導し、培養物を一晩成長させます。翌日、一晩培養した細菌細胞を、摂氏4度で約10,000倍Gで30分間遠心分離することにより、ペレット化します。10ミリリットルの電動トランスファーピペットを使用して、凍結した細菌細胞ペレットを約40ミリリットルの均質化緩衝液で均質化します。次に、ホモジネートをハイブリダイゼーションオーブンで90分間、一定の回転でインキュベートします。混合物を約15, 000倍Gで摂氏8度で40分間遠心分離し、不溶性ペレットから可溶性タンパク質画分を分離します。次に、体積50%のニッケルニトリロ三酢酸アガロースビーズスラリーを上清に添加し、ハイブリダイゼーションオーブンで室温で90分間反転してインキュベートします。次に、重力流タンパク質精製カラムを使用して、ニッケルにヘキサヒスチジンタグ付きタンパク質が付着したアガロースビーズを回収します。最後に、集めたアガロースビーズを3回洗います。タンパク質を一連の2ミリリットルの画分で溶出します。次に、溶出画分中の精製ヘキサヒスチジンタグタンパク質を、Coomassieブルー染色SDS-PAGEゲルを用いて確認します。溶出したタンパク質画分を3, 500ダルトンの分子量カットオフで透析膜にプールし、摂氏4度のリフォールディングバッファーで磁気攪拌しながら一晩インキュベートします。次に、透析膜にプールしたタンパク質にタンパク質1ミリグラムあたり約1単位のトロンビンを加え、再度摂氏4度で1日間インキュベートします。翌日、透析バッグからタンパク質を取り出し、10, 000ダルトンの分子量カットオフの限外ろ過遠心濃縮器を使用して約10倍に濃縮します。その後、タンパク質濃縮物を塩化ナトリウムを含まないリフォールディングバッファーで約20倍に再希釈します。タンパク質を精製するには、同じ塩化ナトリウムを含まないバッファーで平衡化したプレパック陰イオン交換カラムにタンパク質をロードします。リフォールディングバッファーを含む1モル塩化ナトリウムの0〜60%の勾配でタンパク質の溶出を開始します。プールしたタンパク質画分を透析バッグに移します。摂氏4度で一晩透析ステップを実施し、タンパク質を最適なモル濃度の塩化ナトリウムで実験用リフォールディングバッファーに交換します。まず、約60マイクロモルのタンパク質1.5ミリリットルを、タンパク質のグリコシル化のための修飾バッファー1リットルに透析します。24時間後、摂氏4度で修飾タンパク質を微量遠心チューブに移し、DMSO可溶化グルコース-5-MTSを最終濃度2ミリモルまで添加します。10分ごとに微量遠心チューブを軽くたたいながら、サンプルを周囲温度の暗所で1時間インキュベートします。インキュベーション後、摂氏4度で透析を行い、タンパク質を最終的な実験バッファーに再交換します。エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いてタンパク質の精密質量を測定します。最後に、溶液NMRを使用して修飾効率を計算し、タンパク質中のグリコシル化cys残基の構造変化を同定します。成功した変異PCR増幅テンプレートDNAは、この代表的な1%DNAアガロースゲルで示されています。DNAラダーと、PCRで増幅されていない同量のテンプレートDNAをゲルのコントロールとして使用します。高強度のエチジウムブロマイド染色を施した最上位のバンドは、目的のサイズの増幅されたテンプレートを示しています。次に、陰イオン交換カラムを用いてタンパク質を精製しました。クロマトグラムは、280 ナノメートルで観察された溶出プロファイルを青色で示し、赤色で示される塩化ナトリウムグラジエントに対して溶出する 3 つのピークを示し、0.6 モルまで濃度が増加します。下のパネルは、タンパク質画分のクマシーブルー染色SDS-PAGEゲルを示しています。システイン残基のグリコシル化は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法によって決定しました。クロマトグラムは、システイン残基のグリコシル化前後の未修飾タンパク質と修飾タンパク質の質量を示しています。確認のために、溶液NMRを行い、残基特異的アミド化学シフトのHSQCスペクトルの重ね合わせを示し、グリコシル化タンパク質の修飾と構造摂動の両方を示しました。これを習得すれば、突然変異誘発からNMR評価までのすべての段階を、プライマー合成、DNAシーケンシング、質量分析サービスの待ち時間を除いて、約12日で完了することができます。この手順を試みる際には、ベースラインコントロール測定として、チオール修飾がない場合のシステイン変異の構造的および生物物理学的影響を評価することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、安定性、二次構造、イオン結合、タンパク質間相互作用評価などの他の方法を実行して、基礎となるタンパク質機能の生物物理学的特性がグリコシル化によってどのように影響を受けるかを明らかにすることができます。その開発後、この技術は、カルシウムシグナル伝達の分野の研究者が、アスパラギン131とアスパラギン171の役割、および貯蔵操作カルシウムの侵入に関連する間質相互作用分子1つのカルシウムシグナル伝達におけるグリコシル化を個別的および累積的に評価するための道を開きました。

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免疫学と感染症

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タンパク質チオール酸化の多重化定量のための同重体タンデム質量タグ標識と組み合わせた樹脂支援キャプチャ(英語)

学ぶ 組換えタンパク質の部位特異的糖基化手法。システイン残基を導入し、in vitroで糖を付加し、構造変化と効率を評価する。この方法は糖鎖修飾がタンパク質機能に与える影響を解明し、がんや神経変性疾患の治療戦略開発に貢献する。

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

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