組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

この手順の全体的な目標は、天然のグリコシル化部位での部位特異的突然変異誘発によってタンパク質にシステイン残基を組み込み、in vitroグルコース結合および評価アプローチを採用して、グリコシル化の効率と構造的効果を評価することです。この方法は、タンパク質のグリコシル化の構造的影響は何か、これらの修飾が機能の根底にあるメカニズムにどのように影響するかなど、構造生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、グリコシル化の研究や取り扱いに容易に適応できることです。

これは非常に効率的であり、構造の摂動と効率の両方を迅速に評価できます。この技術の意味は、グリコシル化パターンの変化がいくつかの癌や神経変性疾患と関連しているため、疾患の治療にまで及びます。この方法は、天然のグリコシル化タンパク質の影響についての洞察を提供するだけでなく、グリコシル化パターンをどのように変更するかについて非常に必要な情報を提供する可能性もあり、この範囲の疾患に寄与する可能性があります。

発現ベクターに単一のシステイン変異を導入するには、2本の個別のPCR反応チューブを調製します。最初のチューブに前方変異原性プライマーを追加し、2番目のチューブに逆変異原性プライマーを追加します。最終濃度の1X PCRバッファーを両方のチューブに加えます。

次に、2つの別々のPCR反応チューブに5サイクルプログラムを設定します。5 番目のサイクルの終わりに、摂氏 72 度で 7 分半の延長時間を追加します。5サイクルが完了したら、2つの別々のPCR反応を1つのチューブで混合し、チューブを約3秒間遠心分離し、同じPCR条件に従ってさらに20サイクルを繰り返します。

次に、15マイクロリットルのサンプルを1%DNAアガロースゲルに120ボルトで40分間泳ぎます。次に、0.5ミリグラム/ミリグラム/リットルの臭化エチジウムを含む水にゲルを浸し、室温で30分間振とうします。次に、波長302ナノメートルのUV光下でのテンプレートの増幅を確認します。

その後、残りの25マイクロリットルのPCR反応ミックスに0.5マイクロリットルのDPN1制限酵素を加えます。混合物を摂氏37度で2時間半インキュベートし、メチル化テンプレートDNAを消化します。次に、消化した混合物の約5〜10マイクロリットルを100マイクロリットルの熱ショック可能な大腸菌細胞に加え、氷上で60分間インキュベートします。

次に、乾燥したヒートブロック上で細胞-DNA混合物を摂氏42度で45秒間熱ショックします。次に、すぐに混合物を氷上で3分間インキュベートします。次に、900マイクロリットルのLBブロスを細胞に加え、懸濁液を滅菌済みの14ミリリットルの丸底チューブに移します。

摂氏37度でインキュベートし、190rpmで90分間絶えず振とうします。次に、遠心分離した細胞ペレットを抗生物質を添加した寒天プレートに広げます。プレートを摂氏37度で16時間インキュベートします。

翌日、プレートから 1 つのコロニーを 5 ミリリットルの抗生物質添加 LB 培地に無菌的に接種します。次に、摂氏37度で一晩で、絶えず振とうしながら培養物を成長させます。システイン残基変異プラスミドをヒートショック処理により大腸菌細胞に形質転換し、続いて抗生物質を添加したLB培地で一晩

翌日、カナマイシン添加LB寒天プレートに150マイクロリットルの細胞懸濁液を直接広げ、プレートを37°Cで一晩インキュベートします。翌日、三角フラスコで20ミリリットルのLB培地に1つのコロニーを無菌的に移し、摂氏37度で一晩インキュベーションします。翌日、一晩の培養物を50ミリリットルの円錐管に移します。

次いで、一晩の液体培養物を2,400倍Gで15分間遠心分離することにより、細胞をペレット化する。次に、10ミリリットルのM9最小培地を細胞ペレットに加え、次いで、カナマイシンを含むM9培地1リットルに細胞混合物を懸濁する。600ナノメートルの光学密度が約0.6〜0.8に達するまで、約190rpmで一定の振とうをしながら、M9液体培養物を摂氏37度で増殖させ続けます。

次に、200マイクロモルのIPTGをM9培養物に加えてタンパク質発現を誘導し、培養物を一晩成長させます。翌日、一晩培養した細菌細胞を、摂氏4度で約10,000倍Gで30分間遠心分離することにより、ペレット化します。10ミリリットルの電動トランスファーピペットを使用して、凍結した細菌細胞ペレットを約40ミリリットルの均質化緩衝液で均質化します。

次に、ホモジネートをハイブリダイゼーションオーブンで90分間、一定の回転でインキュベートします。混合物を約15, 000倍Gで摂氏8度で40分間遠心分離し、不溶性ペレットから可溶性タンパク質画分を分離します。次に、体積50%のニッケルニトリロ三酢酸アガロースビーズスラリーを上清に添加し、ハイブリダイゼーションオーブンで室温で90分間反転してインキュベー

次に、重力流タンパク質精製カラムを使用して、ニッケルにヘキサヒスチジンタグ付きタンパク質が付着したアガロースビーズを回収します。最後に、集めたアガロースビーズを3回洗います。タンパク質を一連の2ミリリットルの画分で溶出します。

次に、溶出画分中の精製ヘキサヒスチジンタグタンパク質を、Coomassieブルー染色SDS-PAGEゲルを用いて確認します。溶出したタンパク質画分を3, 500ダルトンの分子量カットオフで透析膜にプールし、摂氏4度のリフォールディングバッファーで磁気攪拌しながら一晩インキュベートします。次に、透析膜にプールしたタンパク質にタンパク質1ミリグラムあたり約1単位のトロンビンを加え、再度摂氏4度で1日間インキュベートします。

翌日、透析バッグからタンパク質を取り出し、10, 000ダルトンの分子量カットオフの限外ろ過遠心濃縮器を使用して約10倍に濃縮します。その後、タンパク質濃縮物を塩化ナトリウムを含まないリフォールディングバッファーで約20倍に再希釈します。タンパク質を精製するには、同じ塩化ナトリウムを含まないバッファーで平衡化したプレパック陰イオン交換カラムにタンパク質をロードします。

リフォールディングバッファーを含む1モル塩化ナトリウムの0〜60%の勾配でタンパク質の溶出を開始します。プールしたタンパク質画分を透析バッグに移します。摂氏4度で一晩透析ステップを実施し、タンパク質を最適なモル濃度の塩化ナトリウムで実験用リフォールディングバッファーに交換します。

まず、約60マイクロモルのタンパク質1.5ミリリットルを、タンパク質のグリコシル化のための修飾バッファー1リットルに透析します。24時間後、摂氏4度で修飾タンパク質を微量遠心チューブに移し、DMSO可溶化グルコース-5-MTSを最終濃度2ミリモルまで添加します。10分ごとに微量遠心チューブを軽くたたいながら、サンプルを周囲温度の暗所で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、摂氏4度で透析を行い、タンパク質を最終的な実験バッファーに再交換します。エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いてタンパク質の精密質量を測定します。最後に、溶液NMRを使用して修飾効率を計算し、タンパク質中のグリコシル化cys残基の構造変化を同定します。

成功した変異PCR増幅テンプレートDNAは、この代表的な1%DNAアガロースゲルで示されています。DNAラダーと、PCRで増幅されていない同量のテンプレートDNAをゲルのコントロールとして使用します。高強度のエチジウムブロマイド染色を施した最上位のバンドは、目的のサイズの増幅されたテンプレートを示しています。

次に、陰イオン交換カラムを用いてタンパク質を精製しました。クロマトグラムは、280 ナノメートルで観察された溶出プロファイルを青色で示し、赤色で示される塩化ナトリウムグラジエントに対して溶出する 3 つのピークを示し、0.6 モルまで濃度が増加します。下のパネルは、タンパク質画分のクマシーブルー染色SDS-PAGEゲルを示しています。

システイン残基のグリコシル化は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法によって決定しました。クロマトグラムは、システイン残基のグリコシル化前後の未修飾タンパク質と修飾タンパク質の質量を示しています。確認のために、溶液NMRを行い、残基特異的アミド化学シフトのHSQCスペクトルの重ね合わせを示し、グリコシル化タンパク質の修飾と構造摂動の両方を示しました。

これを習得すれば、突然変異誘発からNMR評価までのすべての段階を、プライマー合成、DNAシーケンシング、質量分析サービスの待ち時間を除いて、約12日で完了することができます。この手順を試みる際には、ベースラインコントロール測定として、チオール修飾がない場合のシステイン変異の構造的および生物物理学的影響を評価することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、安定性、二次構造、イオン結合、タンパク質間相互作用評価などの他の方法を実行して、基礎となるタンパク質機能の生物物理学的特性がグリコシル化によってどのように影響を受けるかを明らかにすることができます。

その開発後、この技術は、カルシウムシグナル伝達の分野の研究者が、アスパラギン131とアスパラギン171の役割、および貯蔵操作カルシウムの侵入に関連する間質相互作用分子1つのカルシウムシグナル伝達におけるグリコシル化を個別的および累積的に評価するための道を開きました。