ATAC Seq による主なヒト T リンパ球のゲノム広いアクセス可能なクロマチンをマッピング

高スループット シーケンス (seq ATAC) と相まってトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、アクセス可能なクロマチンを明らかにするゲノム広い方法です。これは最終的な計算の分析は、人間のリンパ球 (Th1 ・ Th2) 用に最適化する分子からのステップバイ ステップ ATAC seq プロトコル。このプロトコルは、次世代シーケンシング法の経験なしの研究者採用できます。

トランスポゼースを用いたこのハイスループット法の全体的な目標は、ヒトゲノムのアクセス可能なクロマチン領域を同定することです。この方法は、制御要素のゲノムワイドな位置など、エピゲノム分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、堅牢で比較的短く、DNase-seqやFAIRE-seqなどの他のクロマチンアクセシビリティ測定方法に比べて必要な出発物質が少ないことです。

この方法は、ヒトTリンパ球の制御状況に関する洞察を提供することができますが、他のヒト初代細胞、がん細胞、ヒト臨床サンプル、他の哺乳動物や生物の細胞など、他のシステムにも適用できます。1000万個のヒトPBMCの1ミリリットルアリコートを解凍し、10ミリリットルのRPMI培地を補充した50ミリリットルのチューブに移します。それらを、細胞を500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。

次に、上清を取り除き、補充したRPMI培地15ミリリットルに細胞を再懸濁します。次に、細胞をT-75培養フラスコに移し、加湿して一晩インキュベートします。翌日、無菌の25ミリリットルピペットで浮遊細胞を50ミリリットルのチューブに移します。

次に、トリパンブルー排除を使用して生細胞をカウントします。次に、マイクロビーズ分離カラムを使用して、1,000万個の生きた非接着性PBMCからCD4陽性細胞を単離します。細胞が単離されたら、テキストプロトコルに従ってTh1およびTh2分極条件でT細胞を播種して活性化し、次にそれらの核を単離します。

そのためには、新鮮な溶解バッファーを準備し、氷の上で冷やしておきます。また、転位反応に備えて、サーマルシェーカーを37°Cに温めます。次に、50万個のT細胞を1.5ミリリットルのマイクロチューブにロードし、摂氏4度で500Gで5分間スピンダウンします。

次に、細胞を1ミリリットルの冷PBSで洗浄し、スピンサイクルを繰り返しますが、今度は細胞を1ミリリットルの冷溶解バッファーに懸濁します。核が破壊されすぎないように、穏やかなピペッティングで細胞を混合します。次に、10マイクロリットルのアリコートをすばやく取り、細胞の溶解画分を観察します。

細胞を冷たく保ち、素早く作業するようにしてください。5分以内に転位反応を進めます。まず、100, 000個の核を1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、サンプルを500Gで10分間低温遠心分離機でスピンダウンします。

次に、上澄みをそっと取り除きます。次に、転位反応成分を核に加えます。次に、穏やかなピペッティングで核を再懸濁し、サーマルシェーカーで核を500 RMPで30分間インキュベートして、転位反応を完了します。

次に、DNAクリーンアップステップを行い、20マイクロリットルのトリス塩酸塩でDNA断片を溶出します。次に、PCRを使用して、ATACシーケンシングライブラリの初期増幅を行います。次に、定量PCRによる最終増幅に必要な追加サイクルの最適数を評価します。

測定結果から、ATACシーケンシングライブラリの最終的なPCR増幅に必要なサイクル数を決定します。次に、最終増幅を実行します。DNAライブラリーフラグメントの最適なサイズを設定することで、次世代のシーケンシングを向上させることができます。

まず、磁気ビーズを室温まで温め、ヌクレアーゼフリーの水で新鮮な70%エタノールを調製します。次に、ヌクレアーゼフリーの水をATACシーケンシングライブラリに100マイクロリットルの容量まで追加します。次に、50マイクロリットルの再懸濁DNA結合磁気ビーズを追加します。

ビーズをDNAに少なくとも10回ピペットで取り込み、5分間待ちます。チューブの壁や蓋にビーズの滴が付着した場合は、チューブを短く回転させます。次に、サンプルを磁石の隣に2分間置き、上清を新しいマイクロチューブに移します。

コレクションの量を測定し、70%の体積の磁気ビーズ懸濁液を追加します。前と同じようにビーズを混ぜ合わせ、5分間インキュベートしてから進めます。次に、磁石を使用してビーズを2分間分離し、上清を捨てます。

磁石に逆らったまま、ビーズに200マイクロリットルの70%エタノールを追加します。30秒待ってからエタノールを捨て、もう一度エタノール洗浄を繰り返します。残りのエタノールを完全に取り除き、ビーズを磁石で5分間風乾させて洗浄を終了します。

必要に応じて、チューブを短時間回転させ、10マイクロリットルのピペットで目に見えるエタノールを吸引します。次に、チューブを磁石から取り外し、22マイクロリットルの塩酸トリスを追加します。2分後、チューブを磁気スタンドに戻し、溶液を透明にします。

次に、調製したライブラリーを含む溶出液を20マイクロリットル収集し、摂氏マイナス20度で保存します。このプロトコルは、通常、マイクロリットルあたり3〜20ナノグラムのATACシーケンシングライブラリを生成します。DNAインテグリティ解析用のシステム上で実行すると、はしごのような外観になります。

とりわけ、もう一つの重要な品質管理は、ポジティブコントロールの充実です。ネガティブコントロールと比較して、プライマーペア3は少なくとも25倍濃縮する必要があり、プライマーペア4は少なくとも75倍濃縮する必要があります。最初の 1,000 万回の読み取り後、サンプルが FastQC レポートファイルのすべての重要なパラメーターを渡し、ピーク呼び出しから 1, 000 から 2, 000 のピークが得られた場合、ライブラリは 3,000 万回を超える読み取りに対してより深くシーケンスできます。

品質基準を満たしたライブラリーから、ミトコンドリアゲノムにマッピングされるのはリードのわずか6〜20%です。残りの一意のリードは参照ヒトゲノムにマッピングされ、7〜12%はATACシーケンシングピーク内にあります。このビデオを見れば、ATAC-seqライブラリの作り方、配給塩のシーケンシングの提出方法、得られたデータの解析方法についてよく理解できるはずです。

一度習得すれば、ATAC-seqライブラリの調製は1〜2営業日で完了します。この手順を試行する際には、まず、核単離ステップで細胞の数や溶解バッファーの組成など、いくつかのステップを最適化する必要があることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、クロマチン免疫沈降などの他の方法を実行して、検査したサンプルのオープンクロマチン領域にどの転写因子が結合するかなどの追加の質問に答えることができますか?