Name: ATAC Seq による主なヒト T リンパ球のゲノム広いアクセス可能なクロマチンをマッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学ぶ ATAC-seq によるヒトTリンパ球のゲノム広いクロマチンアクセシビリティ解析。トランスポザーゼを用いたハイスループットシーケンスで、エピゲノム研究における制御領域の同定に有用です。

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この作品はイスラエル科学財団 (グラント 748/14) でサポートされている、マリー キュリーの統合 (CIG) を付与 - FP7 人 20013 CIG 618763 とコア計画と予算委員会とイスラエル科学財団のプログラム許可第 41/11。

<ol><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).</li>
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<li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase-seq%3A+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).</li>
<li>Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+formaldehyde-assisted+isolation+of+regulatory+elements+%28FAIRE%29+to+isolate+active+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA.</a> Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).</li>
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<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ATAC-seq+approach+reveals+lineage-specific+reinforcement+of+the+open+chromatin+landscape+via+cooperation+between+BAF+and+p63%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63.</a> Genome Biol. 16 (1), 284(2015).</li>
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ここで記述されている ATAC seq プロトコルは一次電池でアクセス可能なクロマチンの分析のため正常に採用されている (ヒト th1 細胞、Th2 細胞、B 細胞) 培養細胞株 (MCF10A ひと乳癌細胞と U261 神経膠芽腫細胞) だけでなく。ATAC seq を他の細胞型に適用すると、散のステップを中心に、いくつかのプロトコルの最適化が必要です。非イオン性洗剤の濃度が高すぎる、ミトコンドリアの DNA 汚染の割合が高いがあります。これは、核の収量を低下させることがなく換散バッファーの洗剤濃度を減らすことで削減できます。我々 の経験では、洗剤の 0.05% の換散バッファーは、最も満足な結果を与えた。さらに、固定角ロータ 500 は、ペレット内のミトコンドリアを削減する G フォースを減らすことを許可ではなくスイング バケツで核を回転します。研究者は、洗剤、たとえば、ジギトニン17の他の種類をテストも可能性があります。ただし、最適化された溶解条件があっても、ミトコンドリア Dna の汚染は避けられないです。MtDNA を完全に削除するには、CRISPR/Cas9 システムは使用され...

ATAC seq1,2は、ヌクレオソームの配置規制3クロマチン領域の同定を可能にする堅牢な方法です。この情報は、場所、id、および転写因子の活性を推定のために適用されます。クロマチン構造の定量的変化の測定法の感度では、クロマチンの remodelers 修飾子と RNA ポリメラーゼ II1の転写活性を含むクロマチン因子の活性の検討をことができます。したがって ATAC seq は興味の任意のセル型の転写制御を支配するメカニズムを解読するため強力かつ公平なアプローチを提供します。ATAC seq の主なヒト th1 細胞や Th2 細胞への適応について述べる。
ATAC-seq に非常に活発の Tn5 トランスポザーゼはアダプター (すなわち、「tagmentation」プロセス)1DNA のタグ付けされた次世代シーケンサー (NGS) カップル DNA 断片化アダプターを搭載。得られた DNA ライブラリー PCR 増幅、次次世代シーケンス (図 1) の準備ができました。アクセス可能なクロマチンの優遇の tagmentation は、ATAC seq 配列読み取りのローカル富の分析によって検出されます。
短い実験手順とクロマチン アクセシビリティと DNase seq4、放任 seq5、および MNase seq6などヌクレオソームの位置を測定するための他の方法を基準にして以下の原料のための要件は、します。人間の一次電池1,7臨床サンプル8と同様と単細胞生物9植物10、ショウジョウバエ11 を含む複数の生物学的システムでは ATAC seq の使用を促進と様々 な哺乳類12。
アクセスの軌跡にバインドされている要素は、バインド シーケンス モチーフの濃縮を分析または高スループット DNA シーケンス (続いてクロマチン免疫沈降 (チップ) と ATAC seq を組み合わせることで発見ことができます転写の idChIP-seq)。このアプローチは、マウス13での造血機構の重要な系統特異的転写因子の同定を有効にします。ATAC seq の公平かつグローバルな性質をチップ解析のための抗体などの試薬が利用できない有機体の遺伝子の規則を勉強することができます。Cis 諸国における進化バリエーションなど-初期マウス規制要素の発達的変動からヒトとチンパンジー14、頭部神経堤細胞の研究によって識別された規制地域胚15日は単細胞C. owzarzakiのライフ サイクル中に規制動向の変化9、およびプロモーターやエンハンサー1220 の哺乳類の種の間での進化。
ATAC seq はまた単一細胞におけるクロマチン アクセシビリティ通常ゲノム研究7,16を忌避する細胞集団内でこのように明らか変動を測定するため尽力されています。さらに、サンプルはまれな病態での遺伝子制御領域で発生した変更を勉強する ATAC seq を使用できます。急性骨髄性白血病 (AML)17またはRasの発症時規制の風景の変化を研究する ATAC seq を使用できますたとえば、-発癌11を駆動します。

<table><tbody><tr><td>50mLチューブ</td><td>ルミトロン</td><td>LUM-CFT011500-P</td><td>他のベンダーからでもかまいません。</td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td>Axygen Inc</td><td>MCT-175-C</td><td>他のベンダーからでもかまいません。</td></tr><tr><td>25mLの血清学的ピペット</td><td>Corning Costar</td><td>4489</td><td>他のベンダーからでもかまいません。</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ</td><td>ルミトロン</td><td>LUM-TCF-012-250-P</td><td>他のベンダーからでもかまいません。</td></tr><tr><td>Countes Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740952.5</td><td></td></tr><tr><td>末梢血単核細胞&nbsp;(PBMC)</td><td>ATCC</td><td>の&nbsp;PCS&shy;800&shy;011</td><td>他のベンダーからでもか</td></tr>まいません。<tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td>他のベンダーからでもかまいません。</td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液(200 mM)</td><td>バイオインダストリーズ</td><td>03-020-1B</td><td>他のベンダーからでも構いません。</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>生物産業</td><td>03-031-1B</td>は<td>、他のベンダーからすることができます。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS),&nbsp;熱不活性化、ヨーロッパグレードの</td><td>生物産業</td><td>04-127-1</td><td>他のベンダーからでもかまいません。</td></tr><tr><td>MACS CD4 microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD4 FITC</td><td>Biogems</td><td>06121-50</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 Isotype Control FITC</td><td>Biogems</td><td>44212-50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 (OKT3)</td> <td>Tonbo biosciences</td><td>40-0037</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD28SAFIRE 精製</td><td>バイオジェム</td><td>10311-25</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL4</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL12 p70</td><td>Peprotech</td><td>200-12</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)</td><td>とんぼ</td><td>40-7048</td><td></td></tr><tr><td>葉&nbsp;精製された反ヒトIFN-&γ;</td><td>BioLegend</td><td>506513</td><td></td></tr><tr><td>NaCl、分析グレード</td><td>カルロ・エルバ</td><td>479687</td><td>他のベンダーからでもかまいません。</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム、六水和物、分子生物学グレードの</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>他のベンダーからでもか</td></tr>まいません。<tr><td>EDTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>800682</td><td>他のベンダーからでもかまいません。</td></tr><tr><td>トリス、超高純度、純度99.9%</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td>他のベンダーからでもかまいません。</td></tr><tr><td>NP-40 代替品 (ノニルフェニルポリエチレングリコール)</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>他のベンダーからでもかまいません。</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td>Sigma</td><td>P2714</td><td>このプロテアーゼ阻害剤コクテイルは粉末です。100 x 溶液を 1 mL の分子生物学グレードの水で希釈します。</td></tr><tr><td>磁性固相逆固定化ビーズ:AMPure XPビーズ</td><td>ベックマン</td><td>63881</td><td></td></tr><tr><td>PCR精製キット</td><td>HyLabs</td><td>EX-GP200</td><td>他のベンダーからでもか</td></tr>まいません。<tr><td>Nextera DNAライブラリ調製キット(TDE1トランスポゼースおよびTDバッファー)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;CFX ConnectリアルタイムPCR&nbsp;検出&nbsp;System</td><td>Bio-rad</td><td>185-5200</td><td>他のベンダーからでもかまいません。</td></tr><tr><td>CFX Manager Software</td><td>Bio-rad</td><td>1845000</td><td></td></tr><tr><td>マスターミックス qPCR 用: iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>172-5124</td><td>他のベンダーからでもか</td></tr>まいません。<tr><td>Qubit 蛍光光度計 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Magnet for eppendorf tubes</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>他のベンダーからでもか</td></tr>まいません。<tr><td>15 mLファルコンチューブおよびエッペンドルフチューブ用のバケットを備えたスイングバケット冷却遠心分離</td>機 <td>Thermo Scientific</td><td>75004527</td><td>他のベンダーからのものである可能性があります。エッペンドルフチューブ用のバケツがあることが重要です。</td></tr><tr><td>サーモシェー</td><td>カーMRC</td><td></td><td>他のベンダーからでもかまいません。</td></tr><tr><td>高感度D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>高感度D1000試薬</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStationシステム</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>テープベースのプラットフォーム &nbsp; 電気泳動</td></tr><tr><td>高感度DNAキット</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>試薬高感度TapeStation解析</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プライマー名と配列</td><td>会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ad1_noMX:5'-AATGATACGGCGGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad1-noMx:5'-P5配列-トランスポザーゼ配列-3'Ad2.1_TAAGGCGA</td></tr><tr><td>:5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.1_expected インデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'Ad2.2_CGTACTAG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.2_expected インデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'</td></tr><tr><td>Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.3_expected インデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポゼース シーケンス-3'Ad2.4_TCCTGAGC</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGCGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.4_expectedインデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'Ad2.5_GGACTCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGCGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.5_expected インデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'Ad2.6_TAGGCATG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.6_expectedインデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'Ad2.7_CTCTCTAC</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.7_expected インデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポゼース シーケンス-3'</td></tr><tr><td>Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGCGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.8_expected インデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポゼーーゼ配列-3'Ad2.9_GCTACGCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGTGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.9_expectedインデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'Ad2.10_CGAGGCTG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGg. AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.10_expected インデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'Ad2.11_AAGAGGCA</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.11_expectedインデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'Ad2.12_GTAGAGGA</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.12_expectedインデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'</td></tr><tr><td>Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.13_expectedインデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポゼーーゼ配列-3'Ad2.14_ACCACTGT</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGCGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.14_expectedインデックス配列:5'-P7配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'Ad2.15_TGGATCTG</td></tr><tr><td>:5'-CAAGCAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.15_expectedインデックス配列:5'-P7配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'Ad2.16_CCGTTTGT</td></tr><tr><td>:5'-CAAGCAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.16_expected インデックス配列 読み取り: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポゼース 配列-3'</td></tr><tr><td>&nbsp;Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.17_expected インデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポゼーーゼ配列-3'</td></tr><tr><td>&nbsp;Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.18_expected インデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポゼーーゼ配列-3'Ad2.19_AGGTTGGG</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGCGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.19_expectedインデックス配列:5'-P7配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'</td></tr><tr><td>&nbsp;Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.20_expectedインデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポゼーーゼ配列-3'</td></tr><tr><td>&nbsp;Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.21_expected インデックス配列: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'Ad2.22_TGGTCACA</td></tr><tr><td>: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td><td>Ad2.22_expectedインデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'Ad2.23_TTGACCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGAAGCGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.23_expectedインデックス配列: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'Ad2.24_CCACTCCT</td></tr><tr><td>: 5'-CAAGCAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT</td><td></td><td></td> <td>Ad2.24_expectedインデックス配列 読み取り: 5'-P7 配列-[インデックス配列]-トランスポザーゼ配列-3'F1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGGGG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

atac seq による主なヒト t リンパ球のゲノム広いアクセス可能なクロマチンをマッピング

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

高スループット シーケンス (seq ATAC) とトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、クロマチンのオープン (アクセス) 領域の識別に使われる方法です。これらの地域は、転写因子をバインド規制の DNA 要素 (例えばプロモーター、エンハンサー、軌跡のコントロール領域、絶縁体) を表します。アクセス可能なクロマチン風景をマッピングは、ゲノム全体で暴くアクティブ規制要素の強力なアプローチです。この情報は、関連する転写因子ネットワーク、遺伝子発現プログラムを制御するクロマチン構造のメカニズムを発見するための公平なアプローチとして機能します。ATAC seq は DNase の堅牢な代替私過敏性解析は次世代シーケンス (seq DNase) とクロマチンのゲノム解析のため規制要素 (放任 seq) のホルムアルデヒドによる分離と相まってアクセシビリティと micrococcal のヌクレアーゼ感受性サイト ヌクレオソームの配置を決定する (MNase seq) の塩基配列の決定。人間の主な免疫細胞すなわちcd4 リンパ球に最適化した詳細な ATAC seq プロトコルを提案 (T ヘルパー 1 (Th1) と Th2 細胞)。この包括的なプロトコル細胞収穫始まるクロマチン tagmentation、次世代シーケンシングの前処理の分子プロシージャを記述し、方法および計算の分析するために使用に関する考慮事項も含まれます結果を解釈します。さらに、時間とお金を節約するシーケンスの前に ATAC seq ライブラリを評価する品質への取り組みを紹介します。重要なは、このプロトコルで説明した原則は、他のひと免疫系と非免疫細胞と細胞への適応を許可します。これらのガイドラインは次世代シーケンシング方法と熟練ではない研究所の役に立ちます。

このプロトコルの最終的な結果は、通常 3-20 ng/μ L の ATAC seq ライブラリです。DNA ・ インテグリティ解析のシステムで実行すると (材料/機器のテーブル参照)、はしごのような外観2 (図 3 a) を見せます。DNA のフラグメントの平均サイズは通常 〜 450 530 bp です。
次世代シーケンスを実行する前に ATAC seq ライブラリの適切な品質管理は、時間とお金を節約することが重要です。ライブラリを次世代シーケンサー (NGS) に適した我々 検討ポジティブ コントロールの濃縮が以上 25 〜、75 倍 (プライマーのペアが 3、4、それぞれ) を見せるとネガティブ コントロール (図 3 b) を基準にして、前述のヌ...

高スループット シーケンス (seq ATAC) と相まってトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、アクセス可能なクロマチンを明らかにするゲノム広い方法です。これは最終的な計算の分析は、人間のリンパ球 (Th1 ・ Th2) 用に最適化する分子からのステップバイ ステップ ATAC seq プロトコル。このプロトコルは、次世代シーケンシング法の経験なしの研究者採用できます。

ATAC Seq による主なヒト T リンパ球のゲノム広いアクセス可能なクロマチンをマッピング

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

トランスポゼースを用いたこのハイスループット法の全体的な目標は、ヒトゲノムのアクセス可能なクロマチン領域を同定することです。この方法は、制御要素のゲノムワイドな位置など、エピゲノム分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、堅牢で比較的短く、DNase-seqやFAIRE-seqなどの他のクロマチンアクセシビリティ測定方法に比べて必要な出発物質が少ないことです。この方法は、ヒトTリンパ球の制御状況に関する洞察を提供することができますが、他のヒト初代細胞、がん細胞、ヒト臨床サンプル、他の哺乳動物や生物の細胞など、他のシステムにも適用できます。1000万個のヒトPBMCの1ミリリットルアリコートを解凍し、10ミリリットルのRPMI培地を補充した50ミリリットルのチューブに移します。それらを、細胞を500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、補充したRPMI培地15ミリリットルに細胞を再懸濁します。次に、細胞をT-75培養フラスコに移し、加湿して一晩インキュベートします。翌日、無菌の25ミリリットルピペットで浮遊細胞を50ミリリットルのチューブに移します。次に、トリパンブルー排除を使用して生細胞をカウントします。次に、マイクロビーズ分離カラムを使用して、1,000万個の生きた非接着性PBMCからCD4陽性細胞を単離します。細胞が単離されたら、テキストプロトコルに従ってTh1およびTh2分極条件でT細胞を播種して活性化し、次にそれらの核を単離します。そのためには、新鮮な溶解バッファーを準備し、氷の上で冷やしておきます。また、転位反応に備えて、サーマルシェーカーを37°Cに温めます。次に、50万個のT細胞を1.5ミリリットルのマイクロチューブにロードし、摂氏4度で500Gで5分間スピンダウンします。次に、細胞を1ミリリットルの冷PBSで洗浄し、スピンサイクルを繰り返しますが、今度は細胞を1ミリリットルの冷溶解バッファーに懸濁します。核が破壊されすぎないように、穏やかなピペッティングで細胞を混合します。次に、10マイクロリットルのアリコートをすばやく取り、細胞の溶解画分を観察します。細胞を冷たく保ち、素早く作業するようにしてください。5分以内に転位反応を進めます。まず、100, 000個の核を1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、サンプルを500Gで10分間低温遠心分離機でスピンダウンします。次に、上澄みをそっと取り除きます。次に、転位反応成分を核に加えます。次に、穏やかなピペッティングで核を再懸濁し、サーマルシェーカーで核を500 RMPで30分間インキュベートして、転位反応を完了します。次に、DNAクリーンアップステップを行い、20マイクロリットルのトリス塩酸塩でDNA断片を溶出します。次に、PCRを使用して、ATACシーケンシングライブラリの初期増幅を行います。次に、定量PCRによる最終増幅に必要な追加サイクルの最適数を評価します。測定結果から、ATACシーケンシングライブラリの最終的なPCR増幅に必要なサイクル数を決定します。次に、最終増幅を実行します。DNAライブラリーフラグメントの最適なサイズを設定することで、次世代のシーケンシングを向上させることができます。まず、磁気ビーズを室温まで温め、ヌクレアーゼフリーの水で新鮮な70%エタノールを調製します。次に、ヌクレアーゼフリーの水をATACシーケンシングライブラリに100マイクロリットルの容量まで追加します。次に、50マイクロリットルの再懸濁DNA結合磁気ビーズを追加します。ビーズをDNAに少なくとも10回ピペットで取り込み、5分間待ちます。チューブの壁や蓋にビーズの滴が付着した場合は、チューブを短く回転させます。次に、サンプルを磁石の隣に2分間置き、上清を新しいマイクロチューブに移します。コレクションの量を測定し、70%の体積の磁気ビーズ懸濁液を追加します。前と同じようにビーズを混ぜ合わせ、5分間インキュベートしてから進めます。次に、磁石を使用してビーズを2分間分離し、上清を捨てます。磁石に逆らったまま、ビーズに200マイクロリットルの70%エタノールを追加します。30秒待ってからエタノールを捨て、もう一度エタノール洗浄を繰り返します。残りのエタノールを完全に取り除き、ビーズを磁石で5分間風乾させて洗浄を終了します。必要に応じて、チューブを短時間回転させ、10マイクロリットルのピペットで目に見えるエタノールを吸引します。次に、チューブを磁石から取り外し、22マイクロリットルの塩酸トリスを追加します。2分後、チューブを磁気スタンドに戻し、溶液を透明にします。次に、調製したライブラリーを含む溶出液を20マイクロリットル収集し、摂氏マイナス20度で保存します。このプロトコルは、通常、マイクロリットルあたり3〜20ナノグラムのATACシーケンシングライブラリを生成します。DNAインテグリティ解析用のシステム上で実行すると、はしごのような外観になります。とりわけ、もう一つの重要な品質管理は、ポジティブコントロールの充実です。ネガティブコントロールと比較して、プライマーペア3は少なくとも25倍濃縮する必要があり、プライマーペア4は少なくとも75倍濃縮する必要があります。最初の 1,000 万回の読み取り後、サンプルが FastQC レポートファイルのすべての重要なパラメーターを渡し、ピーク呼び出しから 1, 000 から 2, 000 のピークが得られた場合、ライブラリは 3,000 万回を超える読み取りに対してより深くシーケンスできます。品質基準を満たしたライブラリーから、ミトコンドリアゲノムにマッピングされるのはリードのわずか6〜20%です。残りの一意のリードは参照ヒトゲノムにマッピングされ、7〜12%はATACシーケンシングピーク内にあります。このビデオを見れば、ATAC-seqライブラリの作り方、配給塩のシーケンシングの提出方法、得られたデータの解析方法についてよく理解できるはずです。一度習得すれば、ATAC-seqライブラリの調製は1〜2営業日で完了します。この手順を試行する際には、まず、核単離ステップで細胞の数や溶解バッファーの組成など、いくつかのステップを最適化する必要があることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、クロマチン免疫沈降などの他の方法を実行して、検査したサンプルのオープンクロマチン領域にどの転写因子が結合するかなどの追加の質問に答えることができますか?

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオでは、タンパク質結合クロマチンフラグメントの選択的免疫沈降を介して、オリゴデンドロサイト前駆細胞のゲノムDNAの特定の領域上のタンパク質結合部位を特定するクロマチン免疫沈降技術を示しています。この方法は、遺伝子調節に関与する転写因子を含む、いくつかの調節タンパク質の相互作用を研究するのに役立ちます。...

ゲノムDNA上の標的タンパク質結合部位を同定するためのクロマチン免疫沈降法

ここでは、簡単な手動タンパク質沈殿ステップとオンラインカラム抽出を使用して、乾燥血液スポット中の免疫抑制剤タクロリムスを定量するための高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(HPLC-MS/MS)アッセイについて説明します。...

LC-MS / MSを用いて乾燥血液スポット上で免疫抑制タクロリムスの定量化

DNA 規制要素、エンハンサーなどは、物理的にゲノム長距離にまたがる長距離染色体相互作用を介して多くの場合、ターゲット遺伝子のプロモーターに連絡して遺伝子発現を制御します。プロモーターが PCHi ハをやあ-C...

プロモーター キャプチャこんにちは-c: 高解像度, ゲノム プロモーターの相互作用のプロファイリング

ここでは、活性化 cd4 人間リンパ球を (ATAC seq) をシーケンス処理トランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイを実行するプロトコルを提案します。プロトコルは、新しい換散バッファーの導入により 3% に 50% からミトコンドリア DNA...

主なヒト cd4 陽性 T リンパ球から低ミトコンドリア DNA 汚染 ATAC seq 試金

ここで著者らは、網膜におけるトランスクリプトームおよびクロマチンアクセシビリティプロファイルを特徴付ける際の表現型決定およびその後のscRNA-seqおよびscATAC-seqのペアに対するMULTI-seqの有用性を示す。...

scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析

ATAC-seqは、多動変異トランスポザーゼTn5を使用して、転写因子によって媒介されるクロマチンアクセシビリティの変化をマッピングするDNAシーケンシング法です。ATAC-seqは、がん細胞の表現型変化の根底にある分子メカニズムの発見を可能にします。このプロトコルは、がん細胞を含む上皮細胞タイプにおけるATAC-seqの最適化手順の概要を示しています。...

がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化

トランスジェニックレポーターマウスから単離された脂肪組織との核ソーティングを使用して、脂肪細胞上で特異的にトランスポザーゼアクセス可能なクロマチン(ATAC-seq)を核蛍光標識でアッセイするためのプロトコルを紹介します。...

蛍光活性化核ソーティングを用いた脂肪組織を用いた脂肪細胞特異的ATAC-Seq

この原稿では、マウスの骨髄から好中球のATAC-seqライブラリーを調製するためのプロトコルを概説し、最適な好中球の生存率と高いライブラリー品質を保証することを目的としています。BMCの調製、免疫磁気ソーティング、およびライブラリ構築に関するステップバイステップの説明を提供し、特に好中球の研究に新規参入する人にとって貴重なガイドとして機能します。...

マウス骨髄由来好中球のATAC-Seqライブラリー調製

ここでは、L4期 Caenorhabditis elegans...

Caenorhabditis elegans L4幼虫全体におけるクロマチンアクセス性プロファイリング

&gt;jove_content&lt;ここでは、細胞の単離からシーケンシング結果の基本解析まで、ゲノムワイドな哺乳類の複製タイミングをマッピングするための比較的迅速でシンプルなアプローチについて説明します。代表的な複製プログラムのゲノムマップは、プロトコルに従って提供されます。...

DNA含有量測定法による哺乳類の複製タイミングのゲノムワイドな決意

学ぶ ATAC-seq によるヒトTリンパ球のゲノム広いクロマチンアクセシビリティ解析。トランスポザーゼを用いたハイスループットシーケンスで、エピゲノム研究における制御領域の同定に有用です。

ATAC Seq による主なヒト T リンパ球のゲノム広いアクセス可能なクロマチンをマッピング

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