CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの in Vitro研究にミトコンドリア膜電位の検出
2018年7月17日
ローダミン 123 ミトコンドリア膜電位 (MMP) を識別し、CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの生体外の研究の適用のための詳しいプロトコルをご紹介します。一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡下で MMP のリアルタイム変更が記録されました。
この方法は、アポトーシスやミトコンドリアの機能障害の理解など、細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者が単一細胞内のrhodamine-123を介してミトコンドリア膜電位のリアルタイムモニタリングを簡単かつ適切に実施できることです。テキストプロトコルに記載されているように、頭頸部細胞扁平上皮癌からHN4細胞株を培養します。
トランスフェクションの1日前に、抗生物質を含まない培養培地のウェルあたり2ミリリットルの50万個の細胞を6ウェルプレートにプレートします。100ピコモルのCLIC4低分子干渉RNAまたはスクランブルされた低分子干渉RNAを、250マイクロリットルの還元血清培地で穏やかに希釈します。次に、5マイクロリットルのリポソーム試薬を250マイクロリットルの還元血清培地で希釈し、5分間インキュベートします。
希釈した低分子干渉RNAを希釈したリポソーム試薬と組み合わせ、穏やかに混合します。培地中の細胞を含む各ウェルに混合物を加えます。プレートを前後に揺らして優しく混ぜます。
細胞を37°CでCO2インキュベーターでインキュベートします。トランスフェクションの4時間後に培地を正常な増殖培地と交換してください。さらに20時間細胞をインキュベートし続けてから、rhodamine-123標識手順に進みます。
6ウェルプレートでHN4細胞のCLIC4低分子干渉RNA処理を行った後、ピンセットを使用して、新しい12ウェルプレートの底に円形のカバースリップを貼り付けます。12ウェルプレート内の各カバーガラスの中央に1ミリリットルあたり100マイクログラムのポリリジンを150マイクロリットルピペットで取り付けます。2分後、ピペッターでポリリジンを完全に除去します。
次に、皿の中のHN4細胞の培地を取り出し、0.25%トリプシンを1ミリリットル加えて細胞を剥離します。6分後、トリプシンを中和するために2ミリリットルの培地を追加します。HN4細胞をピペッターで5回穏やかに混合し、円形のカバースリップに細胞を播種します。
細胞を摂氏37度のインキュベーターに5%CO2で置きます。8時間のインキュベーション後、rhodamine-123のリットルあたり2マイクロモルを追加し、培地を数回上下に穏やかに混合して、培地に均一に分布するようにします。HN4細胞を摂氏37度で40分間インキュベートします。
ピンセットを使用してカバースリップを取り外し、予熱したNPSSバッファーに短時間移して残りの液体を洗い流します。カバースリップを500マイクロリットルのステンレス製チャンバーの底に置き、交換可能な25mmガラスカバースリップの底部をOリングで所定の位置に密封します。チャンバーの蓋を締めて、カバースリップを所定の位置に固定します。
組み立てたチャンバーに450マイクロリットルの予熱したNPSSバッファーを追加します。次に、蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡の視野の下に浴を置きます。製造元の指示に従って蛍光顕微鏡の電源を入れます。
イメージングシステムソフトウェアを開き、コマンドバーから新しいボタンを選択して、新しい実験を開始します。視野と焦点を調整して、白色光の中のセルの位置を見つけます。次に、ライトをオフにし、ボタンを押して白色ライトを閉じます。
コマンドバーのフォーカスボタンをクリックし、フォーカスの開始を選択して蛍光をオンにします。顕微鏡で、励起波長507ナノメートル、ロングパス発光波長529ナノメートルの細胞の位置を再度探します。視野を調整し、必要に応じて再度焦点を合わせます。
20〜30個の分離されたHN4セルのみを含む視野を選択します。クリアな視野が達成されたら、フォーカスバーからクローズフォーカスをクリックします。次に、コマンド バーから [取得] をクリックして、1 セットの画像を取得します。
次に、コマンドバーから領域をクリックし、[OK]ボタンをクリックして測定領域を編集します。個々のセルのさまざまな形状に合わせるには、トレース領域ツールを選択します。1 つのセルの領域を丸で囲み、終了したらダブルクリックします。
すべてのセルが丸で囲まれるまで、この手順を繰り返します。[完了]をクリックし、[画像を保存]を選択して、保存した場所を見つけます。ゼロクロックをクリックし、F4をすばやく押して、蛍光強度の変化の監視を開始します。
蛍光強度のリアルタイム変化を5秒ごとに5分間記録します。ベースラインが安定したら、50マイクロリットルのNPSSと0.5マイクロリットルの100ミリモル/リットルATPを混合してピペッターでチャンバーに加えます。製造元の指示に従って共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡の電源を入れ、付属のソフトウェアを開きます。
取得メニューの下の対物レンズをクリックして、63X 1.4 開口数式オイル対物レンズを選択します。標本を観察し、光野の下に明確な視野を見つけます。光選択ボタンを押して蛍光モードに切り替え、正しい蛍光フィルターを選択して、顕微鏡で暗闇下での細胞の位置を見つけます。
観察が終了したら、シャッターを押して試料を保護します。取得メニューで、適切なPMTチャネルを調整し、[達成]をクリックして、セトリングされた光路をアクティブにします。設定メニューをクリックし、レーザーを選択して必要なレーザータイプを決定します。
ライブをクリックしてリアルタイムの画像を取得し、視野に分離されたHN4細胞が20〜30個しか含まれていないことを確認します。次に、取得メニューの下の取得サブメニューで、取得モードでXYTを選択します。時間間隔を 5 秒、期間を 20 分に設定します。
すべてのパラメータが確定したら、[適用]をクリックします。[定量化] メニューで、ポリラインの描画ツールを使用して、各セルの記録領域を円で囲みます。ライン プロファイルを選択し、[開始] を選択して観測を行います。
蛍光強度のリアルタイム変化を5分間記録します。ベースラインが安定したら、ATP1リットルあたり100ミリモルの0.5マイクロリットルと混合した50マイクロリットルのNPSSをピペッターを介してチャンバーに加えます。一般的な蛍光顕微鏡を使用して統計解析を行うには、イメージングシステムソフトウェアを開き、コマンドバーから開くボタンを選択して、保存した実験を開きます。
コマンド バーから領域をクリックし、[OK] ボタンをクリックして測定領域を編集します。トレース領域ツールを選択します。1 つのセルの領域を丸で囲み、完了したらダブルクリックします。
すべてのセルが丸で囲まれるまで、この手順を繰り返します。「完了」をクリックし、「F4 進む」ボタンを選択して、蛍光強度を示すトレースを取得します。終了したら、グラフの右下隅にある下矢印ボタンをクリックし、[グラフデータの表示]をクリックします。
[OK]を2回クリックし、[ログデータ]ボタンを選択して、データ処理ソフトウェアのインターフェイスを開きます。次に、ログデータを再度クリックすると、スプレッドシートに表示される蛍光強度のリアルタイム変動の記録が検索されます。ここに示されているのは、一般的な蛍光顕微鏡法で解決された、さまざまな介入下でのHN4細胞におけるATP誘発性ミトコンドリア脱分極の変化を示す代表的な結果です。
ミトコンドリア膜の脱分極はATP治療後に急速に増加し、両群とも徐々に正常レベルまで回復しました。代表的な微量のローダミン-123蛍光強度は、対照群と比較して、CLIC4低分子干渉RNAのMMP処理がミトコンドリアの脱分極を促進したことを示しています。代表的なヒストグラムはさらに、CLIC4のノックダウンが対照群と比較してミトコンドリアの脱分極を促進することを明らかにしました。
ここでは、代表的な共焦点レーザー走査型顕微鏡の結果は、異なる介入下でのHN4細胞におけるミトコンドリア脱分極のATP誘発性変化も示しています。ミトコンドリア膜の脱分極は、ATP治療後に急速に増加し、両群とも徐々に正常レベルに回復します。ロダミン-123の蛍光強度の代表的な微量性は、CLIC4低分子干渉RNAのMMP処理が対照群と比較してミトコンドリアの脱分極を促進したことを示しています。
同様に、代表的なヒストグラムは、CLIC4のノックダウンが対照群と比較してミトコンドリアの脱分極を促進することをさらに明らかにしました。このビデオをご覧いただければ、rhodamine-123を使用して、通常の蛍光顕微鏡と共焦点レーザー走査型顕微鏡の両方でミトコンドリア膜電位のリアルタイムモニタリングを行う方法について理解を深めることができます。このローダミン-123を用いた顕微鏡法は、一度習得すれば、適切に実施されれば、1つのサンプルに対して20分以内に行うことができます。
この手順を試行する際は、スキャンプロセスを待つ間、注入中にチャンバーに接触しないように注意することが重要です。この手順に続いて、ウェスタンブロットやフローサイトメトリーなどの他の方法を実行して、アポトーシスや壊死が発生したかどうかなどのさらなる質問に答えることができます。その開発後、この技術は、生科学の分野の研究者がミトコンドリアの機能障害を探求し、さまざまな生細胞における細胞アポトーシスの確固たる証拠を見つけるための道を開きました。
rhodamine-123での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に手袋やフェイスマスクの着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
本記事では、rhodamine 123を用いてミトコンドリア膜電位（MMP）を評価し、HN4細胞におけるCLIC4ノックダウン誘発性アポトーシスを調査するためのプロトコルを紹介します。この手法により、蛍光顕微鏡技術を用いてMMPの変化をリアルタイムでモニタリングすることが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- アポトーシス研究
- ミトコンドリア機能
背景
- アポトーシスとミトコンドリア機能不全の理解は、細胞生物学において極めて重要です。
- Rhodamine 123は、MMPを測定するために使用される蛍光色素です。
- CLIC4は、細胞のアポトーシス機序に関与しています。
- HN4細胞は、頭頸部扁平上皮癌由来の細胞です。
研究目的
- 単一細胞におけるMMPを評価するための信頼性の高いプロトコルを開発する。
- CLIC4ノックダウンが細胞アポトーシスに及ぼす影響を調査する。
- アポトーシスにおけるミトコンドリアの役割への理解を深める。
使用した手法
- 抗生物質を含まない6ウェルプレートでHN4細胞を培養する。
- リポソーム試薬を用いて、CLIC4またはスクランブルsiRNAを細胞にトランスフェクトする。
- 蛍光顕微鏡を用いて、MMPの変化をリアルタイムでモニタリングする。
- CLIC4ノックダウンがアポトーシス率に及ぼす影響を解析する。
主要な結果
- MMPのリアルタイムモニタリングに成功した。
- CLIC4のノックダウンにより、HN4細胞においてアポトーシスが増加した。
- 本プロトコルは、研究者にとって使いやすいことが実証された。
- 本知見は、癌におけるミトコンドリア機能不全の理解に寄与する。
結論
- rhodamine 123プロトコルは、MMPの研究に有効です。
- CLIC4は、HN4細胞におけるアポトーシスの調節に重要な役割を果たしています。
- この手法は、ミトコンドリア関連のアポトーシスに関する今後の研究に寄与します。
よくある質問
業界における重要性
ミトコンドリア膜電位（MMP）を評価することで、アポトーシス誘導に関する初期のメカニズム的な知見が得られ、腫瘍学における創薬のターゲットバリデーションが可能になります。rhodamine 123を用いたリアルタイムMMPモニタリングは、分子レベルの摂動とミトコンドリアの機能的な結果を関連付けることで、メカニズム面のデリスキングを支援します。このアプローチは、形態学的変化が起こる前のアポトーシスへの移行を捉えることで、初期段階のターゲット評価における予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：CLIC4ノックダウン後の初期アポトーシス事象としてMMP崩壊を測定することにより、治療仮説を検証する。
- 運用的価値：汎用的な蛍光顕微鏡を用いて、ミトコンドリア機能不全をリアルタイムかつ単一細胞解像度で解析することを可能にする。
- 予測的価値：遺伝子的介入とミトコンドリアの機能的リードアウトを相関させることで、ターゲットのデリスキングを支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 定量的な蛍光強度トラジェトリを生成し、化合物誘発性のMMP変化を評価します。
- 運用的価値： 定義された励起/蛍光波長設定（507 nm/529 nm）を用いて、細胞集団全体のMMP測定を標準化します。
- 拡張性： ワイドフィールドおよび共焦点プラットフォームの両方に対応しており、柔軟なアッセイ展開が可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳的連続性：疾患に関連するHN4癌細胞において、ターゲット調節とミトコンドリア表現型を橋渡しします。
- メカニズムによるリスク低減：ターゲットのノックダウン後、アポトーシスがミトコンドリア経路を介して進行するかを明らかにします。
- 前臨床段階での整合性：CLIC4の抑制とMMPの調節不全を関連付けることで、バイオマーカーに基づいた意思決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、フェノタイプスクリーニングやリード最適化の前に、ターゲットエンゲージメントを機能的に検証する必要がある早期創薬ワークフローに適しています。
- ディスカバリーバイオロジー： HN4細胞において、CLIC4のノックダウンがミトコンドリアアポトーシス経路を活性化するかどうかを検証します。
- スクリーニング： 化合物ライブラリーの解析に適した、再現性のある定量的なMMP読み取り値を提供します。
- アナリティクス： 蛍光強度の経時的な追跡を可能にし、脱分極キネティクスおよび曲線下面積（AUC）指標を算出します。
- トランスレーショナルリサーチ： ミトコンドリアアポトーシスに関連する癌細胞モデルにおいて、標的効果を裏付けます。
- エンタープライズ再利用： オンコロジーの標的クラス全般に適用可能な、再利用可能なMMPアッセイプラットフォームを確立します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値： 直接的なMMP測定を通じて、アポトーシス誘導のメカニズムを明確にする。
- 運用的価値： 標準的な蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡のみで実施可能であり、特殊なインフラへの依存を最小限に抑える。
- 戦略的価値： 標的介在性のミトコンドリアのアポトーシスへのコミットメントを確認することで、go/no-go判断の精度を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： メカニズムの忠実性を早期に検証することで、標的の誤判定による偽陽性の進行を減少させる。
実施上の留意点
- 細胞培養、トランスフェクション、および蛍光顕微鏡観察の専門知識が必要です。
- 適切なフィルターセット（例：507 nm/529 nm）を備えた蛍光顕微鏡へのアクセスに依存します。
- ユーザー間での染色時間、染料濃度、および洗浄ステップの標準化が必要です。
- 長期アッセイでは、染料の毒性と流出の変動を考慮する必要があります。
- カバーガラスベースのイメージングに適した、接着性または半接着性細胞に限定されます。
バイオ製薬 FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Cell Transfection
2:08
Rh123 Labeling
4:21
Detection of the Mitochondrial Membrane Potential (MMP)
6:29
Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscope
8:34
Statistical Analysis
9:48
Results: Detection of Mitochondrial Membrane Potential via Normal Fluorescent Microscopy and Confocal Laser Scanning Microscopy
11:53
Conclusion
