遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成
2017年10月23日
遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌の世代の簡易・迅速かつ比較的安価な手法について述べる株;この手法は、様々 な種の遺伝子破壊系統の世代の適応可能性があります。
この手順の全体的な目標は、2段階の融合PCRとエレクトロポレーションを使用して、標的遺伝子破壊型ミュータンス連鎖球菌株を生成することです。この方法は、目的の遺伝子がどのように機能するかなど、微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、PCR以外の酵素反応が不要で、エレクトロポレーションのためのコンピテントセル調製が非常に簡単であることです。この方法は、Streptococcus mutans遺伝子破壊技術に関する洞察を得ることができますが、黄色ブドウ球菌などの他の微生物種にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、2回目のPCRのネストされたプライマーの有効性に精通していないため、苦労します。その手順を実演していただくのは、当研究室の研究指導員である岡田綾子先生です。この手順を開始するには、S.mutans UA159を脳の心臓注入またはBHI寒天プレートにストリークストックし、嫌気性条件下でプレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、滅菌したつまようじを使用して単一のコロニーを選び、5ミリリットルのBHIブロスに接種します。S.mutansの培養物を嫌気性条件下で摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、培養物を2000倍Gで15分間遠心分離します。上清を取り除き、細胞ペレットを5ミリリットルのPBSに再懸濁します。再度、Gの2000倍で15分間遠心分離します。得られた細胞ペレットを200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。ビーズビーティングベースのゲノムDNA抽出キットを使用して、懸濁液からゲノムDNAを抽出します。まず、細胞懸濁液をガラスビーズが入った2ミリリットルのサンプルチューブに移します。次に、750マイクロリットルの溶解液を細胞懸濁液に加えます。チューブにしっかりとキャップをし、ビーズビートディスラプション装置のチューブホルダーに対称的に配置します。最高速度で5分間処理します。ビーズで叩いたサンプルを 10 、 000 倍 G で 1 分間遠心分離します。上清を2ミリリットルの収集チューブ内のスピンカラムに移し、Gの7000倍で1分間遠心分離します。1200マイクロリットルのDNA結合バッファーを濾液に加え、800マイクロリットルの混合物を2ミリリットルのコレクションチューブ内のスピンカラムに移します。10, 000倍Gで1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。スピンカラムに200マイクロリットルの予備洗浄バッファーを加えて、カラムマトリックスを洗浄し、Gの10,000倍を1分間遠心分離します。フロースルーを廃棄し、スピンカラムに500マイクロリットルの洗浄バッファーを追加してカラムマトリックスを洗浄し、再度遠心分離します。各スピンカラムを新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに入れ、100マイクロリットルの溶出バッファーをカラムマトリックスに加えます。10, 000倍Gで30秒間遠心分離し、ゲノムDNAを溶出します。分光光度計を使用して260ナノメートルと280ナノメートルの吸光度を測定することにより、DNAの濃度と純度を推定します。最初のPCRは、S.mutans野生型ゲノムと合成ストレプトマイシン耐性遺伝子をPCRテンプレートとして使用して実行されます。グリコシルトランスフェラーゼCまたはgtfC遺伝子の上流隣接領域、gtfC遺伝子の下流隣接領域、およびスペクチノマイシン耐性遺伝子の3セットのプライマーをそれぞれ増幅するために使用します。各PCR産物を1%アガロースゲルで分画します。最初のPCRから得られた各製品のサイズは、約1 KBである必要があります。ゲルバンドカッターを使用して、対応するバンドを切り取り、テキストプロトコルに概説されているように、増幅された各DNA製品を精製します。次のステップは、3つのほぼ等しいモルフラグメントをPCRテンプレートとして使用して、2番目のPCRを実行することです。これらのフラグメントを適切なプライマーを使用して増幅およびスプライシングし、破壊コンストラクトを生成します。この手順の成功は、2回目のPCRによる破壊コンストラクトの増幅に依存するため、電気泳動によって2回目のPCR産物を確認することが重要です。PCR反応混合物の1/10を0.8%アガロースゲルにロードして、生成されたアンプリコンが予測されたバンドサイズを持つことを確認します。この例では、ネストされたプライマーの方がはるかに優れた増幅を示しました。残りのPCR混合物を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、55マイクロリットルの超純水を加えて、総量を100マイクロリットルに調整します。3モル酢酸ナトリウムpH 5.2の1/10容量を追加し、続いて2.5容量の100%エタノールを加え、マイナス80°Cで30分間凍結します。摂氏4度でGの15,000倍で20分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、チューブの底にペレットがあるかどうかを確認します。上清を捨てます。ペレットを1ミリリットルの70%エタノールで洗浄し、摂氏4度でGの15,000倍で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを約30分間風乾します。最後に、ペレットを10マイクロリットルの超純水に溶かします。コンピテントS.mutans UA159細胞は、以前にマイナス80°Cで50マイクロリットルのアリコートとして調製され、保存されました。電極間の距離が0.2センチメートルのエレクトロポレーションキュベットに混合物を追加します。エレクトロポレーション装置の黄色ブドウ球菌モードを使用してエレクトロポレーションを行います。エレクトロポレーションの直後に、細胞を500マイクロリットルのBHIブロスに懸濁し、50マイクロリットルの懸濁液をスペクチノマイシン含有BHI寒天プレートに加えます。プレートを37で2〜6日間インキュベートします
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概要
この記事では、Streptococcus mutansの遺伝子破壊株を生成するための迅速かつ費用対効果の高い方法を提示します。この技術は様々な細菌種に適応可能で、微生物学における遺伝子研究を進める可能性があります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 遺伝学
- バイオテクノロジー
背景
- Streptococcus mutansは虫歯の主要な細菌です。
- 遺伝子破壊技術は遺伝子機能を研究するために不可欠です。
- 既存の方法は時間と費用がかかる可能性があります。
- これらの方法を改善することで研究効率を高めることができます。
研究目的
- S. mutansの遺伝子破壊のための効率的な方法を開発すること。
- 他の種に適応可能なプロトコルを提供すること。
- 微生物学における遺伝学研究を促進すること。
使用された方法
- 遺伝子破壊技術はS. mutansに最適化されました。
- プロセスに費用対効果の高い材料が使用されました。
- 効率を高めるために迅速なプロトコルが確立されました。
- 他の細菌株に対する方法の適応性が評価されました。
主要な結果
- 新しい方法は遺伝子破壊株を成功裏に生成しました。
- 従来の方法と比較して時間とコストの節約が実証されました。
- 他の種への適応が実現可能であることが示されました。
- この技術は微生物学における遺伝子研究を加速する可能性があります。
結論
- この方法は遺伝子破壊の実用的なアプローチを提供します。
- 遺伝学研究で広く採用される可能性を秘めています。
- 将来の研究は様々な応用のためにこの技術を基に構築できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid, cloning-free gene disruption in Streptococcus mutans enables efficient functional genomics and accelerates target validation in microbial systems. This streamlined workflow reduces technical barriers and cycle times, supporting early-stage discovery and mechanistic de-risking for anti-infective R&D portfolios. The method's adaptability to other bacterial species enhances its strategic value for cross-species genetic interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function through targeted disruption and phenotypic comparison.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene roles in microbial physiology and pathogenicity.
- Facilitates rapid hypothesis testing for target prioritization in anti-infective discovery.
Screening & Assay Development
- Provides validated gene-disrupted strains for downstream phenotypic and functional assays.
- Improves reproducibility and standardization by eliminating complex cloning steps.
- Accelerates generation of screening-ready microbial models for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Enables creation of disease-relevant microbial models for translational studies when gene function is linked to pathogenicity.
- Supports continuity from genetic discovery to preclinical validation in infectious disease pipelines.
- Reduces risk of late-stage failure by clarifying gene-drug relationships early.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the early discovery and target validation stage, providing a foundation for downstream screening and translational research in microbial genetics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven gene function analysis and pathway mapping in bacteria.
- Screening: Delivers reproducible, gene-disrupted strains for robust assay development and compound testing.
- Analytics: Enables quantitative phenotypic comparisons between wild-type and disrupted strains.
- Translational Research: Facilitates model generation for preclinical studies when gene disruption impacts disease-relevant traits.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol allows broad application across bacterial species and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows by removing cloning bottlenecks and reducing hands-on time.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and portfolio triage in anti-infective discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by clarifying genetic mechanisms early in the pipeline.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PCR design, fusion PCR, and electroporation techniques.
- Needs access to standard molecular biology instrumentation and electroporation equipment.
- Demands cross-team standardization for reproducible construct generation and transformation.
- Adaptation to other species may require optimization of electroporation parameters and selection markers.
- Efficiency may vary with gene target and bacterial strain, requiring empirical validation.
