体外骨髄由来マクロファージによって髄鞘の残骸の貪食

蛍光に分類された髄鞘の残骸と細胞内脂質液滴染色を使用してプライマリ マウス骨髄由来マクロファージの貪食能を評価する手法を提案します。

このプロトコルの全体的な目標は、脳由来のミエリン破片の骨髄由来マクロファージ食作用を評価することです。このプロトコルは、神経外傷の分野における重要な質問に答えるように設計されています。この方法の利点は、in vitroでのマクロファージ応答、特に骨髄由来マクロファージのミエリン破片に対する食作用能を効率的かつ比較的費用対効果の高い方法で分析できることです。

この方法は、外部モジュレーターの影響を調査するために簡単に適応できます。マウスを70%エタノールで飽和させた後、腹部の皮膚に開口部を作ります。皮膚を後ろに引いて、解剖用の脚を露出させます。

このプロセス中に腹腔に穴を開けないように注意してください。露出したら、足首と腰を切って脚を外します。抗生物質を補給した氷冷したPBSに脚を置きます。

もう一方の脚についても繰り返します。抗生物質を添加した新鮮な氷冷PBSで組織を洗い、解剖中に組織に付着した可能性のある微粒子を取り除きます。筋肉に沿って緩やかに掻き取る動きは、不要な組織の大部分を取り除きます。

メスとピンセットを使用して、脛骨を筋肉と結合組織から解放します。解放されたら、両端を取り外して骨髄腔を露出させます。このプロセスを大腿骨に対して繰り返します。

完全な骨髄由来マクロファージ培地で満たされた20mmシリンジに25ゲージの針を貼り付けます。次に、骨髄腔を洗い流します。骨が十分に洗い流されると、骨は白く見えます。

採取した骨髄吸引液を18ゲージの針で30〜90秒間攪拌し、単一細胞懸濁液を得る。次に、懸濁液を無菌の70マイクロメートルの細孔径セルストレーナーに通します。細胞懸濁液を145cmの細胞培養皿に均等に分けます。

各マウスは、合計3つの皿に十分な量を提供します。7日間の培養後、これらの料理は通常、成熟したマクロファージと70〜80%コンフルエントになります。脳から粗ミエリン破片を単離するために、一連のショ糖勾配超遠心分離ステップが実施されます。

まず、8週齢から10週齢のマウスから10〜12個の脳を解剖します。次に、脳を0.32モルのスクロース溶液でホモジナイズし、次に0.383モルのスクロース溶液クッションに重ねて不連続な勾配を作成します。遠心分離後、粗ミエリンの破片が層間の界面に見つかります。

これを回収してトリス緩衝液に分注し、再度遠心分離してミエリン破片をペレット化します。ペレットをトリス緩衝液に再懸濁し、2本のチューブに分割して追加のセネトリフュージングを行います。まず、脳全体を取り出し、氷冷した0.32モルのスクロース溶液を入れた皿に入れます。

滅菌手術用ハサミを使用して、収集した脳を約5ミリメートルの大きさに切断します。このステップは、その後の均質化プロセスに役立ちます。組織を50ミリリットルのチューブに集めます。

ロータリーホモジナイザーを使用して、組織を滑らかなスラリーに均質化します。目に見える大きな脳の固形物がすべて完全に均質化されていることを確認してください。0.83モルのスクロース溶液を20ミリリットル入った超遠心チューブに、分離の維持に注意しながら生成し、均質化します。

0.32モルのスクロース溶液を使用して、各チューブのバランスを慎重に取ります。終了したら、チューブを適切な遠心分離機のローターに移し、重力の100,000倍、摂氏4度で45分間回転させます。加速と減速が最小値に設定されていることを確認します。

遠心分離が完了すると、ショ糖密度界面の間にミエリンの破片が見えます。ミエリンの破片をそっと集めます。収集したら、トリスバッファーをミエリンの破片に追加します。

ロータリーホモジナイザーで再度均質化します。ホモジネートを6本のクリーンな超遠心チューブに分割し、必要に応じて追加のトリスバッファーでチューブのバランスを取ります。集めたミエリンの破片を、重力の100, 000倍、摂氏4度で45分間、加速と減速を最大値に設定して再度遠心分離します。

遠心分離後、ミエリンはペレット化されます。Trisバッファーを使用して、ペレットを再懸濁します。再懸濁液と超遠心分離機を再度組み合わせます。

遠心分離後、密集したペレットが形成されます。スーパーネートをデカントします。ペレットを滅菌PBSに再懸濁します。

再懸濁したミエリン破片を、あらかじめ秤量した微量遠心チューブに均等に分割します。重力の22, 000倍で10分間遠心分離した後、PBSスーパーネートを除去します。ペレットを秤量した後、PBSで1ミリリットルあたり100ミリグラムの濃度に再懸濁します。

得られた粗ミエリンの破片は、現在、食作用の研究に適しています。CFSE標識ミエリン破片は、細胞内輸送だけでなく、早期の内在化を追跡するために使用できます。非標識ミエリン破片は、内在化脂質の貯蔵と代謝を評価するためのOil Red-O脂質染色に適合します。

マイナス80°Cで保管されたミエリンの破片を使用している場合は、まず29ゲージの針で再懸濁することをお勧めします。10ミリグラムのペレット化したミエリン破片を200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。次に、2マイクロリットルの5ミリモルCFSE溶液を追加します。

ピペットで混ぜます。光とその後の洗浄から保護された30分間のインキュベーション後、PBSでミエリン破片を1ミリリットルあたり100ミリグラムに再懸濁します。培養後、4%パラホルムアルデヒドで固定した後、各ウェルに100%プロピレングリコールを添加します。

室温で5分間インキュベートした後、各ウェルにOil Red-O染色溶液を加えます。穏やかに攪拌しながら摂氏60度で8分間インキュベートします。プレートをゆっくりと傾けて、Oil Red-Oの汚れを完全に吸引できるようにします。

各ウェルに85%プロピレングリコールを添加します。室温で5分間インキュベートした後、PBSでウェルを洗浄し、選択した核色素で細胞を染色します。培養中の骨髄細胞の代表的な光学顕微鏡画像。

最初の播種から24時間後、接着細胞はほとんど存在しません。しかし、マクロファージコロニー刺激因子であるM-CSFの存在下では、白血球前駆細胞は分化し始めます。M-CSFの存在下で7日間培養した後、前駆細胞は食作用が可能な成熟骨髄由来マクロファージに完全に分化します。

この方法を使用すると、生後8〜10週齢のC57 black 6Jマウス1匹は、通常1,800万〜2,400万個の骨髄マクロファージを産生します。インターナリゼーションを視覚化するために、CFSE標識ミエリン破片を骨髄由来マクロファージ培養物に添加します。細胞は、4%パラホルムアルデヒドで洗浄および固定する前に、1ミリグラム/ミリグラムのCFSE標識ミエリン破片で1時間処理しました。

内在化したミエリン破片は、落射蛍光対応顕微鏡の標準的なGFPフィルターセットを使用して視覚化できます。ミエリン脂質の蓄積が経時的にどのように変化するかを示すために、マクロファージを非標識ミエリン破片で90分間処理し、その後、さまざまな時点で洗浄して固定しました。洗濯直後は、脂肪滴がほとんど見えません。

しかし、時間が経つにつれて、より多くの脂肪滴が見えるようになり、洗濯後約24時間で最大に達します。マクロファージは代謝を開始し、脂質貯蔵庫に排出され、染色可能な液滴の数が減少します。Oil Red-O染色を定量化するために、落射蛍光対応顕微鏡を使用して、各時点のサンプルからランダムに取得した5枚の画像を取得しました。

Oil Red-O-stained 領域は、DsRed チャネルでキャプチャされた画像を使用して、各ウェルについて決定されました。細胞の総数は、各フィールドに存在する核の数を数えることによって決定されます。このグラフは、結果の定量化を示しています。

骨髄由来のマクロファージが内在化されたミエリン脂質を中性脂質に変換するため、Oil Red-O陽性シグナルの着実な増加が一般的です。Oil Red-O陽性シグナルの減少は、マクロファージが脂質を代謝または排出し始める24時間でピークに達します。このビデオをご覧になった方は、初代骨髄由来マクロファージを単離して培養する方法や、新たに単離された脳由来ミエリン破片との相互作用を研究する方法について、よく理解できるはずです。

これらの手順の最も重要な部分は、常に無菌技術を適切に維持することです。マクロファージは少量の病原体関連分子に強く反応するため、結果を偏らせる可能性のある相互作用を最小限に抑えることが重要です。これらの技術の主な利点は、生物学的に関連性のある初代細胞と新鮮なミエリンの破片を作り、必要な特殊な機器の量を排除できることです。

さらに、ユーザー最適化を行うことで、これらの手法を容易に適応させ、骨髄由来マクロファージのミエリン破片に対する応答に関するさまざまな問題に対処することができます。蛍光標識されたミエリン破片と有髄マクロファージのOil Red-O染色の両方を利用することにより、さまざまな神経外傷に苦しむ患者に対する潜在的な治療介入を調査することが可能です。このような研究の全体的な目標は、マクロファージを介した遠隔細胞破片の除去により、炎症の解消を促進することです。