Name: 体外骨髄由来マクロファージによって髄鞘の残骸の貪食 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 学ぶ骨髄由来マクロファージによる髄鞘残骸の貪食評価法。マウス骨髄細胞の培養と蛍光標識を用いたin vitro解析により、神経外傷におけるマクロファージ応答を効率的に研究できます。

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著者は、グレン ・ サンガー ・ ホジソン、ビデオ制作、編集、音声のすべての彼の仕事のため旧ソ連医科大学、メディアの専門家に感謝したいと思います。
この作品は、国立衛生研究所 (R01GM100474 および R01GM072611) によって支えられました。

メソッドここで説明のセクション 2 では、フロリダ州立大学機関動物のケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、ケアと 8th版実験動物の使用のためのガイドに定めるガイドラインに従います.このプロトコルでは、これのすべての動物は、使用まで専用の実験室の動物実験施設で家をしています。生体内で実験を犠牲にする前に実行がありませんでした。動物の数字は、使用量を最小限に抑えるためにガイドとして平均セルとミエリンのコレクションを使用して実験の必要性に基づいていた。
注:このプロトコルを記述する骨髄由来マクロファージ (BMDMs) (セクション 1) 蛍光に分類された脳由来の髄鞘の残骸 (セクション 2)、髄鞘の残骸貪食 (セクション 3) を分析するための一般的な手順の準備の世代と髄鞘の残骸の脂肪蓄積 (セクション 4) の分析のための一般的な手順です。試薬調製、セルを収穫し操作、ミエリン コレクション、ラベル付け、およびアッセイ パフォーマンスは層流気流バイオ セーフティ キャビネットで完了する必要があります。
1. プライマリ骨髄由来マクロファージの生成
<ol>
	<li>完全なマクロファージ培養培地 (CMCM) の準備 注:から骨髄マクロファージ世代大食細胞のコロニー刺激因子 (M-CSF) の使用が必要です。この準備は、M-CSF のソースとして L929 マウス線維芽細胞エアコン メディアを利用しています。<ol>
		<li>50 mL の高グルコース (4500 mg/L L ブドウ糖) ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 5% 新しい生まれた子牛血清 (NCS) とペニシリン/ストレプトマイシンを 7 日間で 145 mm 皿で培養細胞による L929 マウス線維芽細胞エアコン メディアを生成します。</li>
		<li>3500 × g、4 ° C で 30 分間、50 mL コニカル遠沈管および遠心分離機に文化からメディアを収集します。</li>
		<li>0.2 μ m のシリンジ フィルターを通して培養上清を新しい 50 mL の円錐形遠心管にフィルターします。エアコン メディアは、最大 6 ヶ月間-80 ° C で保存できます。</li>
		<li>高グルコース DMEM、5% 巻/巻 NCS を追加、15% 巻/巻 L929 マウス線維芽細胞エアコン DMEM、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン。メディアは、2-3 か月の 4 ° C で保存できます。使用する前に 37 ° C に暖かい。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>主な骨髄細胞とマクロファージ誘導のコレクション 
	注:このプロトコルの 1 つのマウスを使用して、約 2000 万骨髄由来マクロファージ (BMDMs) が生成されます。<ol>
		<li>8-10 週間の標準的な CO2窒息ガイドラインを使用して古いマウスは続いて頚部転位の桁数を安楽死させます。</li>
		<li>70% (巻/巻) エタノール: H2O を使用し、毛皮を飽和動物をサニタイズします。</li>
		<li>腹部に小さな開口部をカットし、基になる組織を明らかにするため皮膚を慎重に引いてください。腹腔穿刺に注意してください。</li>
		<li>両方の後ろ足の股関節から始まると足首で終わるを削除します。場所 5-10 mL 滅菌リン酸を含む 100 mm のペトリ皿に収集した組織緩衝生理食塩水 (PBS) 1% を添加したペニシリン/ストレプトマイシン。 
		注:組織の劣化を制限する氷の上の皿を維持するとき確認いくつかの動物を処理します。</li>
		<li>メスを使用して骨から筋肉や結合組織を削除します。大腿骨と脛骨のみ使用されますセルのコレクションの腓骨を破棄できます。</li>
		<li>メスの各端からの小さなセクションをトリミングすることによって収集された骨の髄腔を公開します。</li>
		<li>25 g の針を使用して、50 mL の円錐形遠心チューブに CMCM と骨髄腔をフラッシュします。骨は、一度十分にフラッシュされている白表示されます。</li>
		<li>コレクションが完了すると、単一細胞懸濁液を生成する 30-90 s のための 18 g 針で吸引を振りま します。 
		注:この時点で、オプションの赤い血球 (RBC) 換散のステップが行われます。最近、細胞内の鉄分がマクロファージ偏波16髄鞘の残骸の影響に影響を及ぼすことが示唆されています。赤血球の包含について散のステップは、Trouplinらを参照してください。17。</li>
		<li>新しい 50 mL の円錐形遠心管に 70 μ m 無菌細胞ストレーナー懸濁液をフィルタ リングします。</li>
		<li>種子は、15 〜 20 mL CMCM を含む 145 mm 細胞培養皿に均等に細胞を収集しました。マウスを犠牲にしたあたりの約 3 つの培養皿を使用します。37 ° c、5% CO2文化を孵化させなさい。</li>
		<li>72 時間は、非付着性のセルを削除する滅菌 PBS で 1 回プレートを洗って後、15 ~ 20 mL を追加新鮮な CMCM。37 ° C、5% CO2でさらに 4 日間文化を孵化させなさい。総文化の日の 7 日後、最初に分離した造血骨髄細胞は成熟した BMDMs (図 1) になります。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脳由来の蛍光に分類された髄鞘の残骸の世代
注:すべての試薬は、1 ヶ月の 4 ° C で保存できます。
<ol>
	<li>髄鞘の残骸のコレクション試薬の調製
	<ol>
		<li>Tris· を準備します。Cl 緩衝液。<ol>
			<li>800 mL 蒸留脱イオン H2O (ddiH2O) 追加 1 M Tris· 20 mLCl、ナ2EDTA (最終濃度が 2 mM) 100 mM の pH 7.45 (最終濃度が 20 の mM) および 20 mL。</li>
			<li>7.45 に pH を調整します。DdiH20.2 μ m ろ過ユニットを介して o. フィルター ソリューションと 1000 の mL にボリュームを調整します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>1 M ショ糖液を準備します。<ol>
			<li>Tris· 100 mlCl バッファー溶液、ショ糖の 68.46 g を追加。Tris· と 200 mL にボリュームを調整します。Cl 緩衝液。0.2 μ m のろ過装置を通してソリューションをフィルター処理します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tris· で 1 M 溶液を希釈することによって 0.32 M ショ糖溶液 200 mL を準備します。Cl バッファー ソリューション 0.83:0.16 (巻/巻)。</li>
		<li>Tris· で 1 M 溶液を希釈することによって 0.83 M ショ糖溶液 150 mL を準備します。Cl バッファー ソリューション 0.83:0.16 (巻/巻)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脳由来の原油髄鞘の残骸のコレクション 
	注:ここで説明するコレクション メソッドは、原油髄鞘の残骸の隔離のためです。<ol>
		<li>10-12 マウス頚部転位続いて CO2窒息の標準のガイドラインを使用して年齢の 8-10 週を安楽死させます。</li>
		<li>脳を解剖し、0.32 M ショ糖溶液の 10 mL を含む 100 mm ディッシュに配置します。</li></ol></li></ol>氷の上の皿を保ちます。
		<li>約 5 mm3の大きさの部分に脳をカット滅菌手術用はさみを使ってします。</li>
		<li>50 mL の円錐形遠心管に組織を転送し、約 0.32 M ショ糖液 30 mL を追加します。</li>
		<li>スムーズな解決が達成されるまで滅菌手持ち回転式ホモジナイザーをホモジナイズしてください。</li>
		<li>0.32 M ショ糖液 90 mL の最終巻に均質化された脳を希釈します。</li>
		<li>6 38.5 mL 薄肉ポリプロピレン遠心チューブ、0.83 M ショ糖溶液の 20 mL を追加します。</li>
		<li>優しくホモ脳ソリューションを 2 つの層をミックスしないように世話 0.83 M ショ糖液の最上部に追加します。</li>
		<li>0.32 M ショ糖液各管のバランスをとる。</li>
		<li>100,000 × g で遠心する適切なを使用して 4 ° C の 45 分の事前超遠心機のローターを冷却しました。ロータ加速と減速を髄鞘の残骸の損失を低減する最小値に設定します。</li>
		<li>ショ糖密度の 2 つのインタ フェースから髄鞘の残骸を収集します。 
		注: 破片は管の中心に向かって白いバンドとして表示されます。</li>
		<li>50 mL の円錐形遠心チューブに原油ミエリンの破片を組み合わせるし、約 35 ml Tris· を使用して音量を調整します。Cl 緩衝液。</li>
		<li>30-60 秒の滅菌手持ち回転式ホモジナイザーを用いた原油の髄鞘の残骸を均質化します。</li>
		<li>6 きれいな遠心チューブと Tris· の適切な量とバランスの懸濁液を均等に分割します。Cl 緩衝液。</li>
		<li>100,000 × g で遠心する適切なを使用して 4 ° C の 45 分の事前超遠心機のローターを冷却しました。ローターの加速と減速を最大値に設定します。</li>
		<li>固体白いペレットが表示されます、上澄みを廃棄、再 Tris· の 10-15 mL にペレットを中断Cl 緩衝液。</li>
		<li>2 きれいな遠心チューブと Tris· の適切な量とバランスの懸濁液を均等に分割します。Cl 緩衝液。</li>
		<li>遠心分離機再び 4 ° C、適切なを使用しての 45 分の 100,000 × g で事前冷却遠心ローター。ローターの加速と減速を最大値に設定します。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、5-6 mL の滅菌 PBS でペレットを再懸濁します前体重 1.5 mL マイクロ遠心チューブの適切な数の間の懸濁液を分割します。</li>
		<li>22,000 x g で 4 ° C で 10 分間遠心</li>
		<li>上澄みを廃棄し、髄鞘の残骸のペレットの重量を決定します。</li>
		<li>100 mg/mL の最終的な集中に PBS でペレットを再中断します。 
		注: 10 から 12 の脳は 100 mg/mL の髄鞘の残骸の 10-15 mL を生成するのに十分です。髄鞘の残骸は、6 ヶ月間-80 ° c ストアをすることができます。</li>
	
	
	<li>髄鞘の残骸の蛍光標識
	<ol>
		<li>使用直前に 50 μ M carboxyfluorescein 染色エステル (CFSE) ソリューションを準備します。<ol>
			<li>CFSE 100% ジメチルスルホキシド (DMSO) を 50 μ M の最終作業濃度と準備の 5 mM の原液を希釈滅菌 PBS を使用すると。</li>
			<li>0.2 μ m のシリンジ フィルターを通してソリューションをフィルターします。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>100 mg/mL の髄鞘の残骸の必要な量を解凍し、再滅菌の 29 g 針を停止できます。 
		注: 髄鞘の残骸を凍結に使用する前に再懸濁が必要な解決から落ちる原因となります。</li>
		<li>あらかじめ重量を量られた 1.5 mL マイクロ遠心チューブに髄鞘の残骸を転送します。</li>
		<li>14,800 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上清を捨てます。</li>
		<li>ペレット 100 μ L ミエリン破片ごと CFSE ソリューションの 200 μ L に髄鞘の残骸を再懸濁します。</li>
		<li>光から保護部屋の温度 (RT) で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>14,800 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上清を捨てます。</li>
		<li>洗浄バッファーの 600-800 μ L でペレットを再懸濁します (0.2 μ m フィルター滅菌 PBS で 100 mM グリシン)。</li>
		<li>14,800 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上清を捨てます。</li>
		<li>手順 2.3.8-2.3.9 倍を繰り返します。</li>
		<li>最終的な洗浄後髄鞘の残骸のペレットの重量を決定して再滅菌 PBS と 100 mg/mL に中断します。 注: ラベル付けされた髄鞘の残骸は最大 6 ヶ月間-80 ° c ストアをすることができます。</li>
	</ol>
	</li>

3. 髄鞘の残骸貪食アッセイ
注:以下は、蛍光に分類された髄鞘の残骸の貪食能を観察する基本的な方法です。他のトリートメントや実験条件の付加は調査官によって最適化する必要があります。
<ol>
	<li>治療プレートの準備
	<ol>
		<li>各 145 mm プレート 10 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 5-6 mL を使用して 15 mL コニカル遠心管にダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (dPBS) (pH 7.4) の成熟した BMDMs を収集します。 
		注:18細胞のアクティブ化の状態を変えるかもしれないので、トリプシンを使用しないでください。</li>
		<li>集められたセルの各チューブに予め温めておいた CMCM の等しい量を追加します。</li>
		<li>180 x g で 20 ° C で 8 分間遠心上清を捨てます。</li>
		<li>再細胞 CMCM とカウントを中断します。</li>
		<li>24 ウェル細胞培養プレートのウェルに CMCM の 1 mL で 1 x 10 の5セルを追加します。</li>
		<li>37 ° c、5% CO2 24 時間孵化させなさい。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>髄鞘の残骸処理と解析
	<ol>
		<li>100 mg/mL CFSE の 10 μ L (最終濃度が 1 mg/mL) 各ウェルに髄鞘の残骸のラベルを追加します。</li>
		<li>37 ° C、5% CO21 3 時間孵化させなさい。</li>
		<li>包まれている非髄鞘の残骸を削除する滅菌 PBS で 3 回プレートを洗います。</li>
		<li>4% のパラホルムアルデヒドの 400 μ L を各ウェルに追加します。室温 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>滅菌 PBS で 2 回プレートを洗います。</li>
		<li>ヘキスト 33258 ソリューションの 400 μ L を各ウェルに追加します。光から保護された RT で 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>滅菌 PBS で 2 回プレートを洗います。</li>
		<li>退色を抑える各ウェルに Tris バッファー フッ素ゲルの 200 μ L を追加します。</li>
		<li>倒立のエピ蛍光ことができる顕微鏡を用いたイメージ セルです。 
		注:CFSE の励起・発光波長が 494 nm と 521 nm、それぞれ。</li>
		<li>相対的な髄鞘の残骸取り込みを決定する核の数によって CFSE 陽性細胞の数で割ります。</li>
		<li>画像、前に光から保護 4 ° C で 7 日前までのプレートを維持します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. オイル赤 O 染色による細胞内脂質の定量化
注:髄由来の破片の細胞内の脂質を観察する基本的な方法は以下です。CFSE 髄鞘の残骸のラベルの使用はスペクトルの重なりによる染色オロの蛍光定量化のため推奨されません。他のトリートメントや実験条件の付加は調査官によって最適化する必要があります。
<ol>
	<li>汚損の解決の準備
	<ol>
		<li>0.5% オイル赤い O (オロ) の染色液を準備します。<ol>
			<li>ゆっくりとオロ (攪拌しながら 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) 0.5 g に 100 mL 100% プロピレング リコール (1, 2-プロパンジ オール) を追加します。</li>
			<li>95 ° c 15 分またはすべての大きな粒子が溶解するまでソリューションを加熱します。 
			注: 100 ° C 以上に加熱しないでください</li>
			<li>新しいコンテナーにまだ暖かい間、フィルター紙を通じてソリューションをフィルターします。</li>
			<li>室温は、1 年間し、RT。 ソリューションで一晩冷却ソリューションを格納できる許可します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>85% プロピレング リコール溶液を準備します。<ol>
			<li>DdiH2o ・攪拌混合されるまでの 15 mL に 100% プロピレング リコールの 85 mL を追加します。室温は、1 年間にソリューションを保存できます。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>治療プレートの準備
	<ol>
		<li>次のセクション 3 で説明する方法 24 ウェル プレートを準備します。</li>
		<li>37 ° c、5% CO2 24 時間孵化させなさい。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>髄鞘の残骸の治療
	<ol>
		<li>(最終濃度が 1 mg/mL) 各ウェルに 100 mg/mL の髄鞘の残骸の 10 μ L を追加します。</li>
		<li>37 ° C、5% CO21-3 時間孵化させなさい。</li>
		<li>非消化髄鞘の残骸を削除する滅菌 PBS で 3 回プレートを洗います。 この時点で、プレートは、即時固定を受けることができるかまたは新鮮な CMCM を追加でき、メモ: 追加の時間ポイントのインキュベーションに返されるセル。</li>
		<li>4% のパラホルムアルデヒドの 400 μ L を各ウェルに追加します。室温 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>2 回で滅菌 PBS、染色からプレートを洗います。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>オロの染色と分析
	<ol>
		<li>DdiH2o. で 3 回固定プレートを洗う</li>
		<li>各ウェルに 100% プロピレング リコールの 400 μ L を追加し、室温 5 分間インキュベート 
		注: これは ddiH2o. のキャリー オーバーを削減</li>
		<li>プロピレング リコールを吸引し、オロ ソリューションの 400 μ L を各ウェルに追加します。</li>
		<li>60 ° C で 8 分間インキュベートします。</li>
		<li>オロ ソリューションを吸い出しなさい。各ウェルに 85% プロピレング リコールの 400 μ L を追加し、室温 5 minumintes インキュベート</li>
		<li>DdiH2o. で 3 回洗浄プレート</li>
		<li>ヘキスト 33258 ソリューションの 400 μ L を各ウェルに追加します。光から保護、常温 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>滅菌 PBS で 2 回プレートを洗います。</li>
		<li>各ウェルに Tris バッファー フッ素ゲルの 200 μ L を追加します。</li>
		<li>倒立のエピ蛍光ことができる顕微鏡を用いたイメージ セルです。オロは、標準テキサス赤や下流のフィルター セットを使ってイメージ化されることができます。</li>
		<li>各イメージ フィールドにオロ肯定的な領域を決定する核の数で割って算出して相対的な脂質保持を定量化します。</li>
		<li>4 ° C で 7 日間のプレートは、光から保護を維持します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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著者の開示があります。

ここで説明する手順は、新鮮単離粗中枢神経系ミエリン破片とプライマリ骨髄由来マクロファージを利用します。動物の支出を減らすためには、両方の脳をお勧めします、犠牲の時に各マウスの骨髄細胞を収穫します。一緒に働く 2 つの研究者は、同時に両方の材料を準備できます。また、脳は髄鞘の残骸の分離前に抗生物質を添加した PBS で-80 ° C で保存できます。脳の私たちの経験は、髄鞘の残骸ポテンシャルのないかなりの損失とは、1 ヶ月のこれらの条件で維持できるとしています。
CFSE は、その使いやすさと蛍光強度のための髄鞘の残骸のラベルに使用されます。染料のまま細胞エステラーゼ分子14酢酸グループを切断する焼入れ。解放された染色エステル グループ、細胞蛋白質14キャラクタリゼーションの結果一次アミドと反応できます。CFSE は興奮標準緑蛍光チャネルを使用して、異なるスペクトル特性を持つ市販いくつかの誘導体があります。したがって、複数の蛍光色素を用いた似たような貪食能アッセイを設計することが可能です。...

骨髄由来マクロファージ (BMDMs) は、自然免疫と適応免疫システム間の重要なリンクです。抗原提示細胞 (APCs)、彼らは両方の抗原提示によるリンパ球と通信できるし、サイトカインのリリース1,2,3。しかし、プロの食、主な機能は病原体、高齢者の細胞および細胞残骸1,4をクリアします。脊髄損傷 (SCI)、次は、中枢神経系の軸索の髄鞘化5担当細胞型死ぬオリゴデンドロ サイトから髄鞘の残骸の相当な量が生成されますように。私たちと他の人は髄鞘の残骸のクリアランスが主に浸潤 BMDMs5,6、7の責任であることを示しています。しかし、脊髄損傷で炎症状態5,8,9に向けてこれらの通常抗炎症のセルをシフトさせるサイト髄鞘の残骸の貪食を示唆されています。脊髄損傷における神経炎症の主要メディエーターとして BMDMs、重要な臨床目標です。
脊髄損傷の BMDMs の影響を調査するため、直接 BMDMs と髄鞘の残骸の対応を研究する生体外モデルを開発しました。生物学的関連性を高めるためには、プライマリ マウス BMDMs と新鮮単離髄鞘の残骸の両方はこれらの調査で使用されます。プライマリ マウス BMDMs の分離文化紹介方法についても詳しく説明し、マウス中枢神経系を分離するために使用変更されたショ糖勾配法は髄鞘の残骸10、11,12派生します。髄鞘の残骸は、蛍光染料、carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE)、BMDMs。 CFSE によってその内面は非細胞傷害性だからこのアプリケーションに適してトラックとその狭い蛍光スペクトル許可で容易にラベル付けできます。その他の蛍光多重13,14をプローブします。次の貪食、髄鞘の残骸の脂質は、リソソームを経由、細胞内脂質液滴5に中性脂質としてパッケージします。この細胞内の脂質の蓄積を定量化するには、オイル赤い O (オロ) 染色法の定量的画像解析の最適化を提案する.この単純な染色法は、堅牢な再現性のある結果と定量化15を生成します。これらのメソッドは、限られた特殊な設備とミエリンの破片貧食能および脂質保持の研究を促進します。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム</td></tr>ペ<tr><td>ニシリン-ストレプトマイシン溶液</td>を含む高グルコース <td>コーニング</td><td>30-002-CI</td><td>100X 溶液</td></tr><tr><td>新生牛血清 (NCS)</td><td>ロッキーマウンテンバイオロジクス</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>米国起源</td></tr><tr><td>NCTC クローン 929 [L 細胞、L-929、L株の誘導体]&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 馴染培地調製の細胞株</td></tr><tr><td>24ウェル細胞培養プレート</td><td>VWR</td><td>10062-896&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養ディッシュ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>ポリスチリン、145/20mm</td></tr><tr><td>CFSE 細胞増殖キット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>C34570</td><td>DMSO レコンシチュジョン用</td></tr><tr><td>トリスバッファー付きフルオロゲル&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>オイルレッド O</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tubes</td><td>ベックマン・コールター</td><td>326823</td><td>薄肉、ポリプロピレン、38.5 mL、25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti 超遠心分離機ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti ローター、スイングバケット、チタン</td></tr><tr><td>ハンドヘルドロータリーホモジナイザー</td><td>フィッシャーサイエンス</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

体外骨髄由来マクロファージによって髄鞘の残骸の貪食

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

骨髄由来マクロファージ (BMDMs) は、さまざまな粒子をクリアできるプロの食として重要な生理的役割を果たす成熟した白血球です。通常、中枢神経系 (CNS)、BMDMs が制限されているが、外傷後に容易に侵入することができます。一度負傷した中枢神経組織内 BMDMs、外傷由来の細胞の残骸を含む脂質豊富な髄鞘の残骸の大量のクリアランスに対して責任がある一次電池タイプです。中枢神経系内 BMDM 浸潤と髄鞘の残骸貪食能の神経病理学的影響が複雑でも理解していません。ここで、説明プロトコルは、BMDMs の直接の in vitro研究中枢神経損傷のコンテキストで許可します。BMDM 髄鞘の残骸の貪食能を評価するためにマウスの BMDM 分離と文化、髄鞘の残骸の準備とアッセイを取り上げます。これらの技術は重要な特殊な機器や材料を必要とせず堅牢な定量化可能な結果を生むまだ研究者のニーズに合わせて簡単にカスタマイズすることができます。

CFSE は髄鞘の残骸のラベルと BMDMs の治療は、明確な内部 (図 2) を得られるはず。3 時間作用時間は下流の検出が確実に十分な追加された髄鞘の残骸の貪食に BMDMs のための十分なが、相互作用の 1 時間ほどの細胞内蓄積を観察できます。ただし、いくつかの髄鞘の残骸まだあるかもしれない細胞表面に洗浄後。これは不十分な洗浄またはない貪食の初期の段階で完全に内面化粒子が原因かもしれません。
BMDMs することができます急速に髄鞘の残骸を内面化、ライソゾーム処理オロ染色脂質液滴を形成する前に必要です。BMDMs は示すために、髄鞘の残骸で 90 分間インキュベートし、洗浄し、固定および汚損 (図 3) 前に時間の追加量の培養されました。図 4は、および中性脂質外観と治療開始の遅れがあるを示します。また、文化の中には脂質の保持が不安定をする必要があります。BMDMs は、液滴形成後すぐに蓄積された脂...

蛍光に分類された髄鞘の残骸と細胞内脂質液滴染色を使用してプライマリ マウス骨髄由来マクロファージの貪食能を評価する手法を提案します。

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

このプロトコルの全体的な目標は、脳由来のミエリン破片の骨髄由来マクロファージ食作用を評価することです。このプロトコルは、神経外傷の分野における重要な質問に答えるように設計されています。この方法の利点は、in vitroでのマクロファージ応答、特に骨髄由来マクロファージのミエリン破片に対する食作用能を効率的かつ比較的費用対効果の高い方法で分析できることです。この方法は、外部モジュレーターの影響を調査するために簡単に適応できます。マウスを70%エタノールで飽和させた後、腹部の皮膚に開口部を作ります。皮膚を後ろに引いて、解剖用の脚を露出させます。このプロセス中に腹腔に穴を開けないように注意してください。露出したら、足首と腰を切って脚を外します。抗生物質を補給した氷冷したPBSに脚を置きます。もう一方の脚についても繰り返します。抗生物質を添加した新鮮な氷冷PBSで組織を洗い、解剖中に組織に付着した可能性のある微粒子を取り除きます。筋肉に沿って緩やかに掻き取る動きは、不要な組織の大部分を取り除きます。メスとピンセットを使用して、脛骨を筋肉と結合組織から解放します。解放されたら、両端を取り外して骨髄腔を露出させます。このプロセスを大腿骨に対して繰り返します。完全な骨髄由来マクロファージ培地で満たされた20mmシリンジに25ゲージの針を貼り付けます。次に、骨髄腔を洗い流します。骨が十分に洗い流されると、骨は白く見えます。採取した骨髄吸引液を18ゲージの針で30〜90秒間攪拌し、単一細胞懸濁液を得る。次に、懸濁液を無菌の70マイクロメートルの細孔径セルストレーナーに通します。細胞懸濁液を145cmの細胞培養皿に均等に分けます。各マウスは、合計3つの皿に十分な量を提供します。7日間の培養後、これらの料理は通常、成熟したマクロファージと70〜80%コンフルエントになります。脳から粗ミエリン破片を単離するために、一連のショ糖勾配超遠心分離ステップが実施されます。まず、8週齢から10週齢のマウスから10〜12個の脳を解剖します。次に、脳を0.32モルのスクロース溶液でホモジナイズし、次に0.383モルのスクロース溶液クッションに重ねて不連続な勾配を作成します。遠心分離後、粗ミエリンの破片が層間の界面に見つかります。これを回収してトリス緩衝液に分注し、再度遠心分離してミエリン破片をペレット化します。ペレットをトリス緩衝液に再懸濁し、2本のチューブに分割して追加のセネトリフュージングを行います。まず、脳全体を取り出し、氷冷した0.32モルのスクロース溶液を入れた皿に入れます。滅菌手術用ハサミを使用して、収集した脳を約5ミリメートルの大きさに切断します。このステップは、その後の均質化プロセスに役立ちます。組織を50ミリリットルのチューブに集めます。ロータリーホモジナイザーを使用して、組織を滑らかなスラリーに均質化します。目に見える大きな脳の固形物がすべて完全に均質化されていることを確認してください。0.83モルのスクロース溶液を20ミリリットル入った超遠心チューブに、分離の維持に注意しながら生成し、均質化します。0.32モルのスクロース溶液を使用して、各チューブのバランスを慎重に取ります。終了したら、チューブを適切な遠心分離機のローターに移し、重力の100,000倍、摂氏4度で45分間回転させます。加速と減速が最小値に設定されていることを確認します。遠心分離が完了すると、ショ糖密度界面の間にミエリンの破片が見えます。ミエリンの破片をそっと集めます。収集したら、トリスバッファーをミエリンの破片に追加します。ロータリーホモジナイザーで再度均質化します。ホモジネートを6本のクリーンな超遠心チューブに分割し、必要に応じて追加のトリスバッファーでチューブのバランスを取ります。集めたミエリンの破片を、重力の100, 000倍、摂氏4度で45分間、加速と減速を最大値に設定して再度遠心分離します。遠心分離後、ミエリンはペレット化されます。Trisバッファーを使用して、ペレットを再懸濁します。再懸濁液と超遠心分離機を再度組み合わせます。遠心分離後、密集したペレットが形成されます。スーパーネートをデカントします。ペレットを滅菌PBSに再懸濁します。再懸濁したミエリン破片を、あらかじめ秤量した微量遠心チューブに均等に分割します。重力の22, 000倍で10分間遠心分離した後、PBSスーパーネートを除去します。ペレットを秤量した後、PBSで1ミリリットルあたり100ミリグラムの濃度に再懸濁します。得られた粗ミエリンの破片は、現在、食作用の研究に適しています。CFSE標識ミエリン破片は、細胞内輸送だけでなく、早期の内在化を追跡するために使用できます。非標識ミエリン破片は、内在化脂質の貯蔵と代謝を評価するためのOil Red-O脂質染色に適合します。マイナス80°Cで保管されたミエリンの破片を使用している場合は、まず29ゲージの針で再懸濁することをお勧めします。10ミリグラムのペレット化したミエリン破片を200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。次に、2マイクロリットルの5ミリモルCFSE溶液を追加します。ピペットで混ぜます。光とその後の洗浄から保護された30分間のインキュベーション後、PBSでミエリン破片を1ミリリットルあたり100ミリグラムに再懸濁します。培養後、4%パラホルムアルデヒドで固定した後、各ウェルに100%プロピレングリコールを添加します。室温で5分間インキュベートした後、各ウェルにOil Red-O染色溶液を加えます。穏やかに攪拌しながら摂氏60度で8分間インキュベートします。プレートをゆっくりと傾けて、Oil Red-Oの汚れを完全に吸引できるようにします。各ウェルに85%プロピレングリコールを添加します。室温で5分間インキュベートした後、PBSでウェルを洗浄し、選択した核色素で細胞を染色します。培養中の骨髄細胞の代表的な光学顕微鏡画像。最初の播種から24時間後、接着細胞はほとんど存在しません。しかし、マクロファージコロニー刺激因子であるM-CSFの存在下では、白血球前駆細胞は分化し始めます。M-CSFの存在下で7日間培養した後、前駆細胞は食作用が可能な成熟骨髄由来マクロファージに完全に分化します。この方法を使用すると、生後8〜10週齢のC57 black 6Jマウス1匹は、通常1,800万〜2,400万個の骨髄マクロファージを産生します。インターナリゼーションを視覚化するために、CFSE標識ミエリン破片を骨髄由来マクロファージ培養物に添加します。細胞は、4%パラホルムアルデヒドで洗浄および固定する前に、1ミリグラム/ミリグラムのCFSE標識ミエリン破片で1時間処理しました。内在化したミエリン破片は、落射蛍光対応顕微鏡の標準的なGFPフィルターセットを使用して視覚化できます。ミエリン脂質の蓄積が経時的にどのように変化するかを示すために、マクロファージを非標識ミエリン破片で90分間処理し、その後、さまざまな時点で洗浄して固定しました。洗濯直後は、脂肪滴がほとんど見えません。しかし、時間が経つにつれて、より多くの脂肪滴が見えるようになり、洗濯後約24時間で最大に達します。マクロファージは代謝を開始し、脂質貯蔵庫に排出され、染色可能な液滴の数が減少します。Oil Red-O染色を定量化するために、落射蛍光対応顕微鏡を使用して、各時点のサンプルからランダムに取得した5枚の画像を取得しました。Oil Red-O-stained 領域は、DsRed チャネルでキャプチャされた画像を使用して、各ウェルについて決定されました。細胞の総数は、各フィールドに存在する核の数を数えることによって決定されます。このグラフは、結果の定量化を示しています。骨髄由来のマクロファージが内在化されたミエリン脂質を中性脂質に変換するため、Oil Red-O陽性シグナルの着実な増加が一般的です。Oil Red-O陽性シグナルの減少は、マクロファージが脂質を代謝または排出し始める24時間でピークに達します。このビデオをご覧になった方は、初代骨髄由来マクロファージを単離して培養する方法や、新たに単離された脳由来ミエリン破片との相互作用を研究する方法について、よく理解できるはずです。これらの手順の最も重要な部分は、常に無菌技術を適切に維持することです。マクロファージは少量の病原体関連分子に強く反応するため、結果を偏らせる可能性のある相互作用を最小限に抑えることが重要です。これらの技術の主な利点は、生物学的に関連性のある初代細胞と新鮮なミエリンの破片を作り、必要な特殊な機器の量を排除できることです。さらに、ユーザー最適化を行うことで、これらの手法を容易に適応させ、骨髄由来マクロファージのミエリン破片に対する応答に関するさまざまな問題に対処することができます。蛍光標識されたミエリン破片と有髄マクロファージのOil Red-O染色の両方を利用することにより、さまざまな神経外傷に苦しむ患者に対する潜在的な治療介入を調査することが可能です。このような研究の全体的な目標は、マクロファージを介した遠隔細胞破片の除去により、炎症の解消を促進することです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マクロファージは、長い自然免疫と獲得免疫応答の重要な構成要素として認識されている。マクロファージや微生物間の相互作用の進化遺伝的、および生化学的な側面に関する知識の最近の爆発はマクロファージへの科学的関心をリニューアルしました。この記事では、マウスの骨髄からマクロファージを差別化する方法を説明している。...

骨髄由来マクロファージの生産

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

私たちは、マクロファージCを可視化する方法を説明しますネオフォルマンス （CN）デジタル光学顕微鏡を用いて非溶解性エキソサイトーシスの過程で特定の重点を置いて、リアルタイムで相互作用。この技術を用いて個別に感染したマクロファージは、この現象のさまざまな側面を確認するために研究することができる。...

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化クリプトコッカス·ネオフォルマンスデジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

ここでは、in vitroの実験のために出生後の仔マウス（1日目）からミクログリアを分離するためのプロトコルを提示します。分離のこの即興方法は、高収率および高純度、ミクログリア生物学を解明する目的で、広範囲の実験を可能にする別の方法を超える有意な利点の両方を生成します。...

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

簡単で迅速なサルモネラの分離法をご紹介-ビオチンとストレプトアビジン菌をコーティングすることによりマクロファージからファゴゾームを含みます。...

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

ここでイメージの単一食イベントに回転ディスク共焦点顕微鏡を用いたマウス腹腔マクロファージの方法について述べる。他の貪食細胞に、プロトコルを拡張できます。...

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

神経変性疾患は、調節不変のミクログリア機能に関連付けられている。本稿では、iPSCマクロファージによる神経芽細胞細胞の貪食のインビトロアッセイについて概説する。量的顕微鏡読み出しは、ライブ細胞タイムラプスイメージングと固定細胞高含有イメージングの両方について説明されています。...

iPSCマクロファージによる死んだ神経芽細胞の食細胞に対するインビトロ定量イメージングアッセイ

本プロトコールは、マウスからの骨髄由来マクロファージの単離および培養について記載している。...

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

このプロトコルは、7-9日齢の新生児マウス骨髄細胞を単離し、L929細胞の上清を顆粒球コロニー刺激因子(M-CSF)の供給源として使用して分化したマクロファージを生成するための非酵素的で簡単な方法を説明しています。骨髄由来マクロファージは、表面抗原F4/80、CD206、CD11b、および機能的コンピテンシーについてさらに分析されました。...

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

本プロトコルは、ミクログリアのミエリン破片の食作用能力に対する反復磁気刺激の影響を評価するために考案されました。そのために、 in vitro ミクログリアとミエリンデブリの共培養システムが確立されています。...

反復磁気刺激下 でのin vitro でのミエリン破片のミクログリア食作用の評価

学ぶ骨髄由来マクロファージによる髄鞘残骸の貪食評価法。マウス骨髄細胞の培養と蛍光標識を用いたin vitro解析により、神経外傷におけるマクロファージ応答を効率的に研究できます。

体外骨髄由来マクロファージによって髄鞘の残骸の貪食

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