Name: 腎臓蛋白質の非ウイルス性発現の流体力学的腎盂注入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶ腎臓特異的タンパク質発現法。マウス腎盂へのプラスミドDNA流体力学的注入により、成人腎臓で再現性のある遺伝子発現を実現します。腎臓病研究の新たなツールとして有用です。

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L.E.W. および健康の国民の協会 [R01 DK095867] キャリア開発賞から復員部の [BX002797] がサポートされており、米国心臓協会 [15GRNT25700209] サポート j. c.健康の国民の協会 [DK093660]、復員軍人援護局の部 [BX002190] およびヴァンダービルト腎臓病センター サポート M.H.W.この資料は、VA テネシー州の谷の医療系施設のリソースとサポート作業の結果です。

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<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+damage+after+delivery+of+naked+plasmid+DNA+into+skeletal+muscles+is+batch+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).</li>
<li>Crespo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+liver+gene+transfer+mechanism+involves+transient+sinusoidal+blood+stasis+and+massive+hepatocyte+endocytic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.</a> Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).</li>
<li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery%3A+conclusion+of+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).</li>
</ol>

著者が開示し、利害の対立を宣言しない何もありません。

このプロトコルでは、腎臓における具体的に再現性のある遺伝子発現を達成するための手法を説明します。適度に経験豊富な外科医の手の中、我々 はマウスの年齢に応じて、50-100% の範囲で遺伝子の読み出しの感度であるためこの手法で導入したマウスの割合を発見しました。ルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルは、トランスポゾンpiggyBacを受信マウスの数ヶ月は、背景の上、受信同じトランスポゾン11免疫不全マウスで数週間完全に維持されます。一方、多くの細胞は注射部位に近いエリアの transgene の鮮やかなステンド グラス、トランスフェクション効率は比較的低い (図 3 D)。望ましい結果を達成するために最も重要な材料は、注射器自体です。これは、添付の針と注射を阻害する安全性なし 29 x ½"インスリン注射をする必要があります。注射は、3 秒以内に高速である必要があります。プラスミッド DNA の準備は非常に低エンドトキシンと細菌ゲノム DNA レベル19では、純粋なする必要...

流体の尾静脈注入法マウス肝1,2遺伝子発現の高いレベルを達成するために一般的に使用される方法となっています。腎臓は、はるかに低いレベル、約 100 以下3でこの手法によっても transfected します。ここで説明した流体力学的腎盂インジェクションは肝4,5 以前確立されている同じ流体力学的原則を使用して物理的な手段によってオルガン式の特異性を制御する簡単な方法を提供します。、筋肉6、および他の器官7,8。このメソッドは、圧力を使用して、生きた動物体内で細胞を transfects し、同時に、すぐに臓器への損傷を誘発する細胞に含まれている DNA の流体を強制的にスピード解決9。インスリン注射器で注射と一緒に逃げ面切開10を介して腎臓を視覚化する確立された手技を使用して、さまざまな種類の腎臓の細胞、主に間質細胞の成功したトランスフェクションを発見しました。細管と収集の管11。これらのマウスの解剖は、他の臓器がイメージング テクニック11ルシフェラーゼによる可視化するのに十分高いレベルでトランスフェクションいないことを示しています。技術は非ウイルス性なので、transfection のためプラスミッド DNA の使用は注入に必要な試薬を高速かつ簡単に準備を許可します。
抗酸化物質グルタチオン S トランスフェラーゼ A4、インスリン様成長因子-1 受容体と期待される生物学的効果11,とすべての腎臓のホルモンのエリスロポエチンを表現するのにローカライズされた流体の注射を使用しています。12,13。 プロモーター選択 DNA 投与量、注入量の管理のルートの詳細な評価が実行される11をされています。さらに、両方piggyBacトランスポゾン システムおよび/またはシクロホスファミド治療遺伝子を免疫反応を抑制するためは、長期的な遺伝子発現の結果11を改善するために示されています。他の研究者は、1 ヶ月14より大きいの期間の高いトランスフェクション効率を達成する成功をラット腎静脈アプローチを使用しています。しかし、人間の病気を模倣した表現型の遺伝的補正通常実行されますマウスの最初概念実証として以来、ほとんどの哺乳類の遺伝学的モデルは、マウス モデル。我々 は腎静脈注射腎盂注入を比較し、腎盂への注入が遺伝子発現 (約 10 倍高い) と生存11腎静脈よりも優れていたことを発見します。腎盂は腎臓への参入の理想的なルートは、尿の生産の変動を許容する柔軟性が、水腎症の間に拡張した場合でもその構造の整合性を維持することがしばしばです。また、腎盂への注入は、野末注入より腎臓によって保持される目に見えないに体液が注入された腎被膜のピアスをせず腎臓へのアクセスを許可しました。他のマウスの臓器、血管以外のエントリのルートを持っていないが、腎臓の尿の空間は理想的な注射。また、腎静脈への注射は腹腔内に血液の漏れになりました。野生型マウスの腎臓の全腎容積単一の腎臓のボリュームは流体によって腎盂流体注入量とほぼ等しいので、約 0.2 cm3、磁気共鳴画像と推定されています注入 (100 μ L)15。ここで、利用可能にした腎臓の再現可能なトランスフェクションを達成するために流体力学的腎盂注入プロトコルの詳細なニュアンスのすべて。

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazine</td><td>Patterson 獣医</td><td>07-808-1947</td><td>麻酔薬 - 規制されていない物質</td></tr><tr><td>BD インスリン注射器 0.5 mL 29G 1/2 インチ</td><td>基本的な健康</td><td>309306</td><td>必要な注射器</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>薬剤師/獣医師</td><td></td><td>鎮痛 - 規制物質</td></tr><tr><td>Dynarex 使い捨てタオル ドレープ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>19-310-671</td><td>ヒートパッドの上に置く</td></tr><tr><td>EndoFree プラスミド マキシ キット</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>エンドトキシンフリープラスミド DNA のみを使用</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL ラピッド ポジティブ コントロール</td><td>チャールズ リバー</td><td>PC200</td><td>エンドトキシン テストのポジティブ コントロール</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL ラピッド シングル テスト バイアル</td><td>チャールズ リバー</td><td>R13500</td><td>エンドトキシン テスト</td></tr><tr><td>エクストラファイン マイクロ ディスセッティング ハサミ</td><td>Roboz Surgical器具</td><td>RS-5882</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド インスタントシーリング滅菌ポーチ - 9インチ</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-812-51</td><td>オートクレーブ手術器具用</td></tr><tr><td>ゲイマーヒートポンプ</td><td>パラゴンメディカル</td><td>TP-700</td><td>水循環ヒートポンプ</td></tr><tr><td>ジャーミネーター 500</td><td>ロボズ 手術器具</td><td>DS-401</td><td>手術中に手術器具を再利用するには</td></tr><tr><td>Graefe鉗子</td><td>Roboz 手術器具</td><td>RS-5136</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>Graefe 組織鉗子</td><td>Roboz 手術器具</td><td>RS-5153</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>Halsey ニードルホルダー、5インチ 長さ</td><td>Roboz 手術器具</td><td>RS-7841</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>ヒートパッド - 15インチ x 21 インチ - 少なくとも 3</td><td>つの Paragon Medical</td><td>TP22G</td><td>Gaymar ヒートポンプ</td></tr><tr><td>と併用IsoFlo (イソフルラン、USP)</td> <td>Abbott Animal Health</td><td>5260-04-05</td><td>イメージングおよび安楽死用</td></tr><tr><td>Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor</td><td>Smiths Medical</td><td>VCT3K2</td><td>イメージングおよび安楽死用</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>薬剤師/獣医師</td><td></td><td>麻酔薬 - 規制物質</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>実験組織</td></tr><tr><td>リビングイメージソフトウェア</td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td></td><td>生きた動物のイメージング用</td></tr><tr><td>ルシフェリン・</td><td>パーキン・エルマー</td><td>・122796</td><td>生きた動物のイメージング用</td></tr><tr><td>ナノドロップ2000</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>ND-2000-US-CANDNA</td><td>測定用分光光度計</td></tr><tr><td>プレバンティクス スワブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-100-110</td><td>皮膚手術準備用</td></tr><tr><td>プロレン5-0縫合糸テーパー 30インチ</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC0256891</td><td>皮膚用非吸収性縫合糸</td></tr><tr><td>Puralube ブランド 眼科軟膏</td><td>パターソン 獣医</td><td>07-888-2572</td><td>手術中に目を潤すために</td></tr><tr><td>Trans IT - QR 流体力学 デリバリーソリューション</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR-5240</td><td>DNAを希釈するための流体力学的デリバリーバッファー</td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 縫合糸 J303H</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9816710</td><td>筋肉層用吸収性縫合糸</td></tr><tr><td>ウォールミニアルコクリッパー</td><td>Med-Vet International</td><td>8787-1550</td><td>スキンプレップ用シェーバー</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td></td><td>生きた動物のイメージング用</td></tr></tbody></table>

腎臓蛋白質の非ウイルス性発現の流体力学的腎盂注入

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

流体の注入は、プラスミド DNA や他の物質と様々 な組織を使ってローカル、高圧環境を作成します。流体尾静脈注射、たとえば、肝臓を導入することができます確立された方法です。この原稿では、マウス腎臓腎臓特異的遺伝子発現のプラスミド DNA の直接注入による流体力学的原則の適用について説明します。マウスを麻酔し、腎臓、腎盂に直接プラスミド DNA 含有溶液の高速注入が続いて側腹部切開によって公開されています。針は 10 秒の場所に保管し、切開部位を縫合します。次の日、ライブ動物イメージング、遺伝子発現を測定するために使用可能性があります西部のしみまたは免疫組織化学または興味の蛋白質の検出選択の遺伝子に適した他のアッセイを使用します。遺伝子発現を延長する公開されたメソッドには、遺伝子に免疫応答を抑制するトランスポゾンを介した遺伝子統合およびシクロフォスファミド治療が含まれます。

手術および注入の技術はマスターならば、主要な機器や高価な材料を必要としないを実行する簡単です。側腹部切開腎手術に新しい、安楽死を予定していくつかのマウスの 1 つの訓練日で許可するか、マウスがない回復手術この手術の最初の試行は、通常よりも長くかかる場合がありますので。また、同様の手法に精通している研究者の場合は、非常に簡単な場合があります。図 1の図と図 2の絵の方向に慎重に従ってください。切開を正しく配置するには、外科医は、それはその側で産む中マウスの胃にプッシュする指を使用できます。腎臓、穏やかな腹部圧力と背骨近く上がる小さなしこりによって可視化され、この領域 (図 1および図 2) を切開する必要があります。正しいサイズ (図 1) の皮膚と筋層切開をすることが重要です。...

このプロトコルでは、具体的には腎臓における導入遺伝子発現を生成する腎盂を介してマウス腎臓にプラスミド DNA を注入する方法をについて説明します。

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

この外科的処置の全体的な目標は、成体マウス腎臓のプラスミドDNAからタンパク質発現を産生することです。この方法は、目的のタンパク質の発現が成体の腎臓にどのように影響するかなど、腎臓学における重要な問題に対処するための新しいツールです。この技術の主な利点は、他の臓器でも遺伝子発現を生じさせる可能性のある他の方法とは異なり、特に腎臓において再現性のある方法でタンパク質発現を産生することです。腎盂の注射には慎重な曝露が必要であり、血漿DNAが細胞に入るためには迅速に行う必要があるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。まず、プラスミドDNAを流体力学的デリバリーバッファーに再懸濁します。青いパッドで覆われた水循環式ヒートパッドの上に、マウスを置きます。ペットのグルーミング用に設計されたシェーバーを使用して、マウスの背面の左側を肩から臀部、脇腹から背骨まで剃ります。ゆるい髪や破片をきれいにし、角膜の乾燥を防ぐために両方の目に獣医軟膏を塗ります。次に、麻酔するマウスごとに別々のシリンジに10〜50マイクログラムの希釈プラスミドDNAを含む100マイクロリットルを準備し、気泡がないことを確認します。針は安全装置なしで恒久的に取り付けられるべきです。手術を行う前に、ヒートパッドの上に置かれた滅菌トレイに触れずに滅菌手術器具を空にします。次に、マウスを手に取り、照らされた視野にひもで締めます。パッキンから、3.15%グルコン酸クロルヘキシジンと70%イソプロピルアルコールの皮膚消毒スワブを取り出し、動物の近くに置きます。滅菌手術用手袋を着用し、切開部位から始めて、新しいクロルヘキシジンアルコールスワブで動物を円を描くように3回綿棒で拭きます。次に、切開部位を見つけます。ピンセットで皮膚をつまみ、はさみを使用して、背骨から約1センチメートルの胸郭の下の皮膚層を切り取ります。筋肉層の下にさらに1センチ切り込みます。腎臓の位置を特定し、触れずに、指で腹部にしっかりと優しく圧力をかけ、腹腔からそっと露出させます。腎臓を露出させることは時々難しいです。脾臓を傷つけないように、腹部と背骨に穏やかな圧力をかけます。腎臓以外の臓器が出てきた場合は、必要に応じて閉じた鉗子を使用してゆっくりと体腔に戻します。次に、小さな白い点として見える腎盂を視覚化するのに十分なだけ、腎臓を周囲の脂肪からそっと分離します。腎盂を視覚化した後、閉じた鉗子を使用して腎臓の右側を押し下げ、腎盂が見えるようにします。次に、装填したインスリン注射器を右手で作業面と平行に持ってつかみ、針を腎盂に慎重に挿入します。針を挿入したら、3秒以内に溶液をすばやく注入します。溶液の逆流を防ぐために、針を約10秒間所定の位置に留まらせます。次に、針をゆっくりと慎重に取り外し、閉じた鉗子を使用して切開部位を優しく伸

hydrodynamic-renal-pelvis-injection-for-non-viral-expression-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: Gupta, K. ほか。 腎盂腎炎のラットモデルにおける大腸菌の腎内注射。 J. Vis. Exp. (2017年)。この動画では、麻酔ラットの腎骨盤内に大 腸菌...

ラットの腎骨盤への大 腸菌 の腎内注射

Source: Van Lidth de Jeude, et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the process of producing viral particles through transfection of embryonic kidney cells with plasmid–polyethylenimine complexes, which leads to viral genome expression, particle assembly, and virus collection in the medium.

Polyethylenimine-Mediated Transfection of Embryonic Kidney Cells for Recombinant Virus Production

このビデオでは、核酸トランスフェクションのためのマウス腎臓の腎盂へのプラスミドの流体力学的注入のプロトコルを紹介します。この技術は、高い静水圧の原理を利用してプラスミドを特定の部位に強力に駆動し、組織損傷を引き起こさずにプラスミドの臓器特異的な送達を可能にします。...

流体力学的腎骨盤注射:マウスモデルの腎臓細胞にDNAを直接送達する技術

このビデオでは、腎動脈を介したラットの腎内薬物投与を実演しています。この方法は、薬物の標的化、薬物の効力を改善し、全身毒性を最小限に抑えるのに有益です。...

ラットにおける腎内薬物送達:動脈内注射によりラット腎臓に治療薬を送達する方法

ここでは、Xenopus laevis胚の腎臓を生じさせる個々の割球への注射を標的とする運命マップと系統トレーサーを使用するプロトコルを提示します。...

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

抗生物質から化学療法に至るまで薬物が含まnephrotoxinsから発生腎損傷は、その病因が完全には理解のまま、複雑な障害をもたらすことができます。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの腎臓保護措置の同定に適用することができ、これらの条件、疾患のモデリングのために使用することができる方法を示します。...

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

腎機能の回復のための薬剤の投与は、治療化合物の局在化および分布の制御を必要とします。ここでは、具体的にラットにおける薬物の腎内送達のための簡単​​な方法を説明します。この手順は容易に死亡し、再現性良く行うことができます。...

ラット腎臓への生物製剤の血管内デリバリー

この原稿は、腎盂への大腸菌による直接腎内感染を使用した腎盂腎炎のラット手術モデルについて説明しています。この実験手順は、腎盂腎炎の病因だけでなく、関連する炎症や線維症の研究にも利用できます。...

腎内注射大腸菌腎盂腎炎のラットモデル

本原稿は、マウスの腎腹部大動脈に置かれたカテーテルを介して単一の腎臓への標的送達方法を記述する。...

腎動脈を介した腎臓への直接薬物送達

ここでは、いくつかの腎臓病モデルマウスにおいて、非ウイルスベクターとポリエチレンイミンナノ粒子の尾静脈注射 を介して 、外因性人工的に合成されたmiRNA模倣物を腎臓に送達します。これにより、腎臓における標的miRNAの有意な過剰発現がもたらされ、その結果、いくつかのマウスモデルにおいて腎臓病の進行が抑制された。...

いくつかの腎臓病モデルマウスにおけるポリエチレンイミンナノ粒子を用いた外因性人工合成miRNA模倣体の腎臓への送達

このレポートでは、マウス腎臓への効果的かつ安全な遺伝子導入のための腎盂 を介した AAV...

アデノ随伴ウイルスベクターの低速逆行性腎盂注射 による マウス腎臓への効果的かつ安全な遺伝子送達

学ぶ腎臓特異的タンパク質発現法。マウス腎盂へのプラスミドDNA流体力学的注入により、成人腎臓で再現性のある遺伝子発現を実現します。腎臓病研究の新たなツールとして有用です。

腎臓蛋白質の非ウイルス性発現の流体力学的腎盂注入

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