Name: 抗有糸分裂エージェント ドセタキセルに対する抵抗性の前立腺癌細胞モデルの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-08T12:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 学ぶドセタキセル耐性前立腺がん細胞モデルの生成法。DU145または22Rv1細胞を用いて段階的濃度のドセタキセルで処理し、耐性クローンを選択・解析する手法です。抗がん剤耐性の分子メカニズム解明と治療戦略開発に貢献します。

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V.R. B米国保健省から資金を受け取る &#38; 人間サービス、NIH、国立癌研究所許可番号 1 K22 CA207458-01 と j. d. d.米国保健省から資金を受け取る &#38; 人間サービス、NIH、国立癌研究所許可番号 1 R01 CA207311-01。

1 50% の原因とドセタキセル濃度の定量の増減コロニー形成能力 (IC50) 注: このプロトコルでドセタキセル IC50 濃度はコロニー形成により評価されている。能力。捜査に基づく細胞生存率 (すなわち MTS の試金) を評価するために使用する代替の方法を使用できます &#39; 設定します。
<ol><li>DU145 の成長や 22Rv1 75 cm 2 フラスコ細胞 10 mM 今後の実験で使用される DMSO で希釈したドセタキセルの十分な在庫を準備します</li>。
	<li>ドセタキセル IC50 の決定のための細胞をプレート、フラスコからメディアを取り出して、5 ml の PBS のセルを慎重に洗う、2 mL 0.05% と孵化するフラスコ表面から細胞をデタッチする 37 ° C で 3-5 分のトリプシン-EDTA</li>。
	<li>は新鮮なメディアの 5 ml フラスコから細胞をトリプシンをすすいで 15 mL チューブに細胞懸濁液を収集します。(300 × g、室温 (RT) 3 分) の遠心分離によって細胞をペレットします</li>。
	<li>は、上澄みを除去、5 mL の新鮮な培地で細胞ペレットを再懸濁します、セルをカウントします。DU145 の 10 の 5 セル/mL x 2 2.5 と 22Rv1 の 10 の 5 セル/mL x 4 4.5 に細胞懸濁液を希釈、上下にピペッティングでよく混ぜるし、2 つの 6 ウェル プレートの各ウェルに懸濁液 2 mL をシードします</li>。
	<li>後 24 h、されるセルは、70-80% の合流点、追加 1 用量エスカレート ドセタキセル濃度 2.5 nM nM、5 nM、10 nM、25 nM、50 nM、100 nM、250 nM、500 nM、および各ウェルに 1000 nM。ドセタキセル ( 図 2 a) に使用される最高のボリュームで DMSO でうまくコントロールを扱う</li>。
	<li>後 72 時間は、メディアを含む薬物を吸引し、新鮮なメディアの 2 mL を追加します。約 4-5 日、以内プレートが染色できています</li>。
	<li>植民地を染色する 2-3 mL の PBS で軽く洗って、ティッシュ文化フードまたは発煙のフードの中に 20 分間 2 〜 3 mL クリスタル バイオレット溶液 (0.1% 10% ホルマリンで w/v) でそれらをインキュベートします</li>。
	<li>H 2 O を削除 H 2 O 2-3 mL で染色ソリューションと洗濯板を削除して板を風乾します</li>。
	<li>は、1 つが 50% (IC50) 細胞生存率が低下するドセタキセル濃度を判断する井戸を可視化で結果を分析します。手動で (同じ植民地を 2 回カウントを避けるため) にマーカーペンの助けを借りて、コロニーをカウントしてグラフ ( 図 2 a) の細胞生存率の割合を表します。最後に、( 図 3 a に示すように)、図表現用の皿のデジタル画像を取る</li>。
</ol> 2。ドセタキセル耐性前立腺癌細胞の世代 注: IC50 薬剤濃度の定量に使用される同じドセタキセル ソリューション在庫を使用して細胞治療を実行 (事前に十分な在庫を準備実験使用)。念のために何かがうまく行かないから前の手順では、細胞の小さなフラスコが常します。親細胞を小さなフラスコ全体の手順中に並列で成長し、ドセタキセル治療フラスコで使用された量を模倣の対応するボリュームで車両 (DMSO) にさらされる必要があります。
<ol><li>20 mL の培地を含む 150 cm 2 フラスコのセル板 DU145 または 22Rv1 (3.5 x 10 DU145 の 6.5 * 10 フラスコあたり 6 セル 6 セル 22Rv1 用フラスコあたり)。プロトコルの最後で十分な細胞を持っている細胞の 10 に 20 フラスコの使用勧めします</li>。
	<li>細胞は約 70-80% で、24 時間後合流点 ( 図 2 b ドセタキセルの前に)、プロトコルの手順 1 で決定された IC50 濃度にドセタキセルを追加 (5 nM のため、このプロトコルで記述されているセル).</li>
	<li>後 72 h はメディアを含む薬物を吸引し、ドセタキセル無料新鮮なメディア ( 図 2 b ドセタキセル後 72 時間) を追加します。メディアごとに 3-4 日を変更します。約 1-2 週間以内の抵抗性クローンが ( 図 2 b ドセタキセル後 7、14 日) 顕微鏡の下で明白である表示されます</li>。
	<li>メディアを吸引、15 ml の PBS セルを慎重に洗浄し、4 mL 0.05% と孵化フラスコ表面から細胞をデタッチする 37 ° C で 3-5 分のトリプシン-EDTA</li>。
	<li>では、新鮮なメディア 8 ml フラスコからトリプシン細胞を再懸濁します。すべての扱われたフラスコから細胞をプールします。遠心分離 (300 x g, 3 min, RT) によって細胞のペレットします</li>。
	<li>上澄みを除去、20 mL の新鮮な培地で細胞ペレットを再懸濁し、150 cm 2 フラスコで細胞をプレート (3.5 x 10 DU145 の 6.5 * 10 フラスコあたり 6 セル 22Rv1 用フラスコあたり 6 セル).</li>
	<li>細胞は約 70-80% で、24 時間後合流、5 を追加 nM ドセタキセル (初期 IC50 濃度) 再び</li>。
	<li>2.3 〜 2.6 の日 3 の手順を繰り返します</li>。
	<li>細胞は約 70-80% で、24 時間後合流、2 X IC50 ドセタキセル濃度と治療細胞 (10 nM のため、このプロトコルで記述されているセル).</li>
	<li>繰り返し手順 2.3 2.8、ドセタキセル濃度の増量を次 (25 nM、50 nM、100 nM、250 nM)、最終的な最高濃度の下であなたのフラスコで育つセルの安定した人口を生成します。1,000 nM 濃度に達する ( 図 1 a) まで、6 ヶ月の高濃度の用量漸増プロトコルを実装できます</li>。
</ol> 3。機能特性の獲得ドセタキセル抵抗性コロニー形成法による 注: このプロトコルで抗癌剤はコロニー形成アッセイを使用して評価されています。捜査に基づく細胞生存率 (すなわち MTS の試金) を評価するために使用する代替の方法を使用できます &#39; 設定します。
<ol><li>プレート 2,000年細胞 (DU145 または 22Rv1、親およびドセタキセル耐性) 好評につき 6 ウェル プレートで、ウェルあたり 2 mL の培地を使用しています</li>。
	<li>後 24 h 追加ドセタキセル濃度を上げる (親細胞: 0.25、0.5、1、2.5、5 nM;DR セル: 50、125、250、500、1,000 nM)。DU145 と 22Rv1 の両方の細胞ライン。最高のドセタキセル投与に使用される同じボリュームでコントロールとしてのみ 1 つの井戸に DMSO を追加します</li>。
	<li>72 時間後メディアを含む薬物を吸引し、新鮮なドセタキセル無料メディアを追加します</li>。
	<li>プレートのコロニーが顕微鏡の下で表示されるまで 1-2 週間をインキュベートします</li>。
	<li>植民地を染色する 2-3 mL の PBS で軽く洗って、ティッシュ文化フードまたは発煙のフードの中に 20 分間 2 〜 3 mL クリスタル バイオレット溶液 (0.1% 10% ホルマリンで w/v) でそれらをインキュベートします</li>。
	<li>H 2 O を削除 H 2 O 2-3 mL で染色ソリューションと洗濯板を削除して板を風乾します</li>。
	<li>井戸を可視化し、(同じ植民地を 2 回カウントを避けるため) にマーカーペンの助けを借りて、コロニー カウントを手動で結果を分析、グラフに細胞生存率の割合を表します。図表現 ( 図 3 a) 用の皿のデジタル画像を撮影します</li>。
</ol> 4。表現型特性のドセタキセル取得小塚 qRT PCR 解析を介して 注: ドセタキセル耐性 (DR) 細胞が彼らの親の細胞と比較して異なる発現プロファイルを展示 28, 29. qRT PCR による選択の成功を検証できるため、特定のマーカーのプライマーを使用して (プライマー シーケンスの [マテリアル]; 詳細についてを参照してください、結果] セクションを参照してください)。これは、第 3 ラウンド以降選択の各ラウンドの後行ってください。また、西部にしみが付くことによってドセタキセル耐性表現型の評価も可能です。
<ol><li>親およびドセタキセル耐性細胞 RNA 抽出キットを使用し、メーカーからの RNA の抽出 &#39; の指示 (テーブルの材料 および詳細については試薬を参照)。最小値を使用して 1-10 の 6 セル × 2 をお勧めします</li>。
	<li>数量 RNA 260 nm の吸光度、分光光度計を使用して。最高純度の 260 nm/280 nm の吸光度比は 2.0 に近いする必要があります</li>。
	<li>Perform 逆相補的 DNA (cDNA) 逆のトランスクリプション キットを使用して、次の製造元を取得する転写 &#39; の指示 (参照 表の材料 および詳細については試薬)、20 μ L の RNA の 1 μ g を使用して反応混合物 (cDNA のより高い金額が必要な場合、反応混合物をそれに応じてスケール アップ).</li>
	<li>は次のように興味の各遺伝子の 3 通 qPCR 反応を準備: - 2 μ 10 μ M 前方プライマー 2 - μ 10 μ M 逆プライマー - 10 μ L SYBR グリーン PCR マスター ミックス - 5 μ L H 2 O -1 μ L の 4.3 のステップから新しく準備された cDNA 。
	メモ: は、このプロトコルで使用されるプライマーのシーケンスの 材料表 を参照してください</li>。
	<li>PCR プログラムを次のように設定する: - 95 ° C、15 分 - 94 ° C、30 秒 | 
	-40 56 ° C s | 40 回 - 30 のための 72 ° C s |</li>
	QPCR の結果を分析し、親間の遺伝子発現の変化を決定する <li>博士サンプル興味の各遺伝子のサイクル (Ct) のしきい値値 3 通で決定され、平均読み込み制御 (アクチン帳票平均を正規化) 博士 (Ct DR) の親細胞 (Ct 親)。親セルの値は、1 に正規化されます。ΔCt (Ct DR - 親 Ct) は最終的な mRNA のフォールドの変更を取得する決定は、グラフで表されます。増加 &#62; 2 増減の &#60; 0.5 が重要考慮され、ドセタキセルの確立の良い検証耐性表現型 ( 図 3 b) を取得します</li>。
</ol>

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

本稿では、抗癌剤表現の習得のメカニズムの研究ができるドセタキセル耐性前立腺癌細胞モデル システムを生成する手法について述べる。このアプローチには、高い信頼性と再現性ですが、いくつかの潜在的な制限を考慮されなければなりません。以来だけでセルの一括人口のごく一部は、抗癌剤28出展、細胞の大規模な人口を持つ開始勧め (我々 は通常約 1.2 × 10 を占める 150 cm2、20 のフラスコをプレート8細胞)。プロトコルの主要な手順は、プロシージャの成功のために考慮されなければなりません。最初に、長期にわたって使用 (-80 ° c に正しく格納するとき年因数を用することができます 10 mM 在庫) の株式が作りたて同じドセタキセルを使用する非常に重要です。因数のドセタキセルのわずかな変化は IC50 のセル行タイミングの生成結果とコロニー形成結果に影響します。第二に、以来、バリエーションは、細胞の新しいバッチを使用する場合に発生することが個々 のセル各行の IC50 を決定するプロトコルを起動することが重要です。第三に、監視、エラーを迅速に検出して修正できるように、顕微鏡下で細胞を頻繁にチェックして、薬物治療が有効であることが不可欠です。最後に、常に汚染やプロトコルの途中で細胞の生存率に影響を与える可能性があります予期しない問題の場合中間段階の在庫を保つことをお勧めします。重要なは、我々 のプロトコルは高用量ドセタキセルの 72 h 最高を模倣する試みで薬の濃度一定ではなく、長い回復期間が続くために前立腺がんの細胞をさらすことによって薬剤耐性のモデルを生成することを目的と臨床このタキサン エージェント15,16前立腺癌治療のためにシナリオが報告されました。
さらに、薬剤耐性細胞が時間をかけて取得した耐熱性の進歩的な損失につながる可能性があります高い可塑性を示すことに注意してください。したがって、これらの細胞の文化 2-3 ヶ月以上の使用を拡張するはお勧めしません。恒久的な供給が必要な場合それは継続的に抵抗力がある細胞の新しいバッチを生成することをお勧めします。ただし、長時間細胞のバッチ培養される場合コロニー形成法と qPCR 使用できます彼らの抵抗を再評価します。別の方法としては、72 h (500-1,000 nM) のドセタキセルの高用量とセルを扱うことによって衰退の抵抗を高めるためです。1 〜 2 週間の回復期間後、表現型再テストできます qPCR とコロニー形成によって試金。(FBS、10 %dmso) で液体窒素に扱われた細胞の因数を格納する推奨されませんにも可能、です。凍結融解サイクル後抗癌剤の表現常に評価すべき再と上記の方法に注意してください。
これらの警告にもかかわらず我々28,29など30,31,32,33正常に主小説細胞を識別するためにこれらのモデル システムを採用することができたと腫瘍開始容量、細胞の存続およびドセタキセル耐性細胞における積極性に結びつく分子メカニズムが昇格。これら癌細胞モデル システムを使用して、その細胞の上皮、前立腺関連の分化マーカーの有無と対象の過剰発現の発達によって特徴付けられる、画一的な表現型を示すがわかりました (ノッチとハリネズミ) シグナル伝達経路は、化学療法の露出28 を生き残る。2 番目の研究では、公開されている患者の遺伝子データ セット24,25、一緒にこれらのモデルを使用して我々 を発見、先駆的転写因子 GATA2 非常において過剰発現転移性去勢抵抗性化学療法抵抗性の前立腺癌細胞。GATA2 直接シグナリング ネットワーク29IGF2 依存型の下流のキナーゼを活性化によって細胞の生存を増加します。特に、これらの研究は高度な転移性前立腺癌攻撃34GATA2 の新規のキーの役割を識別するを助けた。
薬剤耐性の開発は、ドセタキセルと前立腺がんに限定されない問題はがん化学療法薬の広い配列で処理の他の多くの種類の間で流行。確かに、実験的なモデルの可用性に同様の制限が適用されます、我々 のプロトコルは、他のがんの種類とそれぞれの抗癌剤メカニズムを研究に適応できると考えられる。
このプロトコルで記述としてドセタキセル耐性の細胞の生成は、抗癌剤の新規関連分子 · 細胞メカニズムを識別するために機能的なツールとして使用できます。これは、極めて悪性の前立腺がんの新しい治療法の開発が明確に、この病気について知っていることとどのように我々 の治療の境界を押してもう一度、新たな目標を見つけることへの扉を開きます。

細胞周期制御の損失によって引き起こされる増殖の増加率は、がん1の特徴です。この機能のプロパティをレンダリングします癌細胞細胞周期の主要なプロセスを忠実に一意に依存して中に S と M-相、様々 な細胞周期 DNA 損傷や細胞分裂の欠陥を誘発する薬を摂動の発展につながっています。従来の微小管ターゲット エージェント (Mta) が唯一の臨床的に承認された方法であり続ける分裂期キナーゼまたはモーター蛋白質の阻害剤のような多数の抗有糸分裂エージェントが現在開発中とテストの臨床試験、がん2,3,4の有糸分裂を対象とします。Mta はどちらか不安定 (ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン) または (タキサン派生剤パクリタ キセル、ドセタキセルまたはカバジタ キセル) 微小管を安定化および機能有糸分裂紡錘体5,6の形成を防ぐ。これらのエージェントは、紡錘アセンブリ チェックポイント7,8、長引く分裂逮捕および培養細胞9,10の最終的な細胞死と細胞分裂腫瘍11 欠陥で起因するトリガーします。 ,12と前立腺癌13多種多様なそれらの間の癌の治療に有用。
前立腺癌は最も頻繁に診断されるがんとがんの主要な原因関連の男性14人が死亡。ドセタキセルなど体エージェントは、前立腺がん患者の生存率を改善し、この病15,16,17の治療の主力は。残念ながら、初期腫瘍収縮にもかかわらず腫瘍細胞はしばしば治療中に薬剤耐性を開発します。いくつかの細胞メカニズムをアポトーシスと炎症性経路の規制緩和や ATP 結合カセット運送者のような薬剤の流出ポンプの活性化/過剰発現を含む抗癌剤の開発の原因に関与しています。P 糖タンパク質 (P ・ gp/ABCB1)、後者の場合、結果セル18,19の化学療法剤の輸出。タキサン系薬剤への抵抗は、チューブリンのアイソタイプやチューブリン変異は、薬剤とそのターゲット20,21間の相互作用を防ぐための表現の変更など、他の原因でリンクされています。さらに、抵抗は、ゲノム不安定性の蓄積と腫瘍の不均一性22,23に関連しています。ただし、タキサン抵抗のメカニズム完全に理解されない、明らかであるその外観を防ぐ治療戦略の不在によって。したがって、これらのメカニズムの解剖で支援実験モデルを生成し、これらの薬剤に抵抗性の発達を防ぐため新規の治療法を識別するために緊急の必要性があります。
この記事では前立腺癌細胞ドセタキセル耐性 (DR) の生成を可能にする方法をについて説明します。我々 はさらに、これらの細胞のコロニー形成アッセイおよび定量的 RT-PCR を用いた抵抗状態を検証する方法を説明します。このメソッドによって生成される細胞さた公開ひと腫瘍サンプル データベースに対してさまざまな実験的アッセイを実行する汎用性を提供する付加的な利点は、分子機能の多くの利点があります。腫瘍のサンプルで許可されているよりも時間の長い期間。療法の抵抗のこれらの癌モデルことができます多くの週の組織培養とその他のアプローチの間で展開される、遺伝子操作、顕微鏡法による可視化および分析できる遺伝子発現の。さらに、腫瘍形成と成長の生体内での効果をさらに分析するためにマウスで xenotrasplanted をすることができます彼ら。現在、前立腺癌の薬剤耐性を検討する主な方法は、腫瘍のサンプルの直接分析です。これらのサンプルは、遺伝子発現および特定の腫瘍の突然変異の状態に関する情報を収集するために非常に強力なシステムを提示、それらへのアクセスは非常に限られていることができます、彼らはさらに操作の実験的分析を維持することは困難でこのプロトコル24,25生成細胞を簡単に実行できます。重要なは、今後、代替アプローチなど患者から直接人間の派生オルガノイドの生成は、非常に強力なツールと現在法26,27に代替。どのような腫瘍が、元の環境で 3 D コンテキストで要約するが、ので organoids は細胞とひと腫瘍の完全なモデルになります。しかし、このプロトコルで記述した実験細胞モデルはまだ維持するために手頃な価格で高速な解析に適した。これらの細胞株を勉強して得た結果に外挿する、人間のサンプルや 3 D 文化の裏付け。したがって、このプロトコルは私達のプロトコルは、他の薬とがんの種類の研究に合わせることができるのですべてのセル行の抗癌剤メカニズムを研究に研究を細胞モデルを求めての関心の可能性があります。ここで説明する方法があらゆる研究室は、手頃な価格で適用し、薬剤耐性の分子・細胞メカニズムについての予備研究を許可する.

<table><tbody><tr><td>DU145細胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-81</td><td></td></tr><tr><td>22Rv1細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2505</td><td></td></tr><tr><td>ドセタキセル</td><td>セレック ケミカルズ</td><td>S1148</td><td>DMSO (10mM)</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ 150cm2</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>10% FBS および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>ファンデーション B 胎児ウシ血清</td><td>Gemini</td><td>900208</td><td></td></tr><tr><td>1X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td> <td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>0.05%トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III RT-PCR ファーストストランド合成システム</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Invitrogen</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>10% ホルマリン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>qRT-PCR 用プライマー:</td><td>Lifeテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCCAGCCC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA2 F:CATCAAGCCCAAGCGAAGA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA2 R:TTTGACAGCTCCTCGAAGCA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクチン F:CATGTACGTTGCTATCCACCC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクチン R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

抗有糸分裂エージェント ドセタキセルに対する抵抗性の前立腺癌細胞モデルの生成

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

微小管ターゲット エージェント (Mta) は、腫瘍の広い範囲の治療の主力です。しかし、薬剤抵抗性獲得は、病気の進行の一般的な機構と悪性腫瘍の予後決定因子の機能です。前立腺癌 (PC)、Mta にタキサン ドセタキセルなどの抵抗が予後不良と高い死亡率率によって定義される病気の致命的な段階の方の進行と同様、治療の失敗に影響を与えます。何十年も学び、獲得抵抗性に貢献するメカニズムの配列完全に理解されていない、従ってこれらの進行した段階の患者に恩恵を受けることができる新しい治療上の作戦の開発に重大な制約をもたらす病気。末期前立腺がんの致命的な特徴を模倣し、ため、メカニズムを研究することができますドセタキセル耐性前立腺癌細胞の生成について述べるこのプロトコルで取得する抗癌剤によって発生します。潜在的な制限はありますが、時間をかけて抵抗特性の損失に基づくセルのモデルに組み込みドセタキセル耐性細胞株がこのメソッドによって作成された最近の研究で使用されているし、を進める機会を提供私たち致命的な前立腺癌で取得した抗癌剤の分子的理解。

このプロトコルは、ドセタキセル耐性 (DR) の前立腺癌の細胞の生成に します。図 1 a 図 1 bのプロトコル手順の概略にまとめたよう完了までの日程は 4 から 7 ヶ月まで及ぶかもしれない。時間の投資選択のセル行とプロトコルで説明されているように使用される薬物濃度の範囲によって異なる可能性があります。重要なは、各セルライン ドセタキセル IC50 濃度の定量は、選択 (図 2 a) の細胞のプロトコルで使用する薬剤の濃度範囲をエスカレートの設計をことができます。プロトコルが開始されると、プロトコルが正しく動作している場合を監視を顕微鏡下で異なる時点で初期ドセタキセルに及ぼす DU145 と 22Rv1 の細胞を観察できます。ドセタキセル治療プロセスを監視する時間のポイントを示唆: 72 h、7 日と 14 日のドセタキセル暴露後ドセタキセル暴露 (ベースライン) の前に。少数の腫瘍細胞はドセタキセルの露出を存続 (図 2 b) 顕微鏡の下で観察することができますのクローンを生成することに注意してください。
代表的な植民地形成アッセイと親の定量化グラフと新しく生成されたドセタキセル耐性 (DR) 細胞は、図 3 aに表示されます。生成されたドセタキセル耐性細胞が親細胞最大 1,000 倍以上の薬物濃度を生き残ることができることに注意してください。
最後に、ドセタキセル耐性の表現型は qRT PCR (図 3 b) によって検証できます。ABCB1 および GATA2 の発現特性と CK19 と CDH1 のダウンレギュレーションをドセタキセル耐性細胞、親細胞と比較してが表示すること注意してください。これらの遺伝子は、我々 はすでに実験以前に発行された仕事 GATA2 アップレギュレーション両方 DR セル モデル28,29CDH1 と共に CK19 のダウンレギュレーションで示されているために、検証に選ばれました。他、一貫して薬剤耐性細胞18,19で亢進によって示されている定番遺伝子 ABCB1 遺伝子も選ばれました。ただし、文献によると、細胞モデルと耐性細胞の生成の研究者により選択された薬剤によって他の遺伝子が選択されるかもしれないことに注意する重要です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig1.jpg"> 
図 1: ドセタキセル耐性前立腺癌細胞モデルの生成のためのタイムライン。(A) ドセタキセル耐性細胞モデルの生成のためのプロトコルのタイムラインの代表的な図。図は、ドセタキセル治療、検証手順、および各部分に必要な時間を示しています。(赤) は 72 h の示されたドセタキセル濃度親およびドセタキセル耐性細胞の機能的なコロニー形成アッセイを含むプロトコルの検証手順の模式図 (B) 代表コロニー割合および表現型検証に qRT PCR のグラフ。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig2.jpg"> 
図 2: 世代のドセタキセル耐性前立腺癌細胞モデル システム。(A) 図描いた DU145 と 22Rv1 親の前立腺癌細胞株におけるドセタキセル IC50 の決定 (プロトコルのステップ 1)。細胞生存率とビンブラスチン投与量の濃度が必要とドセタキセルの予想される割合が含まれます。代表 DU145 と 22Rv1 細胞生存率のグラフを示す 5 nM IC50 ドセタキセル露出の 72 h が含まれて後に。実験トリプリケートしデータを表す DU145 の平均 ± SD. (B) 代表的な明るいフィールド顕微鏡画像おり、22Rv1 細胞のドセタキセル抵抗 (プロトコルの手順 2) 発生時。赤い矢印は、プロトコルが完了した後にドセタキセル耐性クローンを示しています。スケール バー = 50 nm。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig3.jpg"> 
図 3: ドセタキセル耐性細胞モデルの機能および表現型特性。(A) 代表的な植民地形成アッセイの親およびドセタキセル耐性細胞 72 h コロニーのパーセントのための示されたドセタキセル濃度ごとの治療濃度が含まれているグラフで表されるため。実験、トリプリケートし、データを表す平均 ± SD. スケール バー = 5 mm (B) DR/ペアレンタル相対 mRNA 倍増加額 GATA2, CK19 と CDH1 ABCB1 の qRT PCR による定量化が表示されます。すべての qPCR の生データは、アクチンに正規化されます (詳細についてはプロトコルを参照してください)。実験は、トリプリケートし、データを表す平均 ± SD. * p &lt; 0.05。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

がん治療への抵抗は、病気の進行と死亡に貢献します。抵抗性のメカニズムの基盤を決定する治療応答の改善に不可欠です。この原稿の詳細 PC 患者におけるドセタキセル抵抗への進行に関与する経路を解剖するため (PC) 前立腺癌のタキサン耐性細胞モデルを生成するプロトコル。

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

この手順の全体的な目標は、抗有糸分裂療法耐性を促進する分子メカニズムを研究するためのプラットフォームとして、ドセタキセル耐性がん細胞実験モデルを生成することです。この方法は、がん細胞生物学およびゲノムメイト分野における重要な疑問、例えば、疾患の進行に寄与するシグナル伝達経路の特定や、潜在的な標的化可能な戦略の決定など、重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、患者の腫瘍サンプルや動物モデルを使用するだけでなく、抗がん剤の反応を研究するための実験モデルを生成するための信頼性が高く簡単な方法であることです。この手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるLisa Mohrと、私たちのチームのもう一人のポスドクであるJungreem Wooです。この手順を開始するには、20ミリリットルの培地が入った150センチメートル四方のフラスコにDU145または22Rv1細胞をプレートします。24時間後、細胞が約70〜80%のコンフルエンスになったら、5ナノモルのドセタキセルを追加します。72時間後、薬剤を含む培地を吸引し、新しいドセタキセルフリー培地を追加します。.メディアは3〜4日ごとに交換してください。フラスコにクローンが現れるまで1〜2週間待ちます。培地を吸引し、細胞を15ミリリットルのPBSで慎重に洗浄し、4ミリリットルの0.05%トリプシン-EDTAで摂氏37度で3〜5分間インキュベートして、フラスコ表面から細胞を分離します。次に、トリプシン化した細胞を8ミリリットルの新鮮な培地を使用してフラスコから再懸濁します。処理されたすべてのフラスコから細胞を引き出し、遠心分離によってそれらをペレット化します。その後、スーパーナデンを取り出し、細胞ペレットを20ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁し、150cm四方のフラスコに細胞をプレートします。24時間後、細胞が約70〜80%のコンフルエントになったら、再び5ナノモルのドセタキセルを追加します。クローンがフラスコに表示されるまで、前に示した手順を繰り返します。次に、セルを150センチメートル四方のフラスコに再度プレートします。24時間後、細胞が約70〜80%のコンフルエントになったら、10ナノモルのドセタキセルで処理します。ドセタキセルの用量を漸増的に同じ手順を繰り返し、濃縮治療のたびに生存するクローンをプールし続けます。プロセスの最後には、実験に使用できる耐性細胞のプールが得られます。この手順では、6つのウェルプレートでウェルあたり2ミリリットルの培地を使用して2,000個の細胞をプレート化します。24時間後、DU145細胞株と22Rv1細胞株の両方について、ドセタキセルの濃度を上げて追加します。DMSOは、ドセタキセルの最高用量に使用したのと同じ量のコントロールとして、1つのウェルにのみ添加します。72時間後、薬剤を含む培地を吸引し、新しいドセタキセルフリー培地を追加します。.顕微鏡でコロニーが見えるまで、プレートを1〜2週間インキュベートします。コロニーを染色するには、2〜3ミリリットルのPBSでコロニーをやさしく洗います。それらを2〜3ミリリットルのクリスタルバイオレット溶液と組織培養フードまたはヒュームフード内で20分間インキュベートします。その後、常設溶液を取り出し、プレートを2〜3ミリリットルの水で洗います。次に水を取り除き、プレートを風乾します。図の表現のためにプレートのデジタル画像を撮ります。ウェルを視覚化し、マーカーペンを使用してコロニーを手動でカウントすることで、結果を分析します。そして、細胞の生存率をグラフで表します。これは、親の前立腺癌細胞株DU145および22Rv1におけるドセタキセルIC50の測定を示す図です。必要な濃度を漸増するドセタキセル用量の細胞生存率の予想パーセンテージをここに示しています。そして、これは、ドセタキセル耐性の生成中に指定された時間におけるDU145および22Rv1細胞の代表的な明視野顕微鏡画像です。赤い矢印は、プロトコール完了後のドセタキセル耐性クローンを示しています。ここに示されているのは、ドセタキセル耐性細胞の機能検証に対応する代表的なコロニー形成アッセイです。細胞は、クリスタルバイオレット染色によって評価されたドセタキセル濃度の増加と生存率に曝露されました。このビデオを見れば、薬剤耐性細胞株を作製し、検証する方法を十分に理解することができ、その後、遺伝子発現解析や遺伝子操作など、お好みの検査や手順に使用することができます。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。

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抗有糸分裂エージェントドセタキセルに対する抵抗性の前立腺癌細胞モデルの生成

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