抗有糸分裂エージェント ドセタキセルに対する抵抗性の前立腺癌細胞モデルの生成

この手順の全体的な目標は、抗有糸分裂療法耐性を促進する分子メカニズムを研究するためのプラットフォームとして、ドセタキセル耐性がん細胞実験モデルを生成することです。この方法は、がん細胞生物学およびゲノムメイト分野における重要な疑問、例えば、疾患の進行に寄与するシグナル伝達経路の特定や、潜在的な標的化可能な戦略の決定など、重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、患者の腫瘍サンプルや動物モデルを使用するだけでなく、抗がん剤の反応を研究するための実験モデルを生成するための信頼性が高く簡単な方法であることです。

この手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるLisa Mohrと、私たちのチームのもう一人のポスドクであるJungreem Wooです。この手順を開始するには、20ミリリットルの培地が入った150センチメートル四方のフラスコにDU145または22Rv1細胞をプレートします。24時間後、細胞が約70〜80%のコンフルエンスになったら、5ナノモルのドセタキセルを追加します。

72時間後、薬剤を含む培地を吸引し、新しいドセタキセルフリー培地を追加します。.メディアは3〜4日ごとに交換してください。フラスコにクローンが現れるまで1〜2週間待ちます。

培地を吸引し、細胞を15ミリリットルのPBSで慎重に洗浄し、4ミリリットルの0.05%トリプシン-EDTAで摂氏37度で3〜5分間インキュベートして、フラスコ表面から細胞を分離します。次に、トリプシン化した細胞を8ミリリットルの新鮮な培地を使用してフラスコから再懸濁します。処理されたすべてのフラスコから細胞を引き出し、遠心分離によってそれらをペレット化します。

その後、スーパーナデンを取り出し、細胞ペレットを20ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁し、150cm四方のフラスコに細胞をプレートします。24時間後、細胞が約70〜80%のコンフルエントになったら、再び5ナノモルのドセタキセルを追加します。クローンがフラスコに表示されるまで、前に示した手順を繰り返します。

次に、セルを150センチメートル四方のフラスコに再度プレートします。24時間後、細胞が約70〜80%のコンフルエントになったら、10ナノモルのドセタキセルで処理します。ドセタキセルの用量を漸増的に同じ手順を繰り返し、濃縮治療のたびに生存するクローンをプールし続けます。

プロセスの最後には、実験に使用できる耐性細胞のプールが得られます。この手順では、6つのウェルプレートでウェルあたり2ミリリットルの培地を使用して2,000個の細胞をプレート化します。24時間後、DU145細胞株と22Rv1細胞株の両方について、ドセタキセルの濃度を上げて追加します。

DMSOは、ドセタキセルの最高用量に使用したのと同じ量のコントロールとして、1つのウェルにのみ添加します。72時間後、薬剤を含む培地を吸引し、新しいドセタキセルフリー培地を追加します。.顕微鏡でコロニーが見えるまで、プレートを1〜2週間インキュベー

コロニーを染色するには、2〜3ミリリットルのPBSでコロニーをやさしく洗います。それらを2〜3ミリリットルのクリスタルバイオレット溶液と組織培養フードまたはヒュームフード内で20分間インキュベートします。その後、常設溶液を取り出し、プレートを2〜3ミリリットルの水で洗います。

次に水を取り除き、プレートを風乾します。図の表現のためにプレートのデジタル画像を撮ります。ウェルを視覚化し、マーカーペンを使用してコロニーを手動でカウントすることで、結果を分析します。

そして、細胞の生存率をグラフで表します。これは、親の前立腺癌細胞株DU145および22Rv1におけるドセタキセルIC50の測定を示す図です。必要な濃度を漸増するドセタキセル用量の細胞生存率の予想パーセンテージをここに示しています。

そして、これは、ドセタキセル耐性の生成中に指定された時間におけるDU145および22Rv1細胞の代表的な明視野顕微鏡画像です。赤い矢印は、プロトコール完了後のドセタキセル耐性クローンを示しています。ここに示されているのは、ドセタキセル耐性細胞の機能検証に対応する代表的なコロニー形成アッセイです。

細胞は、クリスタルバイオレット染色によって評価されたドセタキセル濃度の増加と生存率に曝露されました。このビデオを見れば、薬剤耐性細胞株を作製し、検証する方法を十分に理解することができ、その後、遺伝子発現解析や遺伝子操作など、お好みの検査や手順に使用することができます。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。