Name: 腸幹とニッチ細胞機能解析における再構成アッセイ (ORA) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶ腸幹細胞とニッチ細胞の再構成アッセイを用いた機能解析法。Lgr5陽性幹細胞とPaneth細胞を分離し、遺伝学的・生化学的改変後にオルガノイドを再構成することで、細胞特異的な解析が可能となる。

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この研究はオランダ癌協会 (KWF; からの資金によって可能になったEMCR 2012-5473) と世界がん研究基金国際 (WCRF; プロジェクト号 2014-1181)

すべてのプロシージャは、動物愛護の法律および指針に従って行われました。
1. 楽器、文化、メディア、料理の準備
<ol><li>腸はさみ、通常のはさみや滅菌コンテナーに鉗子のオートクレーブ 1 セット。</li>
	<li>37 ° C でインキュベーターの場所 96 ウェル (フラットボトム) の皿</li>
	<li>材料の表に記載されている試薬を用いる完全な培養液 10 mL を準備します。</li>
	<li>37 ° c 水のお風呂で完全培地を孵化させなさい。</li>
	<li>雪解けは、氷のバケツに置くことで基底膜を再構成しました。再構成の基底膜は 4 ° C で液体になります。</li>
	<li>冷たいリン酸緩衝生理食塩水または省略された PBS (4 ° C) で 4 枚のペトリ皿を埋めます。</li>
</ol>2. 小さな腸陰窩の分離
<ol><li>CO2吸入によって C57BL6/J の背景にLgr5- eGFP IRES クレエt2マウスを犠牲に。縦はさみのペアで腹膜を解剖します。</li>
	<li>生検鉗子で胃を押しながら横方向に半分に切る。</li>
	<li>さあ今から腸のはさみを使用して、腸を引き出し、PBS を含むペトリ皿に配置。 メモ: 腸のはさみがある鋭い、鈍い先端。これらのはさみの鈍い先端は腸を開いている間クリプト絨毛アーキテクチャを損傷しないようにものです。</li>
	<li>胃に鈍い先端を配置することによって起動し、幽門をゆっくりします。はさみで切り、ピンセットで引っ張ってによって進みます。</li>
	<li>全小腸が縦に開かれる、鉗子で保持することによって冷たい PBS で洗い、軽く U 字の動きと PBS ソリューションでリンスします。</li>
	<li>すべての便の残骸がクリアされれば腸内腔側をまな板の上を平らにするのに進みます。内腔側は血管の有無によって、その薄い外観外側の部分と比較するとわかりやすいです。</li>
	<li>スライド ガラスと優しく削って平面的な腸絨毛を削除します。この手順では、組織の全体の長さに沿って 2 回。</li>
	<li>滅菌手術ブレードで 2-5 mm の部分に、小腸を切った</li>
	<li>10 mL の氷冷 PBS を含む 50 mL のチューブで腸の小片を置きます。</li>
	<li>PBS の上下にそれらをピペッティングによる任意の残りの不純物を除去、組織片をクリーンアップします。上澄みを廃棄し、PBS が完全にクリアされるまでこの手順を繰り返します。</li>
	<li>15 mL 冷 PBS、25 mL の PBS の合計の最終巻をさせるを追加します。2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を加え、4 ° C でローラーの 45 分間インキュベート</li>
	<li>PBS/EDTA を破棄します。</li>
	<li>10 mL の PBS を追加し、厳しくピペッティング組織片を上下 (3 回以上) で陰窩をデタッチします。上清を収集します。</li>
	<li>2.13 手順を繰り返します 4 回します。50 mL の最終巻に到達するための培養培地を追加します。</li>
	<li>遠心分離 (5 分 300 g x) によって細胞をペレットします。</li>
	<li>培地 10 mL にペレットを再懸濁し、遠心分離 (3 分 80 g x) によって陰窩をペレットします。</li>
</ol>3. 単一セル準備
<ol><li>ペレットの陰窩の上澄みを廃棄し、一緒に 50 μ L 1 mL のトリプシン様酵素でそれらを再懸濁します DNAse (50 μ g/mL)。</li>
	<li>2 分の 32 ° C の水浴中で細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>10 mL の培養液を追加します。少なくとも 5 回上下に厳しくピペッティングによる単一細胞に陰窩を切り離して考えます。</li>
	<li>40 μ m ストレーナー (塊と他の不純物を除去する) にソリューションをフィルターと 5 分の 300 x g で単一細胞のペレットします。</li>
</ol>4. 流れの Cytometry とめっき
<ol><li>1 x ハンクのバッファリングされた食塩または HBSS/2% 牛胎児血清 (FCS) ソリューションの 50 mL を準備し、すべての 10 の6セルの 1 mL にペレットを再懸濁します</li>
	<li>細胞懸濁液 BV421 林- (CD31、CD45、TER119) 30 分のための 1: 250 抗体の濃度で 1: 100、および CD24 APC CD117 PE 両方の濃度に追加します。</li>
	<li>並べ替えLgr5+幹細胞と別低にパネート細胞バインド チューブ。並べ替えのためのプロトコルの詳細についてはLgr5+パネート細胞は roth 氏らを参照してください7 Scheweら6<ol>
<li>300 x g で 5 分間で並べ替えられた細胞は、1.3 のように記述されているコンポーネントを 100 μ l 添加培地で細胞を再懸濁します遠心分離機 (材料の表を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パネート細胞の治療 (例えば、化学的または遺伝の修正によって) (n = 2000) またはLgr5+幹細胞 (n = 2000)。<ol>
<li>総量が 100 μ L の培養液の 100 の濃度で小さな干渉 RNA (siRNA) リポソームを介したトランスフェクション試薬の 5 μ L を使用細胞を治療する nM。SiRNA または選択した変更のために必要な時間のための 37 ° C で 30 分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>500 μ L の培養液中で 2 回洗浄を行う。</li>
	<li>5 分間 300 × g で遠心し、10 μ L の培養液中の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>2 つの細胞成分をプール (パネートまたはLgr5+細胞) の 20 μ l の総ボリュームや 300 x g で室温 5 分間遠心</li>
	<li>共同インキュベート、パネートと室温 10 分間細胞のLgr5+ </li>
	<li>上澄みの 10 μ L を削除し、細胞ペレットを吸い出してに確かに液体のメニスカスを残します。</li>
	<li>40 μ L の総ボリュームのセルを再構成した基底膜の 30 μ L を追加、細胞を再懸濁します、予め温めておいた 96 well プレートのプレートします。10 分後完全培地 200 μ L を追加 (材料の表を参照してください)。変化媒体ごとの 48 時間。</li>
	<li>5 日目でカウントにおける多様性。</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32(2015).</li>
<li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965(2012).</li>
<li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
<li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li>
</ol>

著者ない競合経済的利害関係やその他の利害の関係があります。

又は、2 つの基本的なコンポーネント腸管幹細胞ニッチすなわちLgr5+ 、パネート細胞の洗練された機能解析が可能します。このアプローチは、わずかな変更6,10,11私たちと他の人が以前採用されています。再現性と標準化された実験室のプロトコルとして又は手順を紹介します。また、遺伝子導入の可能性の例としてLgr5+の幹細胞のApcダウンレギュレーションの効果に関する報告 (または生化学的な6) 並べ替えられた細胞成分に変更。総称して、データ表示 siRNA Apcの仲介ノックダウンLgr5+細胞の幹細胞の機能を高めるは、増加における多様性 (図 1 b) によって示される。
<p clas...

腸上皮は哺乳類の体内で最も急速に自己更新組織で、同定と地下室の下部に存在する大人の幹細胞の機能解析を目的とした研究の茄多のオブジェクトをされていますLieberkühn、 Lgr5遺伝子の発現による目的税とカノニカル Wnt 信号1に依存しています。特に、 Lgr5+幹細胞は並ぶ、専門にされたニッチ細胞、すなわちパネート細胞で、また彼らの成熟2Wnt シグナルに依存によってサポートされています。一緒に、これらの 2 つの細胞型腸上皮の自己複製の根底にあるし、毎日恒常性平衡を保持: Lgr5+幹細胞は急速に分割し、前駆細胞に上昇を与えるより専門的な腸上皮細胞;パネート細胞に不可欠なニッチな要因 (例えば、Dll1 Wnt3、EGF) を提供するLgr5+幹細胞2。メッキ前のヴィヴォ組織と自己の構造を形成する organoids、または「ミニ根性」と呼ばれるとき腸陰窩の能力は、自己更新などのプロセスへの洞察力を提供するために実験的なツールとして悪用されていると分化癌4を含む正常および病的条件。Organoid 文化は、腸、膵臓、肝臓、腎臓、マウスおよびひと試料4からを含むいくつかの組織から確立されています。抽出法およびこれら器官毛細文化を開発する採用の成長因子が組織特異的多系統分化を駆動し、できるだけ元の幹細胞ニッチを模倣するように設計体内。Organoids 遺伝的疾患の治療、がんの治療効果、薬物の毒性の解析または器官培養5研究の評価を含む潜在的なアプリケーションがあります。
全体的にみて、organoid 文化組織サンプルから確立されたときの主な制限は、細胞特異性の欠如です。たとえば、腸陰窩から確立された腸オルガノイドは組織のソースの内で包含される個々 の細胞成分の分析を許可しない (例えば、全体の陰窩を含むLgr5+、パネートと前駆細胞)。
ここでは、手法、オラと呼ばれるの最も基本的なコンポーネント、すなわち幹 (Lgr5+)、ニッチ (Paneth) 細胞の機能解析と腸管における文化の利点を組み合わせたについて述べる。Paneth のユニークな能力を通してそしてLgr5+細胞に物理的に互いの共同培養 organoids2,6,10に上昇を与えるとを関連付けます。我々 はこの機能の利点を取り、オルガノイドを再構成する前に個別に 2 つのセル型が前処理します。その際、各細胞成分はある薬剤、成長因子、生化学的阻害剤、遺伝子組み換え、または再構成と organoid 形成前に化学治療に公開できます。したがって、又は分析を使用すると、特定の薬物治療や遺伝子組み換えが幹細胞またはそのニッチ相手に特定の効果をあるかどうかの決定ができます。

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12 *</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス *</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050061</td><td>最終濃度:10 mM</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン *</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15140122</td><td>最終濃度:1%</td></tr><tr><td>Hepes *</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15630080</td><td>最終濃度:10 mM</td></tr><tr><td>組換えマウスEGF *</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PMG8041</td><td>最終濃度:50 ng/ml</td></tr><tr><td>組換えマウスNoggin *</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>最終濃度:100 ng/ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>最終濃度:10 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>Jagged-1 *</td><td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>最終濃度:1 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>組換えマウス R-spondin *</td><td>R&D systems</td><td>3474-RS-050</td><td>最終濃度:1 mg/ml</td></tr><tr><td>Flexitube 遺伝子溶液 siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>最終濃度:100 nM</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>バイオレジェンド</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>バイオレジェンド</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>バイオレジェンド</td><td></td><td></td>102424</tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>Low binding tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* これらの試薬の組み合わせは、完全な培地</td><td></td><td></td><td></td>を構成します</tr></tbody></table>

腸幹とニッチ細胞機能解析における再構成アッセイ (ora)

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

腸の粘膜上皮は、非常に急速な率が特徴です。哺乳類、全体の上皮をリニューアルして、4-5 日以内。成人の腸管幹細胞 Lieberkühn の陰窩の下部に存在するLgr5遺伝子の発現による計上、その増殖率が高い特徴的な1を介して恒常性を維持します。、小腸全体Lgr5+パネート細胞と呼ばれる特殊な分泌細胞と幹細胞が混在しています。パネート細胞は (すなわちリゾチーム、cryptdins/ディフェンシン) 抗菌化合物を分泌して腸内細菌叢の制御の役割を発揮します。もっと最近、パネート細胞、すなわち Wnt3、EGF, および Dll12としていくつかのキー配位子Lgr5+幹細胞ニッチ サポートを提供する能力の新たな機能が発見されています。
腸陰窩が長命に上昇を与えるex vivoを分離すると特定の成長因子と細胞外マトリックス成分の存在下で培養したとクリプト絨毛のような高い organoids と呼ばれる 3 D 構造の自己更新3大人の小腸の上皮のアーキテクチャです。Organoid 文化、全体の陰窩から確立されたとき個々 のコンポーネント、すなわち、 Lgr5+の貢献に対処せず、腸管幹細胞ニッチの分化と自己複製の研究を許可してパネート細胞。
ここでは、Paneth の能力の活用における分析への新しいアプローチについて述べるし、 Lgr5+は関連付けるオルガノイドを形成する細胞と共培養します。このアプローチは、ここで「organoid 再構成法」という (ORA) Paneth の遺伝学的および生化学的な変更をことができますまたはLgr5+幹細胞オルガノイドに再構成が続きます。そのため、腸管幹細胞のニッチの 2 つの主要なコンポーネントの機能解析をことができます。

Organoid 再構成アッセイでは、 Apc遺伝子の小さな干渉 RNA (siRNA) を行い, ここで、腸上皮の幹細胞のニッチとの基本的なコンポーネントの個別の機能解析をことができます。
この目的を達成するために私たちはまず近交系 C57BL6/J マウスから 8000 Lgr5+細胞と 6000 のパネート細胞を分離する (FACS) を並べ替え蛍光活性化細胞を利用しました。図 1 aでオラ アッセイのフローチャートが描かれています。Organoid 溶解能力はApcの mRNA に対する siRNA オリゴヌクレオチドLgr5+の細胞を培養によって評価されたまたはコントロールとしてスクランブル シーケンス (SCR) を網羅します。治療後、同じ siRNA で処理された<...

腸内における文化は全体の陰窩からされ細胞特異的自己複製と分化の解析を許可しません。このプロトコルを記述する並べ替えられた幹 (Lgr5+) の再構成とその前の生化学的および遺伝性の変更と機能解析を可能にしながらオルガノイドを生じさせる (Paneth) 細胞のニッチします。

腸幹とニッチ細胞機能解析における再構成アッセイ (ORA)

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

オルガノイド再構成アッセイの全体的な目標は、腸幹細胞ニッチLgr5陽性の2つの主要成分を、その遺伝的または生化学的修飾を通じて、パネート細胞の機能解析を行い、その後、自己複製オルガノイドに再構成することです。この方法により、幹細胞やニッチ細胞の遺伝子組み換えや生化学的修飾など、腸幹細胞分野における重要な特定の問題に対処することができます。この手法の主な利点は、全陰窩を使用する他のアッセイとは異なり、選別された幹細胞とニッチ細胞を採用しているため、細胞タイプ固有の分析が可能になることです。この方法のビデオデモンストレーションは、特に組織の解離と細胞の取り扱いのステップに関して重要です。これらのステップが適切に実行されない場合、特にファクトソーティング後に細胞の生存率が低下します。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、C57BL/6Jの背景にLgr5マウスを材料と犠牲にすることから始めます。ハサミで腹膜を縦方向に解剖します。鉗子で胃を持ち、ここから腸ハサミを使って横方向に半分に切ります。腸を引き出し、PBSの入ったシャーレに入れます。鈍い先端を胃に入れることから始め、幽門にそっと押し込みます。ハサミで切り、鉗子で引っ張って進めます。小腸全体が縦方向に開いたら、鉗子で保持し、U字型の動きでPBS溶液で優しくすすいで、冷たいPBSで洗います。便の残りがすべて取り除かれたら、まな板の上で内腔側を上にして腸を平らにします。内腔側は、血管がなく、外側の部分と比較するとその青白い外観によって容易に認識できます。スライドガラスで、扁平になった腸をこすり落とすようにして絨毛をやさしく取り除きます。組織の全長に沿ってステップを2回実行します。次に、滅菌済みの外科用刃で小腸を2〜5ミリメートルの断片に切ります。小腸の断片を、10ミリリットルの氷冷PBSが入った50ミリリットルのチューブに入れます。組織片を洗浄し、PBS内でピペッティングして残っている不純物を取り除きます。上清を捨て、PBSが完全に透明になるまで手順を繰り返します。次に、15ミリリットルの冷たいPBSを追加して、PBSの総最終容量を25ミリリットルにします。2ミリモルのEDTAを加え、4°Cのローラーで45分間インキュベートします。PBS EDTAを廃棄した後、10ミリリットルのPBSを追加し、組織片を激しくピペッティングして陰窩を切り離します。次に、上清を収集します。この手順を 4 回繰り返します。培地を加えて、最終容量50ミリリットルにします。遠心分離により細胞をペレット化します。最後に、ペレットを10ミリリットルの培地に再懸濁してから、遠心分離によって陰窩をペレット化します。シングルセル調製では、まずペレット化した陰窩の上清を廃棄し、50マイクロリットルのDNaseとともに1ミリリットルのトリプシン様酵素に再懸濁します。細胞を摂氏32度の水浴中で2分間インキュベートします。10ミリリットルの培地を加えた後、少なくとも5回ピペッティングを激しく上下させて、陰窩を単一細胞に解離します。40ミクロンのストレーナーで溶液をろ過し、塊やその他の不純物を取り除きます。次に、単一細胞を重力の300倍で5分間ペレット化します。フローサイトメトリーでは、100万個の細胞ごとに2%のウシ胎児血清を含むX Hank's緩衝塩溶液1ミリリットルにペレットを再懸濁します。細胞懸濁液に、系統マーカーCD31、CD45、およびTer119用のBrilliant Violet 421標識抗体を1:100の濃度で添加します。また、抗CD24 APCおよび抗CD117 PEを1〜250の濃度で添加します。30分後、Lgr5陽性幹細胞とPaneth細胞を別々の低結合チューブに選別します。選別した細胞を重力の300倍で5分間遠心分離します。次に、テキストプロトコルに記載されている成分を含む100マイクロリットルの培地に細胞を再懸濁します。細胞を処理するには、総容量100マイクロリットルの培地と100ナノモルの濃度の低分子干渉RNAに5マイクロリットルのリポソーム媒介トランスフェクション試薬を使用します。細胞を摂氏37度で30分間インキュベートし、小さな干渉RNAを探すか、選択した修飾に必要な時間だけインキュベートします。細胞を500マイクロリットルの培地で2回洗浄します。細胞を重力の300倍で5分間遠心分離した後、10マイクロリットルの培地に再懸濁します。次に、2つの細胞成分を合計20マイクロリットルの容量にプールしてから、室温で重力300倍で5分間遠心分離します。Paneth陽性細胞とLgr5陽性細胞を室温で10分間共インキュベートします。上清を10マイクロリットル取り出し、細胞ペレットが吸引されないように、液体のスキーに入れておきます。次に、再構成された基底膜30マイクロリットルを細胞に加えて、総容量40マイクロリットルにします。細胞を再懸濁し、予め温めた96ウェルプレートにプレートします。10分後、200マイクロリットルの完全培地を追加します。メディアは48時間ごとに交換します。最後に、5日目のオルガノイドの多重度をカウントします。低分子干渉RNA媒介によるLgr5陽性幹細胞におけるマウスAPC遺伝子のノックダウンと、その結果としての標準的なWnt/β-カテニンシグナル伝達経路の活性化は、未処理の対応物やスクランブルされた配列制御と比較した場合、オルガノイドの多様性にプラスの影響を与えます。Wnt活性化の構成は、以前に報告されたように、パネート細胞の要件も救います。さらに、これらのオルガノイドは中空の球体として現れ、Paneth-Lgr5細胞ダブレットから得られたオルガノイドの形態と比較すると、APC変異体またはWnt刺激オルガノイドの表現型としてよく説明されています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば5時間で完了します。この手法を試す際には、すべての手順とインキュベーション時間に従うことが重要です。このビデオを見れば、腸管陰窩の抽出方法、シングルセル消化物の調製方法、ニッチ細胞や幹細胞を再構成してオルガノイドを生成する方法についてよく理解できるはずです。この技術は、腸幹細胞分野の研究者がマウスの小腸または大腸における幹細胞またはニッチ細胞特異的な影響を解剖する道を開きました。この方法は腸管幹細胞ニッチの機能解析のために確立されていますが、乳腺や毛包などの他の体性幹細胞ニッチにも適用できます。この手順に続いて、オルガノイドにおけるゲノムタンパク質発現を解析するための追加の実験(QPCRやウェスタンブロッティングなど)を行うことができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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生検由来の腸オルガノイドと臓器オンチップ技術は、領域特異的な腸機能を再要約するためにミクロ生理学的プラットフォームに組み合わされます。...

ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化

本プロトコルは、クローディン-7ノックアウトモデルにおける結腸幹細胞の活性および機能を研究するためのマウス結腸オルガノイド系の確立を記載する。...

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

マウス小腸陰窩を単離し、陰窩から腸3Dオルガノイドを培養するためのプロトコルについて説明します。さらに、上皮下細胞ニッチの非存在下で単一の腸幹細胞からオルガノイドを生成する方法について述べる。...

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

ここでは、ラット腸管オルガノイドを作製し、いくつかのダウンストリームアプリケーションで使用するためのプロトコルを紹介します。ラットはしばしば好ましい前臨床モデルであり、堅牢な腸オルガノイド系は、in vivo研究に付随するin...

ラット腸管オルガノイドの作製と操作

人間の血管幹細胞（PSCの）間葉系幹細胞（MSC）に似た骨格組織再生のための新しい幹細胞のクラスです。...

骨再生のための人間の血管周囲の幹細胞の使用

学ぶ腸幹細胞とニッチ細胞の再構成アッセイを用いた機能解析法。Lgr5陽性幹細胞とPaneth細胞を分離し、遺伝学的・生化学的改変後にオルガノイドを再構成することで、細胞特異的な解析が可能となる。

腸幹とニッチ細胞機能解析における再構成アッセイ (ORA)

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