大ボリューム、非ひと霊長類におけるオプトジェネティクスの行動に関連した照明

このプロトコルの全体的な目標は、ヒト以外の霊長類の光遺伝学的操作に適した大容量の組織イルミネーターを作成することです。この方法は、さまざまな脳領域のニューロンの集団が行動にどのように寄与するか、ある領域の時間的に特異的なニューロンの発火パターンが別の領域にどのように影響を与えるかなど、神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、光を使用するため、組織の損傷を最小限に抑えながら、行動に関連する大量の脳の光遺伝学的操作が可能になることです。

この技術の意味するところは、ヒトと非ヒトの霊長類の脳との類似性から、トランスレーショナルメディシンにまで及びます。一般に、この方法に不慣れな人は、これらの繊維を引っ張るときに適切な量の圧力をかけるためにある程度の練習が必要なため、苦労するでしょう。この手順を開始するには、鋭利な鋏を使用して、直径250マイクロメートルのプラスチック光ファイバーの、目的のイルミネーターの合計長さより少なくとも10センチメートル長い部分を切断します。

次に、22ゲージのワイヤーストリッパーを使用して、プラスチック光ファイバーの一方の端から15〜20センチメートルのポリエチレンジャケットを取り外します。次に、ファイバーの剥がれた端の最も遠位3〜5センチメートルをテーブルバイスクランプで固定します。ファイバーのジャケット付き端を片手でピンと張った状態で持ち、常にしっかりと引っ張ります。

ファイバーは床と平行で、万力から引き離す必要があります。加熱中と冷却中、ファイバーにかかるこの一定の張力を維持して、ファイバーが細くなってもまっすぐで張り詰めた状態を保つようにします。デュアル温度ヒートガンの最も低い設定を使用して、繊維の剥がれた部分を、直径60〜100マイクロメートル、または人間の髪の毛の直径に細くなるまで加熱します。

ファイバーの張力を一定に保ちながら、ファイバーを冷まします。張力を維持しなかったり、繊維が過熱したりすると、繊維がカールしたり破損したりする可能性があります。ファイバーを加熱するときにファイバーの張力を一定に保つには、利き手ではない方の手を使用して、ヒートガンを使用しているときに離す必要がないようにします。

また、繊維を手のひらに優しく巻き付けて、さらにグリップを向上させることもできます。ファイバーが完全に冷却され、目的の直径に達したら、ファイバーを両側の最も狭い点から3センチメートルつまみます。ファイバーの軸に沿ってすばやく鋭く引っ張ると、側面を分離して先細りの先端を作成します。

次に、先細りの先端を解剖顕微鏡で低電力で調べます。先端が二股に分かれていたり、丸まっていたりする場合は、繊維を捨ててください。多くの練習をしても、繊維の約3分の1は先端が二股またはカールしています。

私たちは、別の繊維を引っ張るのがとても速くて安価であるため、それらを修復しようとするのではなく、単に廃棄します。テーパー状の先端をエッチングする準備をします 先端の端近くにラボテープを置き、目的の先端の長さを露出させます。ここでは、最後の 5 mm が露出しています。

テープは、所望の発光時間を超えるエッチングからファイバーを保護します。その後、5マイクロメートルの炭化ケイ素ラッピングシートの小さな正方形を親指と人差し指の間に折ります。ラッピングシートの両側の間に繊維の先端を置き、小さな円運動で繊維をやさしくエッチングします。

すべての側面が均等にエッチングされるように、ファイバーを頻繁に回転させます。次に、22ゲージのワイヤーストリッパーを使用して、イルミネーターの反対側の端からポリエチレンジャケットの約5ミリメートルを取り外します。次に、反対側の端をホットナイフで平らに切り、表面を滑らかにします。

エッチングされた先端の反対側のイルミネーターの端にコネクタを取り付けます。これにより、イルミネーターを光ケーブルまたはレーザーに接続できます。その後、反対側の端を細かいラッピングシートで平らに磨きます。

その後、平らな反対側の端を内径260マイクロメートルのステンレス鋼フェルールに、フェルールの端と同じ高さになるまで挿入します。反対側の端が滑らかで均一に研磨されていることをファイバー顕微鏡で目視で確認します。フェルールの小さい方の開口部を下に向けて、フェルールをテーブルの端に垂直にテープで固定します。

次に、1ミリリットルの注射器にプラスチックエポキシを充填し、鈍い18ゲージの針を注射器に取り付けます。これに続いて、針を使用してエポキシをフェルールに塗布します。フェルールをエポキシ樹脂で完全に充填します。

ファイバーをフェルールに挿入して、フェルールの底面と同じ高さになるようにします。必要に応じて、乾燥する前に、糸くずの出ない濡れたワイプで繊維の研磨面から余分なエポキシを拭き取ります。このステップでは、各テストセッションの前にタワーマイクロドライブを準備します。

次に、先端が斜めになった25ゲージのガイドチューブをドライブの下部クランプに取り付けます。大容量イルミネーターを上部に固定しますamp 同じドライブの。このクランプは駆動モーターに取り付けられています。

その後、大容量イルミネーターをガイドチューブに完全に通し、イルミネーターの先端がガイドチューブの先端を超えて伸びていることを確認します。あるいは、ラボ用テープをファイバーに貼り付けて、ファイバー自体ではなくテープをクランプしてファイバーを保護することもできます。次に、ガイドチューブとイルミネーターを消毒液に浸して滅菌します。

クリーンチャンバー内に1ミリメートルの穴間隔でカスタム滅菌グリッドを配置し、チャンバーの側面にあるネジで事前に指定された向きで固定します。滅菌された鈍い鉗子を使用してイルミネーターを引き上げることにより、滅菌されたイルミネーターをガイドチューブから引っ込めます。イルミネーターの先端は、ガイドチューブの先端から5〜10ミリメートル上にある必要があります。

マイクロドライブをホルダーに取り付け、ガイドチューブをターゲットグリッド穴に配置します。次に、ガイドチューブが硬膜のレベルをちょうど通過するまで、マイクロドライブステージを下げます。同時に、滅菌鉗子でイルミネーターを手動で下げます。

抵抗がある場合は、イルミネーターを5〜10ミリメートル引っ込め、10分待ってから再試行してください。2回目の試行でまだ抵抗がある場合は、イルミネーターの先端をガイドチューブに引っ込め、ガイドチューブを0.25ミリメートル下げて、再試行してください。イルミネーターのもう一方の端にあるフェルールを、より大きな光学セットアップまたはレーザーに接続します。

この図は、照明によってエラー率が大幅に増加したことを示しています。また、このラスタープロットは、皮質の厚さ2.5ミリメートルにわたるニューロンの阻害を示しています。そして、4.5ミリメートルにわたる光のアーチファクトを示す局所的な磁場ポテンシャル。

習得すると、この技術を使用して10〜15分で大容量のイルミネーターを構築でき、エポキシ乾燥時間もかかります。キャリブレーションにはさらに30分ほどかかるため、効率を最大化するために、通常は一度に複数のイルミネーターを作成します。この手順に参加する際には、多くの照明器具が品質管理基準を満たしていないことを覚えておくことが重要です。

大丈夫です。チップ検査に不合格となった場合は、廃棄します。しかし、キャリブレーションに失敗した場合は、通常、再研磨してキャリブレーションを繰り返します。

その開発後、この技術は、神経科学の分野の研究者が光遺伝学を使用して、ヒト以外の霊長類のニューロンの発火を抑制し、行動を調節する道を開くのに役立ちました。このビデオを見れば、大容量ティッシュイルミネーターの作り方を十分に理解できるはずです。