プラズマ医学 - セルを液体からスループット アプローチの基礎的研究

これらのマルチウェルベースのシーケンスアッセイの全体的な目標は、光発光分光法、液体分析、細胞活性、顕微鏡法、およびフローサイトメトリーアッセイを使用して、in vitroでの生物学的応答に対する酸化剤に対する冷たい物理血漿の影響をよりよく理解することです。この方法は、血漿医療の分野における重要な問題、特に免疫原性がん細胞死の誘導に重要な血漿由来の指示種に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、半自動的なアプローチであることです。

96枚のウェルプレートを使用し、研究のスピードと生産性を向上させます。この技術の意味は、皮膚科や腫瘍学などの将来の血漿療法にまで及びます。また、それらは、生物学的応答に関連する血漿由来の指令種を特定する手段を提供します。

その手順を実演するのは、当研究室の技術者であるフェリックス・ニースナーです。プラズマ種のモニタリングでは、大気圧プラズマジェットを光発光分光光度計の前にプルーム軸に垂直に配置し、専用ソフトウェアを使用して、各ガス条件の光電子と波長を毎分2標準リットルの供給ガスフラックスで記録します。プラズマ処理されたスーパーオキシド分析では、XYZテーブルの最終プロトコールを、それぞれの適切な処理時間とウェル位置とともに

次に、新たに調製したマスターミックス100マイクロリットルを透明で平底の96ウェルプレートのウェルに三重に添加し、マイクロプレートリーダーを使用して550ナノメートルの吸光度を測定します。細胞代謝応答に対する血漿処理の影響を解析するために、層流フードで、目的の4つの細胞に10回、ウェルごとに100マイクロリットルの完全補充細胞培養培地に播種し、平底96ウェルプレートでインキュベートします。細胞培養インキュベーターで一晩培養した後、実験分析に従ってXYZテーブルを使用してウェルをプラズマまたはガスのみで処理し、細胞をさらに20時間インキュベーターに戻します。

2回目のインキュベーションの終わりに、500マイクロモルのレサズリンを補充した25マイクロリットルの新鮮な細胞培養培地を細胞に加え、3つのバックグラウンドコントロールのレサズリン専用ウェルに加えます。細胞をインキュベーターに戻し、3時間のインキュベーションを行います。次に、マイクロプレートリーダーで蛍光を測定します。

血漿処理細胞のイメージングでは、蛍光を読み取りた後、上清を100マイクロリットルの新鮮な細胞培養培地に交換し、1ミリリットルあたり1マイクログラムのヨウ化プロピジウムを補充します。プレートを電動顕微鏡ステージに置き、20倍の対物レンズを選択して細胞をイメージングします。次に、適切な定量画像解析ソフトウェアを使用して、各ウェルで画像化されたすべての視野のデジタル位相コントラスト画像における全細胞質領域を決定します。

血漿処理細胞のフローサイトメトリー解析では、イメージング後、各ウェルの細胞を200マイクロリットルのPBSで2回洗浄し、1回の洗浄につきカルシウムとマグネシウムを添加し、続いて、50マイクロリットルのPBSに1ミリリットルあたり15アナグラムの抗マウスカルレティキュリンモノクローナル抗体を添加し、さらに1ウェルあたりカルシウムとマグネシウムをラベリングします。細胞培養インキュベーターで15分後、200マイクロリットルの完全細胞培養培地で細胞を2回洗浄し、100マイクロリットルの細胞剥離溶液を各ウェルに37°Cで20分間加えます。細胞が剥離したら、プレートをフローサイトメーターにロードし、通常は生細胞に関連する前方散乱および側方散乱集団で最低1, 000イベントを取得します。

次に、適切なフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して、目的の集団をゲートし、カルレティキュリン発現の平均蛍光強度を決定します。光発光分光法は、さまざまな供給ガス条件で反応性プラズマ成分にリンクされた明確なピークを追跡するために使用できます。液体のプラズマ処理では、アルゴンガスとアルゴンプラズマによる蒸発が最初に決定され、プラズマも温度に影響を与えるため、蒸発結果が異なる条件

ヒドロキシルラジカルの光学発光分光法の結果と同様に、過酸化水素の沈着は酸素または窒素の混合物で大幅に減少しますが、加湿された供給ガスで増加します。さらに、供給ガスに窒素を添加すると、アルゴンプラズマ処理された液体と比較して、硝酸塩濃度が有意に高くなります。ほとんどのスーパーオキシドは、乾燥アルゴンガス条件下で生成され、加湿されたアルゴン酸素プラズマの存在下を除いて、酸素および/または窒素の混合物がスーパーオキシドの生成を大幅に消光します。

レサズリンおよび血漿処理細胞の蛍光強度は、細胞培養の上清に視覚的に観察された物理的変化と同様であり、長期の血漿処理の細胞毒性効果が確認されています。血漿処理サンプルウェルでは、特に加湿された供給ガス条件下で、血漿処理への曝露が短いほど反応して、ミレン黒色腫細胞のカルレチクリン染色が全体的にアップレギュレーションされることも観察されます。適切に実施されれば、mytoplex細胞アッセイと読み出しはわずか数時間で完了します。

この手順に続いて、免疫細胞との共培養や細胞培養上清の分析など、他の方法も実行できます。これは、ダム、細胞クライアント、またはreduxタンパク質の放出、および血漿処理された黒色腫細胞の免疫認識に関する追加の質問に答えるのに役立ちます。開発後、この技術は、例えば3D腫瘍スフェロイドを用いたメラノーマサイクルのさらなる研究への道を開きました。

このビデオを見れば、プラズマガス相から反応性分子や液体に対する反応性、メラノーマ細胞の生物学的応答まで、プラズマ医療の基礎研究をどのように行うかを十分に理解できるはずです。