Name: 肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶ肺転移アッセイ（PuMA）を用いた骨肉腫細胞の肺内増殖と適応メカニズムの可視化手法。三次元肺微小環境における転移挙動の解析に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

博士 Arnulfo メンドーサ プーマ技術のトレーニングを提供者に感謝したいと思います。 さらに、この研究の過程で、顕微鏡の使用を提供するため夫妻チャンド khanna 博士、スーザン ガーフィールド (NCI/NIH) とサム アパリシオ (紀元前がん庁) を確認したいと思います。この研究は、癌研究、小児腫瘍学の支部センター国立歯科衛生研究の学内研究プログラムによって (の一部) に支えられました。M.M.L.、国家機関の健康学内研究員の研修 (15335 賞)、によって支えられた、現在転移研究のジョアン ・ パーカー交わりに支えられています。P.H.S. は、ブリティッシュ コロンビア州がん財団によってサポートされます。

画像データが得られた動物のすべてのプロトコルを動物愛護や国立がん研究所の利用委員会、国立衛生研究所の承認を得て行った。説明ビデオの資料に描かれているすべての動物プロトコルは、ブリティッシュ コロンビア大学動物の世話委員会によって承認されています。
1. 注入とプーマのモデルのための材料の腫瘍細胞の準備
注: ソリューションおよび細胞量 1 マウスの十分であります。以上のマウスの研究で使用される場合、必要に応じてスケール アップ。メディアのレシピは、表 1と表 2を参照してください。
<ol><li>中古 A メディア 37 oC の水のお風呂に 15 mL の円錐管に 5 mL を温めます。</li>
	<li>1.2% 低融点アガロース ソリューション (滅菌水) ラボ電子レンジを使用してを溶かします。</li>
	<li>溶融 agarose の 5 mL を 15 mL の円錐管に転送し、37 oC の水浴で保温します。37 oC と肺吸入工程の前に液体に溶かしたアガロースを確認します。</li>
	<li>細胞培養グレード氷バケットに 1 X ペン/球菌を添加した PBS の事前チル 30 mL。</li>
	<li>6 ウェル プレートの 1 つも前 B メディアの 1.5 mL でゼラチン スポンジを浸しなさい。スポンジは、肺のスライスのアンカーをサポートになります。</li>
	<li>OS 細胞が約 70-90% を確保する手術の日に合流。過剰合流またはメディアがオレンジから黄色のセルは通常を強調している、この時点での生存率を減少しているので、電池は使用しないでください。骨肉腫細胞株, MNNG、HOS、100 μ L のボリュームで 5 × 105 1 マウスの尾静脈に注入する使用されます。それに応じての高級以上のマウスを研究に使用する場合。</li>
	<li>0.25% トリプシン-EDTA (3 mL T75 フラスコまたは 10 cm の培養皿で 2 mL) を使用して腫瘍細胞を収穫します。セルは、プレートから持ち上げて始めている、完全なメディアとトリプシン-EDTA を中和します。スピン ・ ダウン細胞と細胞培養グレード PBS で一度すすいでください。5 mL の PBS でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>細胞数を標準的な方法で実行します。細胞懸濁液の損失はしばしば針ドロー アップ中に発生し、インジェクションの試みが失敗したので、何が実際に必要なより多くの細胞懸濁液を確認することをお勧めします。</li>
	<li>細胞の生存率を評価するために細胞懸濁液のサンプルでトリパン ブルー排除分析を実行します。セルは、90% の生存率を示す場合にのみ続行またはより高い。</li>
	<li>100 μ L のボリュームで 5 x 10 の5セルを挿入します。この金額の 2 倍の過剰を準備するには、1 x 10 の6セルにスピンダウン [HBSS の 0.2 mL で再停止されます。</li>
	<li>注射用マウスを準備している間氷バケットに細胞懸濁液を配置します。</li>
</ol>2. 尾静脈注射および肺吸入
注: このセクション中のソリューションと細胞量 1 マウスの十分であります。以上のマウスの研究で使用される場合、必要に応じてスケール アップ。機器、材料および次の手順で使用される手術器械のリストは、表 3 表 4を参照してください。
<ol><li>雌マウス (年齢 6-8 週間) を 5 分間加熱ランプの下で彼らの尾静脈より目に見えて明らかにするために暖かい。マウスの K7M2 や K12 セル使用 Balb/c マウス;MG63.3、mg 63、MNNG、HOS 細胞、重症複合免疫不全マウスを使用します。</li>
	<li>細胞懸濁液がチューブを優しく揺することによって均一であることを確認します。慎重に 1 mL 注射器針なしに細胞懸濁液を作成します。キャップ注射器、27 ゲージの針。針ベベル針のボリュームのマーキングと同じ側にあることを確認します。</li>
	<li>落にマウスを置き、アルコール ワイプでテールを綿棒します。</li>
	<li>尾静脈注射を行い、細胞懸濁液 100 μ L を注入に進みます。注入後 5 分は CO2チャンバーにマウスを置き、安楽死の標準操作手順 (概要、制度上のアニマル ・ ケア委員会) を開始します。プロシージャは気管に損傷を与えるので、安楽死の手段として頚部転位を使用しない必要があります。</li>
	<li>マウスを解剖すると、一度は、アガロース/A-メディア ソリューションのマウス肺の吸入の層流フードの準備を開始します。層流フード内滅菌パッドとワークエリアを設定します。このパッドには、滅菌器具、IV カテーテル、IV 延長セット、重力灌流装置 (補足図 1を参照) を配置します。</li>
	<li>背 recumbancy にマウスを配置します。滅菌の小さなハサミで慎重に胸腔内を公開する胸骨を分析します。アガロース/A-メディア ソリューションに肺を吹き込むために使用されるので、肺がパンクしないように注意します。</li>
	<li>胸骨を切り裂く場合両側に胸郭入口過去気管を解剖します。周囲の軟部組織を離れて解剖で気管を公開します。</li>
	<li>20 ゲージ IV カテーテルと気管を cannulate します。緩く ● キャニュレイテッド気管の周り滅菌腸線縫合糸を使用して外科的結び目を作る。</li>
	<li>カテーテル気管から重力灌流装置の 10 mL の注射器に設定 IV 拡張を取り付けます。</li>
	<li>1:1 の混合物に、予め温めておいた 37 oC agarose (5 mL)、A メディア (5 mL) を組み合わせます。アガロース/A-メディア液を重力灌流装置の 10 mL の注射器に注ぐ。アガロース/A-メディア ソリューションを有する肺のガス注入前、拡張セットの全体の長さはアガロース/A-メディア、これにより空気と肺試料の不注意な吸入を否定でプライミングされてことを確認します。</li>
	<li>肺が完全に充満するまで肺アガロース/A-メディア ソリューションを入力します。</li>
	<li>肺が完全に充満、カニューレを削除、気管を通じて agarase/A-メディア液漏れを防ぐために手術の結び目をしっかりと縛る。</li>
	<li>胸腔内から抜く (気管、心臓及び肺) を分析に進みます。肺の表面に損傷を与えるやない穿刺に注意してください。</li>
	<li>場所中古冷蔵 30 mL の PBS で (ない特定の向き) で抜く 1 X ペン/連鎖球菌性、添加でき、20 分間を固めるアガロース/A-メディア。</li>
	<li>高級はさみやピンセット、図 1 aに示すように、肺 (3 mm × 1.5 mm) の小さな断片をカットを使用してください。小さい肺のスライスは、2.5 X 目的を使用して簡単にイメージすることができます。複数のスライスは、実験条件ごとグループごと通常 4-10 スライス カットできます。 注:, 各実験群 B メディアにあらかじめ浸して 2 × 2 cm ゼラチン スポンジを含む個別井戸 (6 ウェル プレート) に肺のスライスを配置します。ウェルあたりのメディアの量は 1.5 mL をする必要があります。2-3 日毎にメディアを変更します。創薬研究、メディア/薬物を変更する頻度は決定ユーザーです。</li>
</ol>3 肺のスライスと解析広視野蛍光イメージング
注: 広視野蛍光イメージング、小さくスライス、カット (3 × 1.5 × 1 mm) 肺セクションを 2.5 × 対物を使用して 1 つのイメージに合わせるため。
広視野の蛍光顕微鏡画像の取得:
<ol><li>通常、0、3、7、14 日間投与後に肺のスライスが作成されます。生物学的なキャビネットの無菌環境で慎重に転送肺のスライス、ゼラチンから滅菌 35 mm のガラス底にスポンジ丸皿。余分な水分はミラーとして機能し、腫瘍細胞からの蛍光光を反映して、肺のスライスから余分な水分を軽くたたくように注意します。</li>
	<li>図 1 aに示されている同様の方法で肺のスライスを配置します。各列には、異なる実験条件を表すと思います。ない、肺のクロスをピンセットで汚染に注意してください。70% エタノールでリンスし、別の実験群から肺のスライスの処理前に乾燥します。</li>
	<li>撮像パラメーターの最適化 (すなわち。 ゲイン、オフセット、露出時間、ビニング) 蛍光腫瘍細胞と制御 (放置車両) の肺組織を背景と最高のコントラストを提供するグループです。制御グループから同じパラメーターを使用して、実験群をイメージします。Tiff 画像形式として保存します。</li>
	<li>スケールの参考のためには、同じ目的でマイクロメータのデジタル写真を撮る。</li>
	<li>肺自己蛍光が変わるので撮像パラメーターする必要があります調整するコントロールの肺に各撮像セッション。1 つのセッションのため撮像パラメーター必ずしも最適の後続のイメージング セッション。</li>
</ol>画像解析: 注: 次の画像処理手順は、ImageJ 1.51 h ソフトウェア パッケージ17で行われます。
<ol><li>ImageJ (図 3 a) で画像ファイルを開きます。</li>
	<li>背景を減算: プロセス > 引く背景 > ローリング ボール半径 (50 ピクセルで開始)、「光の背景」(図 3 b) オフにします。</li>
	<li>画像を 8 ビットの形式に変換: 画像 > タイプ > 8 - ビット (図 3)。</li>
	<li>単位をピクセルに設定: 画像 > Enter「ピクセル」単位の長さで「ピクセル幅」「ピクセルの高さ」、「ボクセルの深さ」1 を入力。後続の画像に適用する「グローバル」ボックスをを確認します。</li>
	<li>多角形選択ツールを使用して、全体の肺のスライスの形をアウトラインし、総肺のスライスの領域 (ピクセル2) を決定します。この値は、肺の腫瘍パーセント負担の計算に使用されます。</li>
	<li>しきい値画像: イメージ > 調整 > しきい値 >"Default"と"B & W"を強調表示 > 腫瘍のセルの大部分を正確に強調表示するようなイメージのしきい値スライダーを使用します。「適用」を押すと、肺はすべて黒、蛍光の病変は白い黒と白のイメージになります (図 3 D)。2 回の「適用」を押すと、イメージのすべての蛍光灯の構造が黒い図形 (図 3E) で、今を反転します。</li>
	<li>数と病変の形状の定量化: 分析 > 測定を設定 >「領域」を確認してください。他のすべてのボックスをオフにします。 粒子を分析 > サイズ (ピクセル2): 0-無限は ImageJ を列挙する図形の範囲を表します。0 日目車両画像の単一腫瘍細胞とみなされる最小の病変は経験的に判断します。データ セット内の残りの画像の下限値としてこの単一の腫瘍のセルの領域を使用します。本書で挙げた仕事のため 11 ピクセル2が下限値として設定されます。ビデオの例で提示いただき、24 ピクセル2が下限値として設定されます。「真円度」の範囲 0-1 のまま。設定することができます「表示」「何も」。また、「ショー」と「アウトライン」を選択すると、すべて形状アウトライン描画が生成されます。別のウィンドウにポップアップする測定の結果の表示] をチェックします。必要に応じて、チェック「マネージャーに追加」ボックスを持つすべての図形は、将来の参照用に保存できる ROI マネージャーに定量化が保存されます。OK を押すと、「結果」ウィンドウがポップアップすべての列挙された図形と面積 (図 3 f) を含みます。</li>
	<li>コピーして「結果」ウィンドウからデータをスプレッドシートに貼り付けます。Excel で合計数学関数を使用して、その特定の肺のスライスの転移巣のすべての領域の合計します。肺のスライスのパーセント肺腫瘍負荷を評価するために肺のスライスの面積によって病変の面積の合計を分割します。このパラメーターはまたとして知られている面積率 (A) 記述されているアンダーウッド18によってさらに。 肺腫瘍の負担 = 肺のスライスの転移巣エリア/総面積の合計</li>
	<li>コントロール グループおよびグループの残りの肺セクションの残りの部分の肺腫瘍負荷を計算します。0、3、7、14 日間 1 グループあたり平均肺腫瘍量をプロットします。進歩的な時点でプーマ モデルで成長している高低転移 OS 細胞の代表広視野蛍光写真 (図 4 a) のとおりです。パーセントの転移性腫瘍の負担で一定期間 (0 日目に正規化) フォールドの変更を示す線グラフを表示 (図 4 b)。</li>
</ol>4 プーマ モデルの共焦点蛍光イメージング
注: 共焦点イメージングのためティッシュの処理は、前のセクションと同様以外大きい肺のスライスは、イメージを作成するより多くの Roi を許可する (完全な横断、1-2 mm 厚) がカットされます。
DAR4M 肺組織のラベル。
<ol><li>37 ° C で 45 分間 (HBSS) で DAR4M の 10 μμM の肺のスライスを浸すDAR4M は、肺の細胞内活性窒素種をラベル付けします。</li>
	<li>インキュベーションの 45 分後に、新鮮な HBSS と肺のスライスをすすいでください。</li>
	<li>丸皿、共焦点顕微鏡の画像 35 mm のガラス底で肺のスライスを配置します。</li>
	<li>図 5に示す例の画像撮像パラメーターの表 5のとおりです。</li>
	<li>関心領域の Z スタックを取得します。ナイキスト ・ サンプリングの推奨の Z スライス厚を使用します。DAR4M ラベルの肺組織に緑色蛍光 OS セルを表示する 3 D スタックの代表的な映画は、映画 1と補足的な映画 1で提供されます。</li>
</ol>例の共焦点画像を図 5に示すように、イメージング セッションをターミナルでした。生活に少ない光損傷があるので縦イメージングが必要な場合、2 光子または多光子の整った LSM 顕微鏡イメージングのための使用はお勧め組織19,20。 プーマ モデルで水戸 RFP 発現 mg 63 細胞のイメージング。
<ol><li>ステップ 1 や水戸 RFP 作成を表現する mg 63 セルを用いた 2 でアウトラインとしてプーマ プロトコルを実行します。</li>
	<li>丸皿、共焦点顕微鏡の画像 35 mm のガラス底で肺のスライスを配置します。</li>
	<li>図 6に示す例の画像撮像パラメーターの表 6のとおりです。映画 2の補足の映画 2蛍光ミトコンドリアを提供の赤と緑の蛍光 OS 細胞を示す 3 D スタックの代表的な映画。</li>
</ol>

<ol><li>Khanna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+drug+development+path+that+targets+metastatic+progression+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma.</a> Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective%3A+The+right+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspective: The right trials.</a> Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).</li>
<li>Mendoza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).</li>
<li>Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+resistance+and+PKC+signaling%3A+distinguishing+features+of+high+and+low+metastatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells.</a> Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).</li>
<li>Lizardo, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+Glucose-Regulated+Protein+78+in+Metastatic+Cancer+Cells+Is+Necessary+for+Lung+Metastasis+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression.</a> Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).</li>
<li>Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPouliot%2C+N+%22Metastatic+Cancer%3A+Clinical+and+Biological+Perspectives%22">Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives</a>. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).</li>
<li>Cameron, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+progression+of+metastasis+in+lung%3A+cell+survival%2C+dormancy%2C+and+location+dependence+of+metastatic+inefficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency.</a> Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).</li>
<li>Morrow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+inhibition+mitigates+enhanced+mRNA+translation+associated+with+the+metastatic+phenotype+of+osteosarcoma+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo.</a> Clinical Cancer Research. , (2016).</li>
<li>Varghese, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+videomicroscopy+reveals+differential+effects+of+the+vascular-targeting+agent+ZD6126+and+the+anti-angiogenic+agent+ZD6474+on+vascular+function+in+a+liver+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model.</a> Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).</li>
<li>Khanna, C., Hunter, K. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/7085/128aafb639e92c1df8f0212bfe53757e9cbd.pdf">Modeling metastasis in vivo.</a> Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).</li>
<li>Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+considerations+for+studying+cancer+metastasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo.</a> Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).</li>
<li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li>
<li>El-Naggar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Activation+of+HIF1alpha+by+YB-1+Promotes+Sarcoma+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis.</a> Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).</li>
<li>MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+spread+and+micrometastasis+development%3A+quantitative+approaches+for+in+vivo+models%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models.</a> Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cancer+cell+extravasation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantification of cancer cell extravasation in vivo.</a> Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Underwood, E. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUnderwood%2C+EE+%22Quantitative+stereology%22">Quantitative stereology</a>. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).</li>
<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+imaging+of+cancer+metastasis+using+multiphoton+microscopy%3A+a+short+review%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review.</a> Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).</li>
<li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li>
<li>Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Live+Imaging+of+Lung+Metastasis+and+Their+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment.</a> J Vis Exp. (108), e53741(2016).</li>
<li>Guha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+retrograde+signaling+induces+epithelial-mesenchymal+transition+and+generates+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).</li>
<li>Ren, L., Morrow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Positively+selected+enhancer+elements+endow+osteosarcoma+cells+with+metastatic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22.+Nat+Med%22%5BJournal%5D)"> Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence.</a> . Nat Med. , (2018).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Metabolomics+uncovers+a+link+between+inositol+metabolism+and+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22+Oncotarget%22%5BJournal%5D)"> Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis.</a> Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+metastatic+phenotype+of+a+panel+of+established+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells.</a> Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

次の技術資料では、OS で肺を植民地化の勉強にプーマのモデルのいくつかの実用的な側面について説明します。研究者が細心の注意を取る必要がありますプロトコルのいくつかの重要なステップは次のとおりです。
) の気管カニューレ装着。気管は、周囲の筋肉や結合組織を解剖しながら簡単に破損することができます。さらに、カテーテルの針は気管を通じて簡単にプッシュできます。カニューレを挿入するときに、針のベベルが気管を入力する方法に細心の注意を払います。
b) 穴をあけるか、肺の表面を損傷します。肺を簡単にパンクしたか胸骨を除去し、胸腔内を公開するはさみを解離性大破損することができます。胸腔内から抜くうち解離性に注意します。穴をあけるまたは肺の表面の損傷、液体アガロース/A-メディアに漏れ出してと肺はデフレートされます。
c).をイメージしながら余分なメディアを肺セクションから削除します。周囲の肺セクション余分な液体メディアは、顕微鏡下で見たときは、「ミラー」効果を引き起こ...

転移性骨肉腫 (OS) の小児患者に対する改善結果重要な満たされていない臨床必要性1が残っています。これは、新しい分子標的療法の開発の重要性を強調します。ターゲット腫瘍細胞の増殖転移性疾患, とこのように新しい戦略の治療に有効であることを証明されていない従来の化学療法は2転移プロセス自体をターゲットする必要があります。現在の記事、メンドーサと同僚3、新しい発見に有用なツールを提供するによって開発された肺転移アッセイ (プーマ)前のヴィヴォ肺転移モデルの比較的新しいタイプの実用的な側面をについて説明しますOS 4,5で肺転移の進行で分子のドライバー。前に、しかし、転移、いくつかの現在のモデルは簡単に触れることが賢明だろう、試金する方法プーマ モデルは従来の in vitroでのいくつかの利点を提供しています。
特定のステップまたは転移の翼列のいくつかの手順を要約の in vitroとin vivoの系の転移を研究に使用される最も実験的モデルを構成します。これらの手順が含まれます: セカンダリ サイト、4) 血管外漏出およびセカンダリ サイト、5) 形成の生存で原発腫瘍、2) intravasation から移行して近くの血管 (血液あるいはリンパ管) との循環の中のトランジットに 1) 腫瘍細胞 3) 逮捕微小、および 6) の血管転移 (図 1) に成長。転移のin vitroモデルの 2 次元 (2 D) 移行を含めることができますで検討している 3 次元 (3 D) マトリゲル浸潤アッセイ細部6では別の場所で。生体内でモデルの 2 つの一般的なモデル システムが含まれます: 1)自然転移モデルは、腫瘍細胞ががん転移細胞を自発的に投げかけているローカル腫瘍を形成する特定の組織型に注入遠いサイト;2)実験的転移モデルは、標的臓器の上流血管に腫瘍細胞を注入するところです。たとえば、開発肺転移5,7,8で腫瘍細胞結果の尾静脈注射など。実験的転移の他のモデルには、脾臓や肝臓転移9,10の開発に起因する腸間膜静脈に腫瘍細胞の注入が含まれます。これらの体内モデルの実用的な考慮事項は、ウェルチ11で詳しく説明します。もう一つは、体内の小児肉腫の転移を研究するために使用モデルは、肺12,13ローカル腫瘍形成および自然転移で起因する腎の腎被膜下腫瘍移植モデルです。生体顕微鏡など技術的に厳しい技術直接視覚化に転移性癌細胞と転移巣の微細血管系のリアルタイム相互作用 (すなわち肺や肝臓) マクドナルド14 のとおり。と Entenberg15、または前述の金16漿尿膜にがん細胞浸潤。
プーマ モデルは肺組織植前のヴィヴォ、閉じた文化システム、蛍光腫瘍細胞の成長混入すること縦蛍光顕微鏡による 1 ヶ月の期間にわたって (図 2 a参照)。このモデルは、転移のカスケードの肺植民地化 (手順 3 から 5) の最初の段階を繰り返します。従来の in vitroモデル プーマ モデルのいくつかの主要な利点がある: 1) で縦肺微小環境の多くの機能を保持する 3 D の微小環境の転移性癌細胞の成長を測定する機会を提供しますvivo 3;2) プーマにより候補遺伝子や薬物治療のノックダウンは、3 D 肺微小環境; のコンテキストで抗転移活性を持つかどうかを評価するために研究員3) プーマ モデルは、柔軟性に蛍光顕微鏡プラットフォーム (図 2 b) 広視野蛍光顕微鏡やレーザー走査型共焦点顕微鏡などの多くの種類とそれぞれの例図 2開発、それぞれ。プーマ モデルを使用して強化された緑の蛍光蛋白質 (eGFP) の転移の成長に縦の画像データを取得する方法を説明します-表現する、人間の高と低転移性骨肉腫細胞 (MNNG、HOS 細胞それぞれ) を使用して低倍率広視野蛍光。肺実質をラベル蛍光染料と OS 内のミトコンドリアを分類する遺伝のレポーター細胞の共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いたプーマ赤色蛍光タンパク質のイメージングの例についても説明します。

<table><tbody><tr><td>表 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養試薬 A-media, B-media, and complete media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNNG-HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1547</td><td>高転移性 OS 細胞株</td></tr><tr><td>HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td>低転移性 OS 細胞株</td></tr><tr><td>MG63.3</td><td>Amy LeBlanc Laboratory (NCI)</td><td>N / A</td><td>高転移OS細胞株</td></tr><tr><td>MG63</td><td>ATCC</td><td>CRL-1427</td>低<td>転移OS細胞株</td></tr><tr><td>10X M199培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11825015</td><td>A培地およびB培地用ベース培</td></tr><tr><td>地蒸留水(滅菌済み)</td><td>サーモフィッシャー15230-147A</td><td></td><td>培地のコンポーネント&B媒体</td></tr><tr><td>7.5%重炭酸ナトリウム溶液</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25080094</td><td>A媒体の成分&B-media</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Alrich</td><td>H6909</td><td>A-media のコンポーネント &B-media</td></tr><tr><td>酢酸レチノール-水溶性</td><td>Sigma-Alrich</td><td>R0635-5MG</td><td>A-mediaのコンポーネント &B-media</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン 10X 濃縮 (10000 U/ml) 溶液</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td>A-media の成分 &Bメディア、コンプリートメディア。</td></tr><tr><td>ウシインスリン溶液(10mg / ml)</td><td>シグマアルリッチ</td><td>I0516-5MLA-media</td><td>のコンポーネント&B-media</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11965092</td><td>完全培地のベース培地</td></tr><tr><td>L-グルタミン(200 mM)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25030081</td> 完全<td>培</td></tr>地の成分 <tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16000044</td><td>完全培地の成分</td></tr><tr><td>Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14190144</td><td>細胞培養に使用されます。</td></tr><tr><td>ハンク緩衝塩溶液、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14175095</td><td>注射前に細胞ペレットを再懸濁するために使用されます</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25200114</td><td>細胞培養に使用されます。</td></tr><tr><td>DAR4M</td><td>Enzo</td><td>ALX-620-069-M001</td><td>肺実質の標識に使用されます。</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号<</td><td>strong>コメント</td></tr><tr><td>strong表3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710共焦点LSM</td><td>の</td><td></td>材料<td>顕微鏡</td></tr><tr><td>ツァイス 780 共焦点 LSM</td><td>ツァイス</td><td>N/A</td><td>倒立LSM共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>SCIDマウス</td><td>チャールズリバー</td><td>N/A</td><td>NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl、女性、生後6-8週</td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-9863</td><td>肺組織切片のサポートとして使用されます。</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>肺の気腹治療中に使用されます。</td></tr><tr><td>27ゲージ針付き1mlシリンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-826-87</td><td>尾静脈注射に使用されます。</td></tr><tr><td>10mlシリンジ</td><td>BD</td><td>309604</td><td>肺の送気に使用されます。</td></tr><tr><td>20ゲージカテーテル</td><td>テルモ</td><td>SR-OX2032CA</td><td>肺の気腹時に使用されます。</td></tr><tr><td>アボットIVエクステンションセット(30インチ、滅菌済み)</td><td>Medisca</td><td>8342</td><td>肺の気腹中に使用されます。</td></tr><tr><td>アルコールスワブ</td><td>BD</td><td>326895</td><td>注射前に尾静脈を拭くため</td></tr><tr><td>滅菌手術用手袋</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイズにより異なる</td><td>マウスの肺の懐疑的な取り扱い</td></tr><tr><td>30cm定規</td><td>ステープル</td><td></td><td>肺の気通しに使用されます。</td></tr><tr><td>定規</td><td>Pipette.com</td><td>HS29022A</td>用サポートスタンド <td>肺の送気に使用されます。</td></tr><tr><td>35mmガラス底培養皿</td><td>イビディ</td><td>81158</td><td>肺スライスのイメージング中に使用</td></tr><tr><td>防水防湿バリア付き吸収性アンダーパッド</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td>生物学的フードの滅菌作業領域を裏打ちするために使用されます。</td></tr><tr><td>Catgut Plain Absorbable Suture</td><td>Braun</td><td>N/A</td><td>カニューレ付き気管を縛るために使用されます。</td></tr><tr><td>名前</td><td>strong<>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Table 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PuMA用手術器具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/</td><td>Sharp Roboz</td><td>RS-5910</td><td>肺切片切断用</td></tr><tr><td>4インチ(10センチ)ロングセレーションストレートエクストラデリケート0.5mmチップ</td><td>ロボズ</td><td>RS-5132</td><td>肺部分の操作/保持用。</td></tr><tr><td>4インチ(10センチ)長い鋸歯状のわずかなカーブ 0.8mm Tip</td><td>Roboz</td><td>RS5135</td><td>肺部の操作/保持用。</td></tr><tr><td>親指ドレッシング鉗子;鋸歯 状;弱い;4.5インチの長さ。1.3mmチップ幅</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>一般解剖用。</td></tr><tr><td>親指ドレッシング鉗子 4.5インチ 鋸歯状 2.2mm 先端幅</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>一般的な解剖用。</td></tr><tr><td>極細マイクロ解剖ハサミ 3.5インチ ストレートシャープ/シャープ、20mm刃</td><td>ロボズ</td><td>RS-5880</td><td>一般的な解剖用。</td></tr><tr><td>ナップハサミ;直;シャープ-ブラント;27mmのブレードの長さ;全長4インチ</td><td>Roboz</td><td>RS-5960</td><td>一般的な解剖用。</td></tr></tbody></table>

肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

肺転移アッセイ (プーマ) は、肺植前のヴィヴォと閉じた細胞培養系蛍光顕微鏡による骨肉腫 (OS) で肺を植民地化の生物学を研究する研究者を許可します。この資料では、プロトコルの詳細な説明を提供し、広視野または共焦点蛍光顕微鏡のプラットフォームを使用して転移の成長上の画像データを得るの例について説明します。プーマ モデルの柔軟性により、肺微小環境の OS 細胞の成長だけでなく研究にも時間をかけて抗転移治療の効果を評価する研究者です。共焦点顕微鏡による肺実質と OS 細胞相互作用の前例のない、高解像度のイメージングが可能です。また、プーマ モデルを蛍光色素や蛍光タンパク質遺伝子記者と組み合わせれば、肺微小環境、細胞および細胞レベル下の構造、遺伝子機能および転移の OS 細胞におけるプロモーター活性研究者の研究することができます。プーマ モデルは、骨肉腫の研究者から新しい転移生物を発見し、新規抗転移、ターゲットを絞った治療法のアクティビティを評価するための新しいツールを提供します。

低倍率広視野蛍光顕微鏡
プーマ肺のスライスの広視野蛍光顕微鏡、代表的な画像と定量化データは図 2、および図 4 aとBで示されています。高と低転移細胞の転移の性癖は進行時間のポイントを視覚的に明らかにされます。効率的に、MNNG セルは、HOS 細胞がすべて育つことができないに対し肺組織を植民地化できます。画像解析から図 4 bのグラフで示すように、時間をかけて成長を評価する定量的なデータを取得できます。1 つのイメージで全体の肺のスライスをキャプチャするために低倍率 (2.5 X) で取得お勧めします。このメソッドは、大きい番号のプーマ スライスのバッチ画像処理を許可します。
<p...

この記事の目的は、肺転移アッセイ (プーマ) のプロトコルの詳細な説明を提供するためにです。このモデルは、広視野蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して肺の転移性骨肉腫 (OS) 細胞の成長の研究に研究を許可します。

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

この肺転移アッセイの全体的な目標は、生存可能な肺組織における転移性骨肉腫細胞の増殖を直接視覚化し、研究することです。この方法は、骨肉腫転移領域における本当に重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、転移性骨肉腫細胞が肺の微小環境でどのように適応し、生存し、増殖するかなどです。この技術の主な利点は、関連する3次元微小環境での転移性骨肉腫細胞増殖の直接視覚化を可能にすることです。一般的に、この方法に不慣れな人は、気管をカニューレで掻き出し、肺を通気するという技術的に困難な手順のために、苦労するでしょう。腫瘍細胞の尾静脈注射とマウス安楽死は、標準的な施設のガイドラインに従って行われます。5分後、安楽死させたマウスを層流フードの滅菌パッドに背側横臥位に置き、小さな滅菌ハサミを使用して、肺に穴を開けることなく、気管の両側の胸部入口を過ぎて胸骨を慎重に解剖します。気管を取り巻くすべての筋肉と結合組織を解剖することは、カニューレ挿入を成功させるために不可欠です。次に、20ゲージのIVカテーテルを使用して気管を慎重にカニューレし、滅菌済みのキャットガット縫合糸を使用してカテーテルと気管を緩く固定します。カテーテルからのIVエクステンションセットを重力増殖装置の10ミリリットルシリンジに取り付け、中溶液と混合した摂氏37度の液体アガロースをシリンジに注ぎます。肺が完全に気泡するまで、肺をアガロース溶液で満たします。次に、カニューレを取り外し、アガロース溶液の漏れを防ぐために縫合糸をしっかりと結びます。気腹の間、肺を無傷に保つことが重要です。アガロースによる適切な気腹とそれに続く摘み取りの冷却により、肺は拡張した状態に維持されます。摘み取り、気管、心臓、肺を採取し、肺の表面に穴を開けたり損傷したりしないように注意してください。抗生物質を補給した30ミリリットルの予冷PBSに組織を置き、アガロースを固化させます。撥弦を氷の上に20分間置きます。20分後、細いハサミとピンセットを使用して肺を3 x 1.5ミリメートルの小片に切断し、スライスをB培地に予め浸した2 x 2センチメートルのゼラチンスポンジを含む6ウェルプレートの個々のウェルに入れます。イメージングの日に、実験グループに従って、6ウェルプレートから肺スライスを無菌の35ミリメートルガラス底の丸い皿に慎重に移します。次に、広視野蛍光顕微鏡で、2.5倍対物レンズを選択し、蛍光腫瘍細胞と対照組織サンプル群の非蛍光背景組織との間に最高のコントラストが得られるようにイメージングパラメータを設定します。コントロール組織と同じパラメータを使用して、すべてのサンプルをイメージングします。ソフトウェアがスケールキャリブレーションされていない場合は、肺組織と同じ対物レンズを使用してマイクロメータをイメージングしてスケールリファレンスを取得し

practical-considerations-studying-metastatic-lung-colonization

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

この記事では、ヒト癌細胞株の転移能を決定するために使用される実験的転移アッセイの手順を説明します。...

実験的転移アッセイ

本研究で報告された新たなプロトコルが組み合わせによるマウスの単一細胞の解像度で肺転移の選択的検出を可能に...

組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上<em&gt;のin-situ</em肺組織とのX-gal染色の&gt;灌流<em&gt; lacZを</em&gt;タグ付き腫瘍細胞

本稿では、腫瘍の転移の動物モデルにおける肺腫瘍細胞蓄積を定量化する方法について説明します。...

肺腫瘍細胞募集試験

本研究は、緑色蛍光タンパク質および生物発光シグナルの検出と定量的分子検出技術の統合によって腫瘍負荷を正確に評価するための高度なプロトコルをプリセットする。...

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

記述されたアプローチは、実験的な尾静脈転移アッセイと生体内生動物イメージングを組み合わせることで、肺の転移数と大きさの定量に加えて、乳癌転移の形成と増殖をリアルタイムでモニタリングすることを可能にする。...

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

癌細胞の静脈内注射は転移研究でよく用いられるが、転移性腫瘍の負担は分析が難しい。本明細書において、転移の尾静脈注入モデルを示し、生じる転移性肺腫瘍の負担を分析する新しいアプローチを含む。...

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

骨転移モデルは、一様に転移を発症したり、発生率が100%であったりすることはありません。骨内腫瘍細胞を直接注射すると、肺の塞栓術を引き起こす可能性があります。固形腫瘍移植による骨への移植を用いて原発性骨腫瘍と骨転移をモデル化し,再現性のある生着と成長に導く技術を紹介します。...

固形腫瘍移植による骨原発性骨腫瘍と骨転移のモデリング

ここでは、転移生物学の前臨床調査や新規治療薬の開発に使用できる自発的な肺転移を伴う骨肉腫の切断手順に続く同種の同一性の好交性移植法について説明する。...

転移率を制御する切断を用いた同種異形性骨肉腫スプレイグ・ドーリーラットモデル

本プロトコールは、同所性骨肉腫および肺転移病変を有するマウスモデルを生成するための脛骨内骨肉腫細胞注射を記載する。...

同所性骨肉腫および肺転移マウスモデルを生成するための脛骨内骨肉腫細胞注射

この原稿は、同所注射された乳房腫瘍からの自然肺転移の確立および縦断的成長モニタリングの方法論を説明しており、転移カスケードのすべての段階での介入に適しています。...

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

この実験プロトコルは、lncRNAのノックダウンとコロニー形成アッセイを組み合わせ、lncRNAが骨肉腫細胞増殖に与える影響を定量化する、安定的でコスト効率が高く効率的な方法を提供します。...

LncRNAノックダウン骨肉腫細胞の増殖能力を検出するコロニー形成アッセイ

学ぶ肺転移アッセイ（PuMA）を用いた骨肉腫細胞の肺内増殖と適応メカニズムの可視化手法。三次元肺微小環境における転移挙動の解析に有用です。

肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

さらに動画を探す