肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

この肺転移アッセイの全体的な目標は、生存可能な肺組織における転移性骨肉腫細胞の増殖を直接視覚化し、研究することです。この方法は、骨肉腫転移領域における本当に重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、転移性骨肉腫細胞が肺の微小環境でどのように適応し、生存し、増殖するかなどです。

この技術の主な利点は、関連する3次元微小環境での転移性骨肉腫細胞増殖の直接視覚化を可能にすることです。一般的に、この方法に不慣れな人は、気管をカニューレで掻き出し、肺を通気するという技術的に困難な手順のために、苦労するでしょう。腫瘍細胞の尾静脈注射とマウス安楽死は、標準的な施設のガイドラインに従って行われます。

5分後、安楽死させたマウスを層流フードの滅菌パッドに背側横臥位に置き、小さな滅菌ハサミを使用して、肺に穴を開けることなく、気管の両側の胸部入口を過ぎて胸骨を慎重に解剖します。気管を取り巻くすべての筋肉と結合組織を解剖することは、カニューレ挿入を成功させるために不可欠です。次に、20ゲージのIVカテーテルを使用して気管を慎重にカニューレし、滅菌済みのキャットガット縫合糸を使用してカテーテルと気管を緩く固定します。

カテーテルからのIVエクステンションセットを重力増殖装置の10ミリリットルシリンジに取り付け、中溶液と混合した摂氏37度の液体アガロースをシリンジに注ぎます。肺が完全に気泡するまで、肺をアガロース溶液で満たします。次に、カニューレを取り外し、アガロース溶液の漏れを防ぐために縫合糸をしっかりと結びます。

気腹の間、肺を無傷に保つことが重要です。アガロースによる適切な気腹とそれに続く摘み取りの冷却により、肺は拡張した状態に維持されます。摘み取り、気管、心臓、肺を採取し、肺の表面に穴を開けたり損傷したりしないように注意してください。

抗生物質を補給した30ミリリットルの予冷PBSに組織を置き、アガロースを固化させます。撥弦を氷の上に20分間置きます。20分後、細いハサミとピンセットを使用して肺を3 x 1.5ミリメートルの小片に切断し、スライスをB培地に予め浸した2 x 2センチメートルのゼラチンスポンジを含む6ウェルプレートの個々のウェルに入れます。

イメージングの日に、実験グループに従って、6ウェルプレートから肺スライスを無菌の35ミリメートルガラス底の丸い皿に慎重に移します。次に、広視野蛍光顕微鏡で、2.5倍対物レンズを選択し、蛍光腫瘍細胞と対照組織サンプル群の非蛍光背景組織との間に最高のコントラストが得られるようにイメージングパラメータを設定します。コントロール組織と同じパラメータを使用して、すべてのサンプルをイメージングします。

ソフトウェアがスケールキャリブレーションされていない場合は、肺組織と同じ対物レンズを使用してマイクロメータをイメージングしてスケールリファレンスを取得し、すべての画像をTIFファイルとして保存します。すべての画像を取得したら、ImageJで画像を解析するために、最初のファイルを開きます。ポリゴン選択ツールを使用して、肺スライス全体のアウトラインを作成し、肺スライス全体の面積を決定します。

プロセスを選択し、背景を減算します。転がるボールの半径を 50 ピクセルの開始値に設定します。この値はバックグラウンド蛍光の程度に依存し、データセットごとに最適化する必要があります。

明るい背景のチェックを外してください。画像とタイプ、8ビット、次に画像とプロパティを選択し、ピクセルを入力します。[長さの単位] で、ピクセル幅、ピクセル高さ、およびボクセル深度に 1 を入力します。

次に、[グローバル] をオンにして、これらのパラメーターを後続のすべての画像に適用します。次に、画像を選択し、次に調整し、次にしきい値を選択します。デフォルトと白黒を強調表示し、スライダーを使用して画像のしきい値を設定し、腫瘍細胞の大部分が正確に強調表示されるようにします。

[適用]を1回クリックして、肺を黒くし、蛍光病変を白くします。次に、もう一度[適用]をクリックして画像を反転し、すべての蛍光構造が黒くなるようにします。病変の数と形状を定量化するには、分析と測定値の設定、および領域の確認を選択します。

他のすべてのボックスのチェックを外します。次に、粒子の分析を選択し、サイズフィールドでImageJによって単一細胞であると決定された最小の病変の領域を使用して、プログラムが列挙する形状の範囲を設定します。Day 0 車両グループの画像を使用して、単一の腫瘍細胞と見なされる最小領域を選択します。

下限を設定したら、[OK]をクリックします。結果ウィンドウがポップアップ表示され、列挙されたすべての形状と面積の測定値が表示されます。次に、結果ウィンドウからデータをコピーしてスプレッドシートに貼り付け、数学関数の合計を使用して、その特定の肺スライスの転移性病変のすべての領域を追加します。

高転移性細胞株と低転移性細胞株の転移傾向は、進行性の時点で視覚的に明らかです。より具体的には、これらの顕微鏡画像は、転移性の高い細胞が低転移細胞株よりも効率的に肺にコロニーを形成することができることを示しています。画像データの画像解析、定量化、統計解析により、転移性の高い腫瘍細胞が効率的に肺組織にコロニーを形成することができることが確認されました。

一方、低転移細胞はまったく成長できません。高倍率共焦点蛍光顕微鏡法により、EGFP発現腫瘍細胞と比較して、肺実質細胞を非常に空間的に詳細に可視化することができます。また、これらのミトコンドリアなどの細胞内構造の分析を容易にします。

使用するマウスの数にもよりますが、この手法は適切に実行すれば4時間で完了することができます。この手順を試みるときは、清潔で滅菌済みの手術器具を使用することを忘れないでください。開発後、この技術は、がん研究の分野の研究者がマウスの肺の転移進行を調査する道を開きました。

この手順に続いて、in vitro細胞培養アッセイやウェスタンブロッティングなどの他の方法を実行して、がん細胞に対する遺伝子ノックダウンまたは薬物治療の影響に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、肺転移アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。人間の癌細胞を扱うことは非常に危険であり、この手順を実行する際には、バイオレベルの安全2つの実験室での作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。