Name: 単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の採用を検討する癌細胞株における遺伝子発現の条件付きのノックダウン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぼう、Tet-ONシステムを用いた遺伝子発現の条件付きノックダウン法で、がん細胞由来タンパク質が単球・マクロファージを腫瘍微小環境に誘引するメカニズムを解明する方法です。抗体非接触で95%以上の純度でヒト単球を精製し、がん免疫相互作用の研究に活用できます。

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著者は、原稿の校正にジャクリーン · ローゼンバーグを認めると思います。この作品は DeClerck 屋の付与と米国保健社会福祉省/国立衛生研究によって支えられた (5R01 CA 129377 付与) と TJ マーテル財団。MH クバラはサバン研究所子供のロサンゼルスの病院での研究のキャリア開発奨励賞の受信者です。

<ol><li>Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+transgenic+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Conditional transgenic technologies.</a> J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).</li>
<li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nat Rev Clin Oncol. , (2017).</li>
<li>Franklin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+origin+of+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages.</a> Science. 344 (6186), 921-925 (2014).</li>
<li>Ruffell, B., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+therapeutic+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages and therapeutic resistance in cancer.</a> Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).</li>
<li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immune+checkpoint+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li>
<li>Mizuguchi, H., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+adenovirus-mediated+tetracycline-controllable+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system.</a> Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).</li>
<li>Meyer-Ficca, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+inducible+expression+systems+in+transient+transfection+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies.</a> Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).</li>
<li>Wiederschain, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-vector+inducible+lentiviral+RNAi+system+for+oncology+target+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation.</a> Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).</li>
<li>Wee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN-deficient+cancers+depend+on+PIK3CB%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).</li>
<li>Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+CXCR4+by+inducible+small+interfering+RNA+inhibits+breast+cancer+cell+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro.</a> Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).</li>
<li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+suppression+of+cellular+genes%3A+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).</li>
<li>Solari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYCN-dependent+expression+of+sulfatase-2+regulates+neuroblastoma+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival.</a> Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).</li>
<li>Liao, Y., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+RNAi+system+and+its+application+in+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics.</a> Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).</li>
<li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576901">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li>
<li>Jungi, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+chemotaxis+by+a+reversible+Boyden+chamber+eliminating+cell+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).</li>
<li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+autocrine+motility+factor+suppress+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer.</a> Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Sorbus+commixta+on+the+invasion+and+migration+of+human+hepatocellular+carcinoma+Hep3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells.</a> Int J Mol Med. , (2017).</li>
<li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+THP-1+cells+exhibit+different+cytokine+expression+patterns+following+stimulation+with+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide.</a> Mediators Inflamm. 2013, 697972(2013).</li>
<li>Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+monocytes+versus+THP-1+monocytes+for+in+vitro+biocompatibility+testing+of+dental+material+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components.</a> J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li>
<li>Flo, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+of+human+monocytes+using+magnetic+particles+covered+by+anti-lymphocyte+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies.</a> J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).</li>
<li>Grondahl-Hansen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor+type+1+in+cytosolic+tumor+extracts+predicts+prognosis+in+low-risk+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients.</a> Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).</li>
<li>Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+of+serous+ovarian+cancer+from+cystic+to+solid+tumors+is+associated+with+increased+expression+of+mRNA+for+urokinase+plasminogen+activator+%28uPA%29%2C+its+receptor+%28uPAR%29+and+its+inhibitor+%28PAI-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1).</a> Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).</li>
<li>Devy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-+or+antiangiogenic+effect+of+plasminogen+activator+inhibitor+1+is+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent.</a> FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).</li>
<li>Bajou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+protects+endothelial+cells+from+FasL-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis.</a> Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).</li>
<li>Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+promotes+inflammatory+process+induced+by+cigarette+smoke+extraction+or+lipopolysaccharides+in+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells.</a> Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).</li>
<li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Targeting+of+Plasminogen+Activator+Inhibitor-1+Decreases+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Migration+and+Neointima+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).</li>
<li>Carmeliet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+role+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+in+arterial+wound+healing+and+neointima+formation%3A+a+gene+targeting+and+gene+transfer+study+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice.</a> Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).</li>
<li>Cao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+receptor+LRP+together+with+tPA+and+PAI-1+coordinates+Mac-1-dependent+macrophage+migration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration.</a> EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).</li>
<li>Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25342286">Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5).</a> Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).</li>
<li>Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+is+a+critical+downstream+target+of+p53+in+the+induction+of+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence.</a> Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).</li>
<li>Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protumorigenic+activity+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+through+an+antiapoptotic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function.</a> J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).</li>
<li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+monocytes%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells.</a> Science. 327 (5966), 656-661 (2010).</li>
<li>Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monocytes+undergo+excessive+apoptosis+following+temozolomide+activating+the+ATM%2FATR+pathway+while+dendritic+cells+and+macrophages+are+resistant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant.</a> PLoS One. 7 (6), e39956(2012).</li>
</ol>

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さまざまな種類の細胞から成る、TME は癌の開発のために重要です。最適な成長条件を確認するためには、がん細胞は単球走化性因子の分泌を通じてを引き付けます。ここは、腫瘍細胞の in vitro単球採用のメカニズムを研究するためのプロトコルを提案する.このため、誘引可能な遺伝子発現系、プライマリのひと単球の遊走アッセイによる、ボイデン室アッセイの例として浄化に組み合わせてです。
提案するプロトコルの最初の重要なステップは、テトのベクトルは、常にシーケンスによって評価されるべきに shRNA シーケンスの正しいクローニングを確認です。機能の安定したテトの細胞ラインのさらなる確立は西部にしみが付くことによってドキシサイクリンの存在下で KD をテストによって確認する必要があります。細胞間応用ドキシサイクリンの金額が異なる場合があります、したがってそれは細胞に効果的な濃度 KD と毒性をテストすることをお勧め。テトラサイクリン誘導システムの既知の欠点は、その水漏れしたため6,<sup class="xre...

促進することによって腫瘍の開発に貢献する腫瘍関連マクロファージ (Tam) 腫瘍の増殖、転移、および2免疫応答を調節します。がん細胞の腫瘍に潜入し、pro 幹 Tam3に分化するリクルートの炎症性単球。Tam と腫瘍の浸潤臨床予後と相関してマクロファージ4、5の免疫抑制の役割にリンクされています。しかし、腫瘍に大食細胞の募集のメカニズムはよく検討しないと関与する経路を理解フィールドと有望な治療の更なる向上のために重要です。腫瘍細胞と腫瘍微小環境 (TME) における正常細胞間の相互作用を勉強する際の課題の 1 つはメカニズムの解明や細胞、クロストークの解剖を許可する生体外でアプローチを必要とする複雑です。がん細胞由来のパラクライン効果、体外の大食細胞のような他の細胞型の移行の分泌タンパク質の研究に適用できる汎用性の高い方法論をご紹介します。単球の募集に関与するがん細胞由来タンパク質に対して shRNA 発現がテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下では、システムを使用して、分泌タンパク質の単球のパラクライン効果は量的に表わされます。このプロトコルでは規制のベクトルを提示テトラサイクリンに shRNA 配列のクローニングは続いて安定した癌細胞の世代。さらに、プライマリのひと単球・ ボイデン室アッセイの浄化は、単球の移行にがん細胞に由来するタンパク質のパラクライン効果を分析に使用されます。
蛋白質コーディングの遺伝子のダウンレギュレーション、一般的 siRNA と shRNA のテクニックの使用に制限はないがなくて適用されます。長期的なノックダウン (KD) 遺伝子の実験結果を妨げる細胞の二次的適応反応を引き出すことがあります。遺伝子発現の時空間制御の欠如では、時間の経過や細胞の生存に重要なタンパク質の役割蛋白質の動的役割を研究する困難になります。この問題は、腫瘍が確立された後にのみ腫瘍の開発そして進行中のタンパク質の役割が興味の蛋白質の発現のダウンレギュレーションを必要があります設定体内で特に重要です。条件付き KD 早い致死効果 KD の細胞と無条件の KD は腫瘍の開発の欠如につながる間、腫瘍の成長のさまざまな段階で蛋白質の役割の解析を有効にするを防止する利点があります。
条件付きの KD システムの数は、安定した KD の制限に対処する開発されましたが。条件遺伝子発現系には、エクダイソン誘導発現システム、チトクローム P-450 誘導システム1テトラサイクリン調節遺伝子発現系があります。テトラサイクリン調節遺伝子発現システムは、抗生物質テトラサイクリン (またはより安定したアナログ - ドキシサイクリン) の添加によって shRNA 発現を制御できます。テトラサイクリン/ドキシサイクリン KD、遺伝子発現の結果存在下でテトのシステム、shRNA 発現が誘導される shRNA 発現は遺伝子発現、テトラサイクリン存在下で抑制システム テト オフ中。テトラサイクリン誘導システムの欠点は、ドキシサイクリン - いわゆる水漏れしたため6、7の不在で shRNA 発現以前に報告された低レベルです。テトのシステムで説明した、テトラサイクリンの投与時に関心の shRNA のプロモーター領域が H1、テト応答要素 (TRE) シーケンスに恒常発現テトラサイクリン リプレッサー (TetR) 蛋白質の結合抑制されます。ShRNA 発現とテトラサイクリン依存的8,9の興味の蛋白質の翻訳の抑制でこの結果します。
その他の使用可能なテトのシステムは、シーケンス TATA ボックスと近位シーケンス要素 (PSE) 間および TATA ボックスと転写開始ちゃんらによって開発された重音テトの同時ノックに含めます。10このシステムは、非誘導の状態の下で shRNA 表現を規制するテトラサイクリンの有毒な線量低い shRNA のレベル未満、表されます必要があります。基 Krüppel 関連付けられているボックス (ボブ) テトのシステム11 KRAB、被験者の遺伝子は転写抑制 KRAB 結合部位の 3 kb の範囲内にある亜鉛指蛋白質が含まれます。キメラ蛋白質 tTRKRAB は、重音テトにバインドでき、大きい - DNA 制御可能な容量の範囲のため重音テト必要ないトランスクリプション間制限するサイトやプロモーターを開始しプロモーターの活性に低影響があります。ShRNA11,12; の漏らされた式の下位レベルを表示する非誘起状態の下でこの制御の RNA 干渉システムが報告されました。ただし、連続した 2 つのベクター複製のアプローチが必要です。エクダイソン誘導発現システムやチトクロム P-450 誘導システムなど開発済み条件 KD システムと比較してテトラサイクリン調節システム、堅牢性と、可逆性という利点があります、したがって最も日常的にシステムの13を使用しました。このプロトコルで使用されるシステムは、デュアル システム ノックで重音テトと KRAB テト - システムの利点それはまっすぐ進む、1 つのベクトルのクローニングは、複数のクローンの生成を許可する必要がありで水漏れしたための非常に低いレベルを発揮、ドキシサイクリンの不在。
TME は癌の開発のために重要です。腫瘍の成長を促進するには、癌細胞は走化性蛋白質の分泌によって炎症性単球を採用します。採用単球は腫瘍に潜入し、腫瘍の増殖と転移に貢献するプロ幹 Tam に分化します。免疫細胞の動員のin vitro研究利用移行アッセイ、boyden 教授区域の広く使われている試金使用14,15,16,17。この分析では、走化性因子蛋白質源、たとえば、癌細胞、または浄化された蛋白質は、下部室に配置されます。免疫細胞は、下部コンパートメントから多孔質膜で区切られた上部室に配置されます。走化性因子、および膜の下側に見られる増加勾配向かって移行セルを染色して顕微鏡下でカウントします。ここで我々 はドキシサイクリン添加による pai-1 の表現の規制、誘導性、安定した癌細胞を生成することによって単球のプラスミノーゲン活性化因子阻害剤 1 (PAI-1) の走化性因子の機能をテストします。単球の移行における pai-1 の役割を評価するのにボイデン室移行試験で人間の主要な球を使用します。人間の主な単球と THP1 のような広く使用されている単球性細胞株の違いが報告されているなど異なるサイトカイン発現パターン18;たとえば、THP1 細胞の TNF α 発現レベルは 5-10 倍に増加に比べてひと単球19。THP1 細胞白血病単球細胞から派生して、維持し、倍加時間 19-50 h20の平均で増殖し易い。逆に、成長因子の不在で寿命が短いひと単球が特徴です。単球は、個人間や精製方法によって変動のかなりの量が発生します、ドナーの血液から精製したので他のセルタイプで汚染が発生します。それにもかかわらず、主な単球は関連する、使用か生物学研究19の主な球を使用して単球性細胞株により得られた結果を確認してください推奨されています。ここで末梢血から主な単球人間の浄化のためのプロトコルについて述べる。密度勾配と接着プロトコルと Ficoll 後腹 Percoll グラデーション21続いての単一勾配と 2 つのステップ プロシージャ単球浄化の方法が含まれます。70-90% の間これらのメソッドの範囲によって得られる単球の人口の純度。負の免疫淘汰22続いて密度勾配を使用し、彼らの偶発的な活性化を回避し、結果それにより抗体と直接接触することがなくひと単球の浄化を有効にここで説明する方法を >単球の純粋な人口は 95%。
ひと癌細胞株における遺伝子発現 KD テトのシステム機能を設定するためここで提示されたプロトコルを使用して、癌由来分泌タンパク質のパイ 1 単球走化性因子の影響を検討します。パイ 1 さまざまな腫瘍で過剰発現し、その発現の臨床予後23,24逆説的に関与。Pai-1 のプロ性の役割はそのプロ血管新生の結果、抗アポトーシス機能25,26。パイ 1 は、マクロファージの炎症27サイトの募集を促進することによって炎症に寄与する示されています。パイ 1 は、Mac 1 依存マクロファージ移行30に参加する平滑筋細胞28,29を促進するために示された.パイ 1 過剰発現は、B16F10 メラノーマ腫瘍31に未加工 264.7 の大食細胞の募集を大幅強化にも示されています。ただし、タムの移行における pai-1 の役割は、詳しく解明されていません。記述されていたプロトコルを使用して、パイ 1 ががん細胞を単球を集めているかどうかの質問に答えます。この方法論は、癌細胞の分泌蛋白質を黙らせると、TME の成分を分析により腫瘍と TME の間クロストークの郭清。

<table><tbody><tr><td>Tet-pLKO-puro レンチウイルスベクター</td><td>Addgene</td><td>21915</td><td></td></tr><tr><td>FBS (テトラサイクリンフリー)</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-15</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10771-500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td></td><td>StemCell 18002</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>AgeI HF</td><td>NEB</td><td>R3552S</td><td></td></tr><tr><td>Cut Smart buffer</td><td>NEB</td><td>B7200S</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System</td><td>PROMEGA</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>psPAX ベクター</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G ベクター</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>ワン ショット Stbl3 Chemically Competent&nbsp;E. coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 stain, set for Wright-Giemsa stain sin</td><td>プロトコル</td><td>123-869</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>XhoI restriction enzyme</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>リガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>リガーゼバッファー</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M 溶液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy" EasySep マグネット</td><td>幹細胞</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>0.1% ポリ-L-リジン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu;M シリンジ フィルター</td><td>VWR インターナショナル</td><td>28145-479</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500g</td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン (トリス)</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5 kg</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>ジチオエリスリトール(DTE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8255-5g</td><td></td></tr><tr><td>エタノール(EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td></td></tr>トリ<tr><td>プトン</td><td>アムレスコ</td><td>J859-500g</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>フルカ</td><td>70161-500g</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr>アン<tr><td>ピシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-5g</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグル」コー</td><td>ニング</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>コーニング</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P9620</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリンヒクレート</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D9891-25g</td><td></td></tr><tr><td>ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)</td><td>コーニング</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 24ウェルプレート用透過性サポート 8.0&μ;m 透明PETメンブレン</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター&nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Hema 3 STATパック&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>カンパニー123-869</td><td></td></tr><tr><td>リゾリューション浸漬油、高粘度</td><td>リチャードアランサイエンティフィック</td><td>M4004</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr></tbody></table>

単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の採用を検討する癌細胞株における遺伝子発現の条件付きのノックダウン

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

siRNA と shRNA を介したノックダウン (KD) 遺伝子発現の調整法は、遺伝子やタンパク質の機能を理解するための貴重なツールです。ただし、ケース、興味の蛋白質の KD 細胞致死効果または KD の予想される効果が時間依存性、無条件の KD メソッドを使用すると適切ではありません。条件付きシステムは、このような場合より適しているし、関心の対象とされています。エクダイソン誘導発現システム、チトクローム P-450 誘導システム1テトラサイクリン調節遺伝子発現系であります。
テトラサイクリン調整される遺伝子発現システムは、テトラサイクリン存在下で shRNA 発現誘導による蛋白質の表現の可逆制御をできます。このプロトコルでは、遺伝子発現の条件付き規制ひと癌細胞株における機能的なテトのシステムを用いた実験的なデザインを提案します。我々 は、腫瘍細胞単球の相互作用の研究ではこのシステムの使用を示します。

3 つの shRNA シーケンスのため、最も効率的な KD の PAI-1 がテストされました。このため、パイ 1 とスクランブル (表 1) shRNA シーケンス上記プロトコルを次のテト pLKO puro 発現ベクターにクローニングを行った.HT 1080 線維肉腫細胞株が生成された構造安定発現し、細胞は 3 日間のドキシサイクリンで治療されました。Pai-1 の式はウエスタンブロット(図 2 aによって確認された)、デンシトメトリーによるパイ 1 とチューブリンに対応するバンドの強度を分析しました。テトラサイクリン調節をトランスフェクトした最も効果的な KD シーケンス (shRNA 2)、さらに生成した MDA MB 231 上皮乳房腺癌細胞 (図 2 b) と HCT116 大腸癌細胞 (図 2) 安定を使用してpL...

このプロトコルは、単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の募集に腫瘍細胞由来タンパク質の役割を研究するため特に癌細胞とその後続の使用で機能するテトにシステムを設定するためのスキームとして機能します。

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

このプロトコルの全体的なものは、癌細胞における遺伝子発現の条件付きノックダウンを利用して、in vitroで腫瘍微小環境への単球およびマクロファージの動員を研究することです。この方法は、がん細胞と免疫系の細胞との間のクロスストックの性質に関する腫瘍微小環境分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、ここで使用されるシステムではシングルベクタークローニングが必要であり、複数のクローンを迅速に生成でき、厚さが非常に低いことです。また、抗体と直接接触することなくヒト単球を精製する方法も示されており、偶発的な活性化を回避しながら、ヒト単球の95%以上の純粋な集団をもたらします。ウイルス粒子を産生するには、HEK-293細胞の70%コンフルエントな150mm皿に、25 μgのpLKO-tet-on shRNA、25 μgのpsPAXパッケージングプラスミド、および5 μgのエンベロープ発現プラスミドpMD2をトランスフェクションします。Gは、標準プロトコルに従ってトランスフェクション試薬を使用します。150ミリ皿にミックスを加えます。翌日、培地を10ミリモルの酪酸ナトリウムと20ミリモルのHEPESを補充したDMEMに変更することにより、細胞内でレンチウイルス産生を誘導します。摂氏37度と二酸化炭素5%で8時間培養します。8時間後、細胞をPBSで洗浄し、20ミリモルのHEPESを含み、酪酸ナトリウムを含まない25ミリリットルの新鮮なDMEM培地を追加します。48時間インキュベートした後、ウイルス含有培地をピペットで慎重に回収します。安定した細胞株を生成するには、HCT-116結腸癌細胞とMDA-MB-231乳癌細胞を12ウェルプレートとウェルあたり50, 000細胞に播種することから始めます。摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。細胞が60〜70%コンフルエントになったら、細胞をPBSで洗浄し、各ウェルに1ミリリットルのウイルス含有培地を加えます。翌日、ウイルス含有培地を吸引して慎重に取り除きます。次に、PBSで細胞を洗浄した後、テトラサイクリンフリーのFBSを含む培地を追加します。72時間後、前と同じように細胞を洗浄し、ウイルストランスフェクト細胞の選択のために1ミリリットルあたり1マイクログラムのピューロマイシンを補充した培地を追加します。ピューロマイシンの存在下で3〜14日間細胞を培養することにより、ウイルス形質導入細胞を選択します。ウイルス形質導入細胞を有する細胞内のピューロマイシンによるウェルの部分的な死滅を観察します。形質導入されていない細胞は、ピューロマイシンの存在下では増殖しません。これらの制御細胞が死滅したら、抗生物質の存在下で条件付き制御細胞株の培養を2週間続けて、条件付き制御細胞株を作製します。ピューロマイシン耐性HCT-116結腸がん細胞とMDA-MB-231乳がん細胞の条件付きノックダウンの有効性を検証するには、濃度の異なるドキシサイクリンを添加した培地を添加し、細胞を72時間培養します。細胞ライセートを調製した後、ウェスタンブロット分析によりノックダウンのレベルを確認します。PAI-1のレベルを以下に示します。末梢血単球を単離するには、まず15ミリリットルの密度勾配溶液を含む3本の50ミリリットルチューブを調製します。次に、重力流に設定されたピペットコントローラーを使用して、希釈した血液30ミリリットルを密度勾配溶液の上にゆっくりと重ねます。400 gのスイングローターで室温で25分間中断せずに遠心分離します。遠心分離後、最上層を廃棄し、末梢血単核細胞を含む中間層を新鮮な50ミリリットルチューブに移し、FBSを添加したPBSを最大50ミリリットルまで追加します。120 gで室温で10分間遠心分離します。スピン後、含まれている血小板含有上清を取り除きます。最終的な遠心分離と収集に続いて、ペレットを50ミリリットルのFBS補充PBSに再懸濁し、血球計算盤を使用して末梢血単核細胞をカウントします。細胞を120gで遠心分離した後、1ミリモルEDTAを含むFBS添加PBSにペレットを再懸濁し、最終濃度5000万細胞/ミリリットルまで戻します。次に、細胞懸濁液および混合物の各ミリリットルに対して50マイクロリットルのネガティブセレクション抗体カクテルを添加することにより、単球の濃縮を開始する。室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、ミリリットルあたり50マイクロリットルの磁気ビーズを加え、さらに10分間混合してインキュベートします。次に、最大25ミリリットルのFBSおよびEDTAを含むPBSを追加し、50ミリリットルのチューブを収容できる磁石に末梢血単核混合物を置きます。室温で10分間インキュベートした後、磁気ビーズはチューブの壁に付着し、非単球細胞を溶液から隔離します。25ミリリットルのピペットを使用して、ピペットでチューブの側面に触れないように注意しながら、単球を含む溶液をチューブから取り出します。遠心分離して上清を除去した後、単球を含むペレットを10%TETフリーのFBSと1%のペン連鎖球菌を含むRPMI培地に再懸濁します。アッセイを開始するには、24ウェルプレートのウェルに0.5ミリリットルの容量で40, 000個のHCT-116またはMDA-MB-231細胞を三重に播種します。翌日、ウェルにフィルターを追加します。次に、0.3ミリリットルの容量で8,000個の単球を、癌細胞の上部に配置されたBSA処理多孔質膜インサートにプレートし、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。48時間後にインサートを回収します。余分な培地を振り落とし、綿の先端のアプリケーターで内面を正確にスワイプして、移動しなかった細胞を取り除きます。インサートの外側をWright-Gimsa法で染色します。移行したマクロファージを上にしてフィルターをマウントした後、20倍対物レンズを備えた光学顕微鏡を使用してスライドをイメージングします。フィルターごとに 9 つのフィールドの写真を撮り、すべてのフィールドで移行したマクロファージをカウントします。Boyden Chamber Assayは、単球のがん細胞への移動を定量化するために使用されました。MDA-MB-231乳がん細胞の存在下では、PAI-1をダウンレギュレーションするために共培養にドキシサイクリンを添加した後、単球の移動が33%阻害されました。この単球遊走の阻害は、HCT-116結腸癌細胞の存在下でより顕著であり、ドキシサイクリン投与によるPAI-1のノックダウンにより単球遊走が74%減少し、ドキシサイクリンで治療された癌細胞の条件培地を化学誘引剤の供給源としてウェルの底に置いたときに同様の結果が観察されました。このビデオを見れば、ヒトがん細胞株の遺伝子発現ノックダウンに機能的なテットオンシステムを使用して、がん由来の分泌タンパク質PAI-1のヒト単球に対する化学誘引効果を研究する方法についてよく理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

ここで前の活性化 cd8 陽性の細胞毒性を調査するプロトコルについて述べるリアルタイム顕微鏡を介してアポトーシスがん細胞を検出することにより癌細胞に対して細胞の+ T。このプロトコルは、骨髄細胞による T 細胞抑制の背後にあるメカニズムを調査し、免疫抑制の骨髄系細胞の封鎖を介してT...

CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

ここでは、マウスモデルにおける血液単球の化学的活性を定量化し、血液単球に対する栄養、薬理学的および遺伝的介入の影響を評価し、マクロファージ由来の血液単球を特徴付けるプロトコルを提示する。単球化学集性タンパク質-1(MCP-1)装填系地下膜由来ゲルプラグを用いてマウスモデルを用いる。...

生体内における単球血球活性の定量化と血液単球由来マクロファージの特性化

この記事は、マクロファージを引き付けるために腫瘍細胞から条件付き培地の能力を評価するのに有用なインビトロアッセイを表す。...

腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ

生体内でのマクロファージ募集に対するケモカインの効果を試験するために、その位置ハイブリダイゼーション中のマウント全体を使用してケモカインの異所性発現を検出し、免疫染色を用いてマクロファージの標識を行った。ライブイメージングは、マクロファージ移行のリアルタイム観察に使用されました。...

生体内でのマクロファージ募集をテストするための異所性ケモカイン発現モデル

ここでは、腫瘍細胞が免疫応答を抑制するために使用する非接触パラクリンシグナル伝達の研究を容易にするために透過性膜支持体を用いる方法を提示する。このシステムは、マクロファージ活性化を減衰させる腫瘍分泌因子の役割を研究することに適している。...

透過性膜支持体との共培養を用いたマクロファージ活性化に及ぼす腫瘍分泌パラクリンリガンドの効果の研究

癌は、異なる器官に転移する能力のために致死的な病気である。様々な治療条件下で癌細胞が移行し、侵入する能力を決定することは、治療戦略を評価する上で極めて重要である。このプロトコルは、神経膠芽腫癌細胞株のリアルタイム転移能力を評価する方法を提示する。...

がん細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースリアルタイム測定

このプロトコルは、蛍光レポーターと細胞分類を使用して、マクロファージおよびT細胞株におけるノックイン実験を簡素化します。これらの単純なノックイン実験、すなわちCRISPR/Cas9-およびDsRed2発現プラスミドと、免疫細胞内の Rosa26...

CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

この記事では、メラノーマ転移の新規候補メディエーターを試験するために使用される技術のワークフローとその作用機序について説明します。...

メラノーマ転移の新規メディエーターの同定のための堅牢な発見プラットフォーム

ここでは、3次元(3D)コラーゲンIマトリックス中の初代ヒト単球由来マクロファージと腫瘍スフェロイドとの相互作用を調査するためのプロトコルを提示し、微小環境の可溶性および物理的特性が細胞浸潤に与える影響を比較する可能性を示します。...

マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

ヒトCARTと骨髄細胞の間の相互作用を研究するために利用できる異種移植モデルが限られていることを考慮して、CART細胞に対するヒトマクロファージの影響を理解するために、 in vitro および in vivo...

骨髄細胞とCAR T細胞間の相互作用のin vitroおよびin vivoの研究

学ぼう、Tet-ONシステムを用いた遺伝子発現の条件付きノックダウン法で、がん細胞由来タンパク質が単球・マクロファージを腫瘍微小環境に誘引するメカニズムを解明する方法です。抗体非接触で95%以上の純度でヒト単球を精製し、がん免疫相互作用の研究に活用できます。

単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の採用を検討する癌細胞株における遺伝子発現の条件付きのノックダウン

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