Name: 作製と内皮下電気抵抗を直接定量化する統合型電極を用いたオンチップ器官システムの検証 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶ、統合型電極を用いたオンチップ器官システムの作製と内皮下電気抵抗（TEER）測定法。血脳関モデルでバリア機能を直接定量化し、創薬や個別化医療への応用が期待されます。

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我々 は感謝して有意義な議論と支援のデータ表現とカビや脊髄ブロンクホールスト作製のヨハン · ボーマーを認めます。
この研究によって資金が供給された: 特任医工業マイクロ デバイスの l. i. Segerink、ミラ トエンテ大学医用生体工学技術研究臓器にチップ ミラ研究所西暦ファンデルメール トエンテ大学医用生体工学技術研究特任ERC 助成金 A. ・ ヴァン ・ デン ・ ベルク (グラント号 669768) に高度な VESCEL。

1。 臓器のオンチップ デバイスの作製 <ol><li>標準フォトリソグラフィの技術を用いて作製したチャネルの設計と金型の PDMS レプリカを作成、マイクロ流体チップの PDMS 部品を入手。
	<ol><li>重さ約 27 g PDMS ベース エージェントと 2.7 g 硬化剤; 質量比が 10:1 にする必要があります。これは 3 mm 厚 PDMS スラブ直径 130 mm (5 インチ) の金型に適しています。これらのコンポーネントを徹底的にミックスします</li>。
		<li>空気の泡を削除する約 45 分の乾燥器で混合物をドガします</li>。
		<li>一方、PDMS の液体混合物の金型の周り明確なテープを貼り付けることにより金型を準備または適しているウェーハ ホルダーで金型を配置します</li>。
		<li>は、金型に脱 PDMS の混合物を注ぐ。かどうか泡残った PDMS 混合物、金型表面の空気ドガそれ再度 30 分約</li>
		<li>4h クールダウンできるように 60 ° C のオーブンで PDMS 混合物を治すです</li>。
		<li>クロスフロー フードで金型から硬化 PDMS を引く; 金型は多くの PDMS のレプリカを作るためすぐに再利用できます</li>。
		<li>独立した上部と下部チップ部品、PDMS のカットラインを使用して切り PDMS レプリカ</li>。
		<li>は、フォーム入口および出口に直径 1 mm のシャープな生検パンチを使用して最高の部分に 4 つの穴をパンチします。内側からパンチ チップの収集から PDMS の破片を防ぐために外に。ほこりに対してそれらを保護するために明確なテープでチップ部品をカバーします</li>。
		<li>Transwell 挿入からポリカーボネート膜を約 3 × 3 mm の正方形にカット 2.</li>
	</ol></li> <li>多孔質膜と接続した 2 層デバイスを組み立てるために 2 つの PDMS 部分の間に液洩れのない多孔質膜アセンブルします 。
	注: このプロトコルは Griep ら から適応です。 19 岡 ら。 26 <ol><li>準備 PDMS ベース エージェント、0.07 g 硬化剤およびトルエンの 540 μ L の 0.7 g を用いたポリジメチルシロキサン/トルエン モルタル重量比 5:3 の結果します。渦モルタル徹底的にします</li>。
		<li>60 1500 rpm でガラス基板上にモルタルのスピン コート 200 μ s (1000 rpm/s でランプアップ) モルタルの薄い、均一層を取得する</li>。
		<li>は、底の部分とインク ローラーでチップの上の部分に coverslip からモルタルの薄層を転送します。オーブン皿に底の部分を配置します</li>。
		<li>ピンセットのセット スピンコートしてからモルタルに膜の端を浸し、慎重に下の部分の真ん中に配置</li>
		<li>慎重に配置に注意を払いながら下部の上の部分を配置します 。
		注: はチップに圧力をかけないし、モルタルのチャンネルを入力し、膜の目詰まりを防ぐために底の部分を上の部分とスライドしてください</li>。
		<li>チップを入力からほこりを防ぐためし、3 h の 60 ° C で焼くのため、明確なテープでチップ入り江をカバー</li>
	</ol></li> <li>サイド チャンネルに電極を統合します 。
	注: このプロトコルは Griep ら から適応です。 19 および Douville ら。 18 <ol><li>30 分すすぎ水とエタノールとアセトンでそれらを沈める部分の約 2 cm クリーンに白金線をカット乾燥させてと。</li>。
		<li>クロスフロー フードでプラスチックの皿にチップを置きます。4 白金線をピンセットのペアを使用してチップの電極のチャネルに挿入し、後続の手順で皿を固定するプラスチックの皿にそれらを曲げます。過去の T 型チャネルのジャンクション文化チャネルに mm 線 0.7 1 挿入します</li>。
		<li>電極チャネルの入り口で UV 硬化型接着剤の適用ドロップと毛管力によって電極のまわりのチャネルを埋めるために接着剤を許可します</li>。
		電極のチャネルの端に達すると UV 硬化接着剤で <li>を切り替える 。
		注意:これはあなたの目を害する可能性がありますように UV 光源を見ていない</li>。
		<li>は、2 液エポキシ接着剤でプラスチックの皿 4 つの統合された電極をじっと見つめます。これにより、チップから電極を引っ張る危険なし測定中に電極の取扱いが簡単です</li>。
		<li>は明確なテープでチップをカバーし、2 h. を冷やすのため、使用するまでホコリを格納できるようにするための 60 ° C で焼きます。彼らがすることができますこの方法で 1 ヶ月ために安全に格納されています</li>。
	</ol></li></ol> 2。オンチップ脳由来血管内皮細胞の培養 <ol><li>コート細胞接着を促進するチップ。
	リン酸 <ol><li>両方のチャネルは、生理食塩水 (PBS) 試薬を導入する前にそれらをウェットにバッファリングされます。チェック顕微鏡下である場合はチャネルの空気の泡。もしそうなら、余分な PBS のフラッシュでそれらを削除します</li>。
		<li>は、PBS で 20 μ G/ml 人間フィブロネクチンの 30 μ L で両方のチャンネルをご記入ください。37 ° C で 3 時間インキュベートします。空気の泡をチェックし、必要な場合、フラッシュ PBS のチャンネルとフィブロネクチン溶液で詰め替えします</li>。
		<li>内皮細胞成長培地でチップをフラッシュし 37 ° C で 5% CO 2 2 h. のための定温器にそれらをインキュベート</li>
		<li>は、チャネル内の流体と直接接触が電極のすべてことを確認する手順 3 で説明されているように空白チップ TEER を測定します。典型的な TEER 値は、空のチップ 0 1 Ω cm 2.</li>
	</ol></li> <li>最上位のチャネルに細胞を播きます。
	<ol><li>人間の脳微小血管内皮細胞 (hCMEC/D3) のコンフルエント単層培養培地培養用フラスコ (75 cm 2 の文化圏) からを削除します</li>。
		<li>は、PBS のセルを洗浄します。0.05% トリプシン-EDTA の 2 mL を追加し、37 ° C、5% CO 2 で細胞を培養用フラスコからデタッチまで 2-5 分間インキュベートします</li>。
		<li>20% 牛胎児血清 (FBS) 添加培養液中のトリプシンを非アクティブ化します。セルをカウントし、中断のセルの合計数を計算します</li>。
		<li>一方、5 分 390 x g で hCMEC/D3 細胞を遠心し、上清を除去</li>。
		<li>は、内皮増殖中 (EGM 2) 5 x 10 6 セル/mL の濃度に到達するための適切な量の細胞ペレットを再懸濁します。これは、結果, 播種密度が 2 x 10 5 セル/cm 2 チップで</li>。
		<li>ゆっくり最上位チャネルに 30 μ L よく混合細胞懸濁液をピペットし、まだ圧力を発揮しながら流暢な動きで入口からピペットを削除します</li>。
		<li>は、顕微鏡下で播種密度を確認します。最上位チャネル中の細胞の均一な分布を達成する必要があります</li>。
		<li>少なくとも 1 h. のための 37 ° C および 5% の CO 2 でチップが内皮細胞培養培地と非添付セルを洗い流す加温します</li>。
	</ol></li> <li>チップの内皮文化を維持します。
	<ol><li>2 回/日、入り江の貯蔵所として培地充てんピペット チップを挿入し、重力駆動流によるチップ内媒体を交換します 。
		メモ: 内壁を入力し、細胞層を破壊するから空気の泡を避けるためには、入口に先端を挿入する前にピペット チップとチップの上に流体と流体流体の接触することを確認してください。これで小さなドロップを追加することによって促進することができますで/ピペット挿入前にアウトレット</li>。
		<li>もチャンネルが乾燥するを防ぐために売店でピペット先端タンクを追加します</li>。
		<li>37 ° C、5% CO 2 でチップをインキュベートします</li>。
	</ol></li></ol> 3。オンチップ TEER 測定 <ol><li>の設定日e TEER 測定装置、ファン ・ デル ・ ヘルム ら で指定されたロックイン増幅器とプローブ ケーブルの回路から成る。 16 また、potentiostats またはインピー ダンス ・ アナライザー、また測定に適してこれらインピー ダンスに基づく TEER</li>。
	<li>インキュベーターからチップを取り出して電極チップ外ブリッジを防ぐために電極の周りのプラスチックの皿から任意の流体で削除、少なくとも 10 分間部屋の温度に達することができます</li>。
	<li>は、インピー ダンス スペクトルが予想される大きさと形状、TEER 測定を検証する徒歩 5-10 分チェックでチップ当たり 6 のインピー ダンス スペクトルに終って 2 つの電極の組み合わせごとに 1 MHz から 200 Hz インピー ダンス スペクトルを取る結果のセクションで説明します</li>。
	<li>測定を終えた後 37 ° C、5% CO 2 インキュベーターにチップを置く</li>。
	<li>は、正規化された TEER 値に到着する得られたインピー ダンス スペクトルを処理します。
	<ol><li>取得測定抵抗 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq1.jpg"> 電極間 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq2.jpg"> と<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq3.jpg">、 図 2 b と D、対応するインピー ダンス スペクトルで 10 kHz で抵抗高原から示される</li>。
		<li>計算する一度に 1 つのチップに対応する六つの測定抵抗を用いる TEER ポイント 図 2 16 の式を使用して: 
		<img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq20.jpg"> この式の <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq4.jpg">、抵抗を測定した、文化圏は、&lt; img alt ="式 5"src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg"/&gt; 細胞のバリアと、膜の抵抗は、<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq6.jpg">、<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq7.jpg">、<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq8.jpg">、<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq9.jpg">、抵抗は、細胞のバリアを介して測定値と <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq10.jpg"> と <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq11.jpg"> で測定される抵抗値、ストレート チャンネル。 16 式は 図 2 に示す等価回路に由来します</li>。
	</ol></li> <li>時間で、TEER の開発を取得するすべての時点で TEER から空白 TEER を減算します</li></ol>。

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

本稿では、オルガンのオンチップ デバイスの技術とデバイスで培養した細胞壁の内皮下電気抵抗 (TEER) の直接定量が発表されました。クリーン ルーム内機器と 4 つの電極を用いた定量 TEER なし電極の統合の提案手法は、マイクロ流路の 2 つのコンパートメントを持つ任意の臓器のオンチップ デバイスに適用されます。チップ レイアウトとジオメトリは、4 つの電極が 2 つの区画に区切られている限り、想定実験の要件に合うように適応することができます。4 電極は、される六つの測定の間の場所に執着に既存のチップの入り江に便利な挿入もできます。液洩れのない接着工法は、PDMS/トルエンの比を変更することによって異なる膜とチャネル形状の最適化できます。高いトルエン含有モルタル26の薄いスピン コーティング層に結果し、PDMS の部分に浅く、狭いチャネルのより適切な場合があります。厚いモルタルで低いトルエン コンテンツ結果26層し、PDMS の部分の間の厚い膜を囲むより適切な場合があります。
図 2 aの回路インピー ダンス スペクトルおよび図 2 e および 2 fの実験的スペクトルに見られる、インピー ダンス測定電極中の界面における二重層容量に影響されます。マイクロ チャネルの内部電極のサイズが小さいため、TEER の定量化を複雑なインピー ダンス スペクトルにおける細胞壁の抵抗高原上二重層容量を支配できます。これを克服するために電極を挿入ことができます文化チャンネル固定の前にさらに。これは公開されている電極の表面積を増加同様二重層容量に拡大培養液とします。細胞壁の抵抗の高原はより簡単に認識し定量化することができますように、低い周波数に静電容量式の斜面のシフトでこの結果します。2 つの電極間の測定パスの抵抗がより小さくなる、これ、次の提示法 TEER 定量化を影響しません。
細胞壁を測定しながら余分な抵抗の高原を認識できないということです。これは、膜は細胞のバリアの周囲測定パスにつながる、モルタルで囲まれた不十分な場合など、2 つのチャネル間の流体接続の結果をすることができます。さらに、あります培養液の液滴によって電極が接続されている場合は、チップ外電気ブリッジです。これは一般的に低いインピー ダンス測定と組み合わせるし、培地のこの橋を削除することによって解決することができます。最後に、抵抗高原はありません、インピー ダンス測定は桁違いに予想よりも高い場合は、電気配線や電源接続の緩みが可能性があります。
BBB の分化と増加バリアの気密性を促進するために報告され、達成しにくい、生理学的なレベルでストレスをせん断する内皮細胞を公開することによって、将来、現在チップに BBB の生理学的な関連性を増やすことができます。従来の in vitroモデル。29また、提示デバイスの下部のチャンネルは、脳由来細胞、血管内皮細胞と共培養するのに適切なコンパートメントを提供します。これはバリア機能の増加が期待されるも、病理学的条件下での関連するセル型の間の複雑な相互作用の研究ができます。29
結論としては、この資料に記載される器官のオンチップ デバイス標準実験装置を使用して作製することができ、調査セルの外観検査を阻害しない 4 つの統合された電極を用いた直接 TEER 測定を提供するために示されています。レイヤー。このチップで BBB を模倣して文化期、TEER の監視臓器システムオン チップ フィールドでこのデバイスの適用性を示した。(バリア) の他の臓器のホストは、このチップを他の関連の細胞型を含めることによってまねることができます。さらに、デバイスやシステム間で比較できるように、再現性の高い、有意義な TEER 値に到着する他 2 つのコンパートメントに基づく臓器のオンチップ デバイスで TEER の測定方法を簡単に適用できます。

臓器にチップは新しい新興かつ有望なクラスの in vitro組織モデル。1これらのモデルでは細胞、培養それらの細胞の生理学的な微小環境を模倣するように設計されているマイクロ流体デバイスの内部。1,2その結果、それらの細胞のより現実的な生理学的または病理学的行動よりもシンプルなデザインと基本的な機能の従来の in vitroモデルから予想されることができます。3,5,6また、臓器にチップは体内のモデルよりもより良い制御環境を提供、人間生理学および病理学を忠実に再現する人間の起源から健康と病気の組織を組み込むことができます。チップ (チップ上の BBBs) 血液-脳障壁の開発の最近要約進歩を示すフィールドが進む迅速に動いています。7
臓器システムオン チップの別の利点は、顕微鏡、オンラインの生化学的解析と統合センサー デバイス内培養組織のリアルタイムおよび継続的な監視を有効にします。1,2たとえば、非侵襲的開発を監視するための強力な方法は、内皮や上皮電気抵抗 (TEER) 測定およびバリア形成の組織。8,9,10 TEER 電気抵抗細胞の境界を越えた、したがって関門の透過性を示す。10の器官のチップに 2 つの頂を表す、流路とそのバリア組織の基底外側コンパートメントを分離膜には一般的に細胞障壁、培養します。このようなチップの入口および 2 つのチャネルの出口に挿入された電極との TEER 測定を便利に実施できます。3,4,11,12,13,14,15ただし、手動で挿入し、電極の再挿入簡単に結果、配置エラー、従って例えばとして測定の抵抗の変化でマイクロ チャネルを介した長いまたは短いパスの抵抗性の差異重要なと比較される細胞壁の抵抗。16再挿入エラーを避けるためには、統合された電極を持つデバイスが提案されています。ただし、これらの統合された電極のほとんど培養17,18,19,20,21を検査する際にビューをブロックやを必要とする特殊な作製するプロセスのクリーン ルーム。17,22
まず以前の出版物、16に適用し、文書に記載されている臓器のオンチップ デバイスは、測定細胞層とを容易に作製に関する可視性と統合された電極の安定性を兼ね備えています。デザイン、このチップの作製は、図 1に描かれています。一言で言えば、このデバイスはポリジメチルシロキサン (PDMS) の 2 つの部分で構成されています一緒に結合しているチャネル出版社と 0.4 とポリカーボネート膜と液洩れのない μ m 孔間に。4 つの白金線電極を挿入し、硬化を所定の位置に固定の文化圏の外によく接着します。すべての製作手順は、一般的な実験装置、クリーン ルーム環境を必要とせずに実施できます。この上に、六つのインピー ダンス測定を行うことができますマイクロ流路断面に至るまでとの影響を最小限に抑えるための抵抗の独立した測定 TEER の直接分離ができるこれらの 4 つの電極を使用して(再) 挿入エラーなどシステムの非生物学的変化。16
血液脳関門 (BBB) は、このチップでレプリケートされたこのデバイスと直接 TEER 測定の有効性を示す。この生物学的障壁から成っている専門にされた血管内皮細胞と血液と脳の恒常性を提供するために脳の間の輸送を調節します。23,24 BBB を模倣するには、マイクロ流体デバイスの最上位のチャネルは (親切提供される博士 p. o. によって hCMEC/D3 細胞ラインから人間の脳微小血管内皮細胞が並んでいたCouraud、INSERM パリ, フランス).25 , 提案手法が、ただしより一般的に 2 つのコンパートメントを持つ任意の臓器のオンチップ デバイスに適用可能な簡単に使用して直接 TEER 定量を有効にする統合電極。
この原稿の最初統合された電極を用いた臓器のオンチップ デバイスの作製プロセスを説明です。次、シードのプロシージャおよびデバイス内脳血管内皮細胞の培養は、オンチップ TEER 測定だけでなく、説明です。[結果] セクションで、代表的な TEER 測定し、データ処理を明らかにしました。最後に、提示装置と TEER を監視する方法の有効性を示す、BBB-オン-チップ、3 日間、監視のバリア機能が表示されます。

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)ベース剤および硬化剤:シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>スコッチマジックテープ</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生検パンチ、直径1.0mm</td>インテグ<td>ラミルテックス</td><td>33-31AA-P / 25</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート膜、0.4&マイクロ;m孔径</td><td>コーニング</td><td>3401</td><td>トランズウェル文化インサートからカット</td></tr><tr><td>トルエン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>プラチナ ワイヤー、200 & マイクロ;m径</td><td>Alfa Aesar</td><td>10287</td><td></td></tr><tr><td>UV硬化型接着剤:Norland Optical Adhesive 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ接着剤:Loctite M-31 CL Hysol</td><td>Henkel</td><td>30673</td><td></td></tr><tr><td>hCMEC/D3細胞</td><td></td><td></td><td>ヒト脳微小血管内皮細胞株、P.-O博士のご厚意により提供されました。Couraud, INSERM, Paris, France</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血漿フィブロネクチン, 20 & micro;g/ml</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial growth medium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal wevine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Binder</td><td>9010-0190</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター:スピン150</td>ポ<td>ロス</td><td>SPIN150-NPP</td><td></td></tr><tr><td>UV光源、365 nm 5秒間、350 mW/cm2</td><td>自社</td><td></td><td>製造</td></tr><tr><td>遠心分離機:Allegra X-12R 遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベータ</td><td>ー バインダー</td><td>CB E2 150</td><td></td></tr><tr><td>Boxense</td><td>LocSense</td><td></td><td>ロックインアンプ、プローブケーブル回路付き、オンチップTEER測定に特化</td></tr></tbody></table>

作製と内皮下電気抵抗を直接定量化する統合型電極を用いたオンチップ器官システムの検証

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

モデル体外臓器システムオン チップ、マイクロ流体デバイス内部組織の (人間) の文化を含むが急速に新興に便利を提供する約束研究と人間の健康と病を研究するためのツール。オルガンのオンチップ デバイス内培養細胞層のバリア機能を特徴付けるためしばしば内皮または上皮電気抵抗 (TEER) が測定されます。このため、電極は通常電極のチップの挿入マニュアルで達成されるよりもより安定した測定を提供するために微細加工方法でチップに統合されます。ただし、これらの電極はよく研究細胞層の目視検査を妨げるまたは作製のための高価なクリーン ルーム工程を必要とします。これらの制限を克服するためには、ここで説明されているデバイスには置かれ、目視検査を可能に作る文化圏の外固定電極が 4 容易に統合が含まれています。元、TEER 直接分離できます、培地充てんマイクロ流路の抵抗の独立した六つの測定パスの抵抗を定量化することができます、これらの 4 つの電極を使用してください。血液脳関門は、このデバイスでレプリケートされた、その TEER がデバイスへの適用性を表示する監視だった。このチップ、電極が統合、TEER 定量法は、臓器-システムオン チップ、他の器官を模倣するまたは、既存の器官のオンチップ システムに組み込むことで一般的に適用されます。

電気インピー ダンス分光セル (実線) のないチップと細胞壁 (破線) を通しての回路図の結果は、図 2 aに表示されます。4 つの主な領域を識別できる、それぞれが特定の電気コンポーネントによって支配されます。二重層キャパシタ電極文化中界面を支配する約 1 kHz 以下、インピー ダンスの振幅および位相-90 ° に近づいて負の傾きによって特徴付けられます。二重層容量が支配する頻度は、培養液にさらされる電極面積によって異なります。チャネルの長さ、断面積および内部によって、マイクロ チャンネル内培養液の抵抗に対応する 0 ° に近い位相シフトを伴う (セル) なし 1 kHz または (セル) を 100 kHz 上抵抗の高原、気孔率と厚さに応じて膜。細胞壁を測定、相図の局所最大値だけでなく、1 と 10 の kHz の間の余分な抵抗高原が見えます。この地域は、インピー ダンスの結果の明確な増加として、TEER の定量に対する重要性の細胞測定パスに存在しており、したがって「関心領域」と呼びます。10 と 100 kHz の間の余分な斜面は、絶縁性の脂質二分子膜から発生し、細胞層の総面積に依存する細胞障壁キャパシタンスに対応します。27インピー ダンスの大きさと同様に、これらの地域の境界検討されているシステムに依存し、他のもの、チャンネルの寸法、培養液の電気伝導度、電極位置とセル型の間で、変更します。理論とバリア形成における電気インピー ダンス分光学の実践の詳細読み組織・ ベンソンらによるレビュー記事をお勧めします。28
それぞれブランク チップと図 2 e および 2 f、hCMEC/D3 脳血管内皮細胞層を持つチップの両方に対して TEER 測定の代表的なデータを示します。一言で言えば、インピー ダンス分光法は 4 つの電極を持つ六つの測定を使用して実行された: 細胞培養培地充てんチャネル (実線) を介して 2 つの測定と膜と同様、チャネル 4 の測定と - - 存在する場合、細胞壁 (破線)。これら六つの測定パスは、図 2 b断面図 (図 2)、上面図 (図 2 D) に由来するの等価抵抗回路で識別できます。ブランク チップ測定 (図 2 e) は、図 2 aに示すように細胞なしインピー ダンス スペクトルの典型的な形を表示します。図 2 aのセルと典型的なインピー ダンス スペクトルのように細胞壁 (図 2 fの破線) を測定。インピー ダンスの大きさと位相の両方が増加をシフト注 1 MHz へ。これは高周波測定セットアップの典型的な応答で、実験の原産ではないです。
まずこれらのインピー ダンス スペクトルを用いた TEER を決定するには、は測定チップ抵抗決定されます細胞層、チャンネル、膜の総抵抗であります。このため、関心領域で適切な読み出し周波数選ばれた、セルとセルのない 0 ° の位相に近い位相プロットで極大である: 10 kHz。10 kHz で六つの測定された抵抗と 4 つの電極で測定した、TEER が直接式を使って計算図 2 fに。
提示装置が臓器にチップ TEER に好適であることを示す、BBB をチップ内レプリケートおよびその TEER が文化の 3 日の間に監視されました。図 3 a 22 ± 1.3 Ω cm2、高原の結果 4 BBBs のチップ、平均 (SEM) の平均 TEER ± 標準誤差が表示されますでの文献で報告されたこの細胞ラインの TEER に匹敵するであります。29また、実験が終了し、核の蛍光染色後、それ見ることができる脳血管内皮にデバイス (図 3 b) 内連続単分子膜が形成されています。タイト結合蛋白精巣毛細血管-1 (ZO-1) 免疫蛍光染色, 脳血管内皮細胞、BBB に固有表現を維持し、タイトな複合体を形成します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig1.jpg"> 
図 1: デザインと統合された電極を用いた臓器のオンチップ デバイスの組立。 
(A) (TC) の一番上のチャネル、膜 (M) 下部下部チャネル (BC) と PDMS 部分と PDMS 上部から成るマイクロ流体チップの分解図。4 つの白金線電極 (E1 4) 挿入され、側のチャネルに固定します。最上位のチャネルの膜の上に、hCMEC/D3 脳血管内皮細胞培養 BBB を複製します。(B)組み立てチップ プラスチックの皿に固定をします。エルゼビアから転載との適応アクセス許可。16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig2.jpg"> 
図 2: 代表的なインピー ダンス データと TEER の決意。 
(A)回路インピー ダンス スペクトルを示すインピー ダンスの大きさ (Ω) と周波数 (Hz)、電気インピー ダンス分光チップ (実線) のセルとセル (破線) の典型的な対位相シフト (°)。4 つの主な地域が集まって、それぞれがによって支配される: 細胞膜容量セル バリアー抵抗、培養液抵抗電極二重層容量。「関心領域」は、細胞層の貢献が定量化 (赤矢印) をすることできますを示します。(B)最上位チャネル抵抗 R1 R3、下部チャネル抵抗 R2と R4と膜および EC バリア抵抗 Rmを示す、チップの等価抵抗回路。(C)模式断面最上位チャネルの培養血管内皮細胞 (EC) を示します。(D) BBB の概略平面図チップ、0.25 mm2のインピー ダンスを測定する文化圏と電極の構成を示します。(E)空白チップの代表的なインピー ダンス スペクトルは細胞培養液でいっぱい。(F)代表的なインピー ダンス スペクトルを hCMEC/D3 のチップの脳血管内皮細胞培養は、3 日間。4 電極のすべての六つの組み合わせの間の測定の抵抗から TEER を計算する(G)式。エルゼビアから転載との適応アクセス許可。16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig2large.jpg" target="_blank">大きい ver を表示するのにはここをクリックして下さい</a>この図のイオン。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig3.jpg"> 
図 3: 代表 TEER BBB のオンチップ化 
(A)平均 TEER ± 標準誤差 4 BBBs システムオン チップ、3 日間の培養期間中に 22 ± 1.3 Ω cm2 (平均 ± SEM) にプラトーに達することの意味 (SEM)。比較、ブランク チップのデータが含まれます、セルと変化とチップの TEER 値と比較して同じ期間に限界の変化と 0 Ω cm2からの偏差を示します。(B)ステンド グラスの核の蛍光顕微鏡には、内皮、PDMS とはめ込みで示される位置に膜の両方の連続的な単分子膜が明らかにしました。(C)蛍光抗体法では、精巣毛細血管-1 セル間 BBB 固有のタイトな接合が測定 TEER に上昇を与えることを示すタイト結合蛋白の存在を明らかにしました。エルゼビアから転載との適応アクセス許可。16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

この文書では、内皮下電気抵抗 (TEER) の直接定量の統合された電極を用いた臓器のオンチップ デバイスの作製について説明します。検証、このマイクロ流体デバイス内部の血液-脳関門をまねて、そのバリア機能をモニターしていた。電極の統合及び直接 TEER 定量化の提示方法は一般的に適用されます。

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

このビデオの全体的な目標は、経内皮または経上皮の電気抵抗測定、またはTEER測定用の電極を内蔵したマイクロ流体チップを製造および使用する方法を示すことです。これは、マイクロ流体チップの血液脳関門を使用して実証されています。この方法は、統合電極を使用して血液脳関門組織のバリア機能を直接測定できるようにすることで、Organs-on-Chipsの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。私たちの技術の主な利点は、電極をOrgan-on-Chipシステムに簡単に統合でき、その結果を異なるシステム間で比較できることです。この技術の意味は、健康と病気における血液脳関門機能の理解、創薬、個別化医療にまで及びます。この方法は、血液脳関門の機能に関する洞察を提供するために使用できますが、Lung-on-ChipやGut-on-Chipなどの他のOrgan-on-Chipシステムのコンテキストでも使用できます。この手順を開始するには、27グラムのPDMSベース剤と2.7グラムの硬化剤を完全に混合します。.次に、混合物をデシケーターで約45分間脱気し、気泡を取り除きます。その間、液体PDMS混合物用の金型を、金型の周りに透明なテープを貼り付けて準備するか、金型を適切なウェーハホルダーに入れます。脱気したPDMS混合物を金型に流し込みます。次に、PDMS混合物を摂氏60度のオーブンで4時間硬化させ、その後冷まします。クロスフローフードで、硬化したPDMSを金型から引き出します。PDMSの切断線を使用して、PDMSレプリカを別々の上部と下部の切りくず部品に切断します。その後、直径1mmのシャープな生検パンチを使用して上部に4つの穴を開け、入口と出口を形成します。PDMSの破片がチップに溜まるのを防ぐために、内側から外側にパンチします。次に、チップ部品をほこりから保護するために透明なテープで覆います。続いて、トランズウェルインサートからポリカーボネート膜を約3×3平方ミリメートルの正方形に切断します。その後、2つのPDMS部品の間に漏れのない多孔質膜を組み立て、多孔質膜とインターフェースされた2層デバイスを組み立てます。そのために、0.7グラムのPDMSベースエージェント、07グラムの硬化剤、および540マイクロリットルのトルエンを使用してPDMSトルエンモルタルを準備します。モルタルを徹底的に渦巻かせ、次に200マイクロリットルのモルタルを1500rpmのガラスカバースリップに60秒間スピンコートして、薄く均一なモルタルの層を取得します。次に、カバーガラスからインクローラーでチップの底部分にモルタルの薄い層を転写します。底部をオーブンで安全な皿に入れ、次に乳鉢をチップの上部に移します。ピンセットのセットで、膜の端をスピンコーティングされたモルタルに浸し、底部の中央に注意深く置きます。その後、位置合わせに注意しながら、上部を下部に慎重に配置します。チップ入口を透明なテープで覆い、チップにほこりが入らないようにし、摂氏60度で3時間焼きます。このステップでは、注意することが非常に重要です。モルタルがチャネルに入り込んでメンブレンを詰まらせるのを防ぐために、チップに圧力をかけたり、上部を下部の上にスライドさせたりしないでください。電極をサイドチャネルに一体化するには、プラチナ線を2cmの長さに切断します。次に、アセトンに30分間浸します。次に、水とエタノールですすぎ、乾燥させます。クロスフローフードで、プラスチック皿にチップを置きます。ピンセットを使用して4本の白金線をチップの電極チャネルに挿入し、プラスチック皿に曲げて、次のステップで皿に固定できるようにします。0.7〜1ミリメートルのワイヤーをT字型チャネル接合部を過ぎて培養チャネルに挿入します。その後、電極チャネル入口にUV硬化型接着剤を一滴塗布し、毛細管現象によって接着剤がチャネルに充填されるようにします。次に、UVのスイッチを入れ、接着剤が電極チャネルの端に達したときに接着剤を硬化させます。4つの統合電極を2液型エポキシ接着剤でプラスチック皿に固定しました。その後、チップを透明なテープで覆い、摂氏60度で2時間焼きます。冷まして、使用するまでほこりをかぶらないように保管してください。チップをコーティングして細胞の接着を促進するには、試薬を導入する前に、まず両方のチャネルにPBSを充填します。チャンネルに気泡がないか顕微鏡で確認してください。その場合は、追加のPBSで洗い流してそれらを取り除きます。次に、PBS中のヒトフィブロネクチン1ミリリットルあたり20マイクログラムの30マイクロリットルを両方のチャネルに充填します。摂氏37度で3時間インキュベートします。次に、チップを内皮増殖培地で洗い流し、摂氏37度で2時間インキュベートします。その後、ブランクチップのTEERを測定して、すべての電極がチャネル内の流体と直接接触していることを確認します。これを行うには、インキュベーターからチップを取り出し、少なくとも10分間室温に到達させます。電極の周りのプラスチック皿から液体を取り除き、チップの外側に電気ブリッジができないようにします。次に、2つの電極の組み合わせごとに200ヘルツから1メガヘルツのインピーダンススペクトルを取り、チップあたり5〜10分で6つのインピーダンススペクトルを取得し、そこからTEERを直接決定できます。インピーダンス スペクトルに、TEER 測定を検証するための予想される大きさと形状があるかどうかを確認します。次に、hcMEC/D3細胞のコンフルエント単層を含む培養フラスコから培地を取り出して、トップチャネルに着座する細胞懸濁液を準備します。その後、PBSで細胞を洗浄します。PBSを取り外し、次に05%トリプシンEDTAの2ミリリットルを追加し、細胞が培養フラスコから分離するまで摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。次に、20%のFBSを添加した培地でトリプシンを不活性化します。細胞を数え、懸濁液中の細胞の総数を計算します。その間、hcMEC/D3細胞を390倍gで5分間遠心分離します。その後、上清を取り除き、細胞ペレットを適切な量の内皮増殖培地に再懸濁して、チップ内の播種密度20万細胞/平方センチメートルに対応する500万細胞/ミリリットルの濃度になります。次に、よく混合された細胞懸濁液の30マイクロリットルをゆっくりと上部チャネルにピペットで移し、圧力をかけながら流暢な動きでピペットを入口から取り出します。顕微鏡で播種密度を確認します。トップチャネル全体に細胞が均一に分布するようにする必要があります。次に、チップを摂氏37度と二酸化炭素5%で少なくとも1時間インキュベートします。その後、付着していない細胞を内皮培養液で洗い流します。TEERは培養期間中監視されることに注意してください。これらは、セルなしチップとセルチップ上の電気インピーダンス分光法のインピーダンスの大きさと位相シフト対周波数を示す典型的な概略インピーダンススペクトルです。電極の二重層容量、培地耐性、細胞バリア抵抗、または細胞膜容量によって支配される4つの主要な領域があります。関心領域は、細胞層の寄与を定量化できる場所を示します。そして、これは、4つの電極の6つの組み合わせすべての間で測定された抵抗からTEERを計算する式です。ここに示されているのは、3日間の培養期間中のチップ上の4つのBBBの平均TEERであり、22±1.3Ω平方センチメートルのプラトーに達します。比較のために、ブランクチップのデータが含まれており、セル付きチップのTEER値の変動と比較して、同じ期間のゼロオーム平方センチメートルからのわずかな変動と偏差を示しています。染色された核の蛍光顕微鏡コピーにより、PDMSと挿入図に示されている位置にメンブレンの両方に連続した内皮の単層が明らかになりました。免疫蛍光法により、タイトジャンクションタンパク質zonula occludensの存在が明らかになり、細胞間のBBB特異的なタイトジャンクションが測定されたTEERを生じさせることを示しています。このビデオを見れば、Organs-on-ChipsのTEER測定のための電極内蔵チップの製造と使用について十分に理解できるはずです。この手法は、血液脳関門研究の分野で、例えばアルツハイマー病における直接送達および疾患特性を研究するために使用できます。この手順に続いて、ヒト由来の人工多能性幹細胞から分化した脳内皮のバリア機能も監視でき、個別化医療への応用が可能になります。

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Research

JoVE Journal

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