作製と内皮下電気抵抗を直接定量化する統合型電極を用いたオンチップ器官システムの検証

このビデオの全体的な目標は、経内皮または経上皮の電気抵抗測定、またはTEER測定用の電極を内蔵したマイクロ流体チップを製造および使用する方法を示すことです。これは、マイクロ流体チップの血液脳関門を使用して実証されています。この方法は、統合電極を使用して血液脳関門組織のバリア機能を直接測定できるようにすることで、Organs-on-Chipsの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

私たちの技術の主な利点は、電極をOrgan-on-Chipシステムに簡単に統合でき、その結果を異なるシステム間で比較できることです。この技術の意味は、健康と病気における血液脳関門機能の理解、創薬、個別化医療にまで及びます。この方法は、血液脳関門の機能に関する洞察を提供するために使用できますが、Lung-on-ChipやGut-on-Chipなどの他のOrgan-on-Chipシステムのコンテキストでも使用できます。

この手順を開始するには、27グラムのPDMSベース剤と2.7グラムの硬化剤を完全に混合します。.次に、混合物をデシケーターで約45分間脱気し、気泡を取り除きます。その間、液体PDMS混合物用の金型を、金型の周りに透明なテープを貼り付けて準備するか、金型を適切なウェーハホルダーに入れます。

脱気したPDMS混合物を金型に流し込みます。次に、PDMS混合物を摂氏60度のオーブンで4時間硬化させ、その後冷まします。クロスフローフードで、硬化したPDMSを金型から引き出します。

PDMSの切断線を使用して、PDMSレプリカを別々の上部と下部の切りくず部品に切断します。その後、直径1mmのシャープな生検パンチを使用して上部に4つの穴を開け、入口と出口を形成します。PDMSの破片がチップに溜まるのを防ぐために、内側から外側にパンチします。

次に、チップ部品をほこりから保護するために透明なテープで覆います。続いて、トランズウェルインサートからポリカーボネート膜を約3×3平方ミリメートルの正方形に切断します。その後、2つのPDMS部品の間に漏れのない多孔質膜を組み立て、多孔質膜とインターフェースされた2層デバイスを組み立てます。

そのために、0.7グラムのPDMSベースエージェント、07グラムの硬化剤、および540マイクロリットルのトルエンを使用してPDMSトルエンモルタルを準備します。モルタルを徹底的に渦巻かせ、次に200マイクロリットルのモルタルを1500rpmのガラスカバースリップに60秒間スピンコートして、薄く均一なモルタルの層を取得します。次に、カバーガラスからインクローラーでチップの底部分にモルタルの薄い層を転写します。

底部をオーブンで安全な皿に入れ、次に乳鉢をチップの上部に移します。ピンセットのセットで、膜の端をスピンコーティングされたモルタルに浸し、底部の中央に注意深く置きます。その後、位置合わせに注意しながら、上部を下部に慎重に配置します。

チップ入口を透明なテープで覆い、チップにほこりが入らないようにし、摂氏60度で3時間焼きます。このステップでは、注意することが非常に重要です。モルタルがチャネルに入り込んでメンブレンを詰まらせるのを防ぐために、チップに圧力をかけたり、上部を下部の上にスライドさせたりしないでください。

電極をサイドチャネルに一体化するには、プラチナ線を2cmの長さに切断します。次に、アセトンに30分間浸します。次に、水とエタノールですすぎ、乾燥させます。

クロスフローフードで、プラスチック皿にチップを置きます。ピンセットを使用して4本の白金線をチップの電極チャネルに挿入し、プラスチック皿に曲げて、次のステップで皿に固定できるようにします。0.7〜1ミリメートルのワイヤーをT字型チャネル接合部を過ぎて培養チャネルに挿入します。

その後、電極チャネル入口にUV硬化型接着剤を一滴塗布し、毛細管現象によって接着剤がチャネルに充填されるようにします。次に、UVのスイッチを入れ、接着剤が電極チャネルの端に達したときに接着剤を硬化させます。4つの統合電極を2液型エポキシ接着剤でプラスチック皿に固定しました。

その後、チップを透明なテープで覆い、摂氏60度で2時間焼きます。冷まして、使用するまでほこりをかぶらないように保管してください。チップをコーティングして細胞の接着を促進するには、試薬を導入する前に、まず両方のチャネルにPBSを充填します。

チャンネルに気泡がないか顕微鏡で確認してください。その場合は、追加のPBSで洗い流してそれらを取り除きます。次に、PBS中のヒトフィブロネクチン1ミリリットルあたり20マイクログラムの30マイクロリットルを両方のチャネルに充填します。

摂氏37度で3時間インキュベートします。次に、チップを内皮増殖培地で洗い流し、摂氏37度で2時間インキュベートします。その後、ブランクチップのTEERを測定して、すべての電極がチャネル内の流体と直接接触していることを確認します。

これを行うには、インキュベーターからチップを取り出し、少なくとも10分間室温に到達させます。電極の周りのプラスチック皿から液体を取り除き、チップの外側に電気ブリッジができないようにします。次に、2つの電極の組み合わせごとに200ヘルツから1メガヘルツのインピーダンススペクトルを取り、チップあたり5〜10分で6つのインピーダンススペクトルを取得し、そこからTEERを直接決定できます。

インピーダンス スペクトルに、TEER 測定を検証するための予想される大きさと形状があるかどうかを確認します。次に、hcMEC/D3細胞のコンフルエント単層を含む培養フラスコから培地を取り出して、トップチャネルに着座する細胞懸濁液を準備します。その後、PBSで細胞を洗浄します。

PBSを取り外し、次に05%トリプシンEDTAの2ミリリットルを追加し、細胞が培養フラスコから分離するまで摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。次に、20%のFBSを添加した培地でトリプシンを不活性化します。細胞を数え、懸濁液中の細胞の総数を計算します。

その間、hcMEC/D3細胞を390倍gで5分間遠心分離します。その後、上清を取り除き、細胞ペレットを適切な量の内皮増殖培地に再懸濁して、チップ内の播種密度20万細胞/平方センチメートルに対応する500万細胞/ミリリットルの濃度になります。次に、よく混合された細胞懸濁液の30マイクロリットルをゆっくりと上部チャネルにピペットで移し、圧力をかけながら流暢な動きでピペットを入口から取り出します。

顕微鏡で播種密度を確認します。トップチャネル全体に細胞が均一に分布するようにする必要があります。次に、チップを摂氏37度と二酸化炭素5%で少なくとも1時間インキュベー

その後、付着していない細胞を内皮培養液で洗い流します。TEERは培養期間中監視されることに注意してください。これらは、セルなしチップとセルチップ上の電気インピーダンス分光法のインピーダンスの大きさと位相シフト対周波数を示す典型的な概略インピーダンススペクトルです。

電極の二重層容量、培地耐性、細胞バリア抵抗、または細胞膜容量によって支配される4つの主要な領域があります。関心領域は、細胞層の寄与を定量化できる場所を示します。そして、これは、4つの電極の6つの組み合わせすべての間で測定された抵抗からTEERを計算する式です。

ここに示されているのは、3日間の培養期間中のチップ上の4つのBBBの平均TEERであり、22±1.3Ω平方センチメートルのプラトーに達します。比較のために、ブランクチップのデータが含まれており、セル付きチップのTEER値の変動と比較して、同じ期間のゼロオーム平方センチメートルからのわずかな変動と偏差を示しています。染色された核の蛍光顕微鏡コピーにより、PDMSと挿入図に示されている位置にメンブレンの両方に連続した内皮の単層が明らかになりました。

免疫蛍光法により、タイトジャンクションタンパク質zonula occludensの存在が明らかになり、細胞間のBBB特異的なタイトジャンクションが測定されたTEERを生じさせることを示しています。このビデオを見れば、Organs-on-ChipsのTEER測定のための電極内蔵チップの製造と使用について十分に理解できるはずです。この手法は、血液脳関門研究の分野で、例えばアルツハイマー病における直接送達および疾患特性を研究するために使用できます。

この手順に続いて、ヒト由来の人工多能性幹細胞から分化した脳内皮のバリア機能も監視でき、個別化医療への応用が可能になります。