蛍光顕微鏡による放射線誘発的なクローン細胞死のモードの評価のためのワンステップ プロトコル

このアッセイの全体的な目標は、DAPIで染色された核の特徴的な形態に基づいて、電離放射線によって誘発されるクローン形成細胞死の主要なモードを評価することです。この方法は、放射線生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この迅速でコスト効率の高い技術の主な利点は、電離放射線によって誘発されるクローン性細胞死の主要なモードを同時に評価できることです。

一般に、放射線生物学に不慣れな個人は、細胞死の各モードを評価するために異なるアッセイが必要であるため、放射線誘発性クローン形成細胞死の評価に苦労するでしょう。この方法のアイデアが最初に浮かんだのは、複数の細胞株と放射線量を使用して放射線誘発性クローン細胞死の大規模なスクリーニングを行ったときでした。この方法は放射線生物学に関する洞察を提供しますが、がんの化学療法など、他のシステムにも適用できます。

その手順を実演するのは、私たちの共同研究者である柴田淳です。まず、70%エタノールで湿らせたペーパータオルでメスを滅菌します。次に、メスを使用して、35mmの細胞培養皿にカバースリップを置きます。

カバースリップのある培養皿に、1ミリリットルの培地を加えます。次に、滅菌鉗子でカバースリップの中央をそっと保持し、培養培地を皿から完全に吸引します。次に、15ミリリットルチューブ内の培養培地に3ミリリットルの細胞懸濁液を調製します。

細胞懸濁液を培養皿に加えます。そして、摂氏37度、CO2 5%で一晩インキュベートします。細胞がカバースリップに付着し、生きていることを確認するには、倒立位相差顕微鏡で細胞を検査します。

次に、皿に6つの灰色のX線放射線を照射します。照射後、インキュベーター内で37°C、CO25%で72時間インキュベートします。次に、インキュベーターから細胞を取り出し、培養皿から培地を吸引します。

はさみを使用して、端から約5ミリメートルの1, 000マイクロリットルのマイクロピペットチップの先端を切り取ります。そして、それを使用して、培養皿に1ミリリットルの固定液を追加します。細胞への損傷を最小限に抑えるために、培養皿の壁に沿って固定溶液を塗布します。

次に、この培養皿を正方形の培養皿に移し、軽く振って、固定溶液をカバースリップ上に均一に分散させます。その後、皿を室温で10分間インキュベートします。皿から固定溶液を吸引します。

次に、皿の壁に沿って2ミリリットルのPBSを追加します。そして、PBSを吸引します。DAPI染色の準備として、スライドガラスに5マイクロリットルのDAPI染色試薬を加えます。

次に、メスを使用して皿からカバースリップを取り外します。そして、ペーパータオルでカバースリップの端に触れて、カバースリップの余分なPBSを排出します。次に、カバースリップを逆さまにしてスライドガラス上のDAPI染色試薬の滴に取り付け、細胞がDAPI染色試薬にさらされるようにします。

最後に、DAPIフィルターを搭載した蛍光顕微鏡で染色した細胞を観察します。細胞死の3つのモードのそれぞれにおける核形態が示されています。アポトーシス細胞は凝縮した核を有することが観察されます。

有糸分裂大惨事を受けている細胞の核には、複数の葉が観察されます。老化を受けている細胞は、特徴的な老化関連ヘテロクロマチン病巣を示すことが見られます。模擬放射線を照射した原子核と6つの灰色X線を照射した原子核との比較観察を示します。

丸はアポトーシスを起こしている核、矢印は有糸分裂の大惨事を起こしている核を示しています。照射を受けた約300個の原子核について、モックと比較して評価した結果を示します。6つの灰色のX線照射は、約25%でより頻繁に有糸分裂の大惨事を引き起こし、続いて約5%でアポトーシスを引き起こし、非常にまれな老化イベントを引き起こすことが見られます。

このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1時間で完了します。この手順を試みるときは、カバースリップに直接溶液を塗布して細胞を損傷しないように注意することが重要です。この手順に続いて、フローサイトメトリー解析や細胞死マーカータンパク質などの他の方法、および老化を評価するための老化関連β-ガラクトシダーゼ染色など、他の方法を実行して、クローン生成細胞死の各モードをさらに理解することができます。