次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

この技術の全体的な目標は、循環腫瘍または ctDNA の低頻度の変異を検出し、臨床医が腫瘍を診断し、治療に応答して腫瘍のダイナミクスを監視するための強力なツールを提供することです。ctDNAを検査する方法は、単一核型変異、挿入欠失、コピー数変異、構造変異など、患者がどのような種類の変異を持っているかという重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ctDNAの低頻度変異を正確に検出する高感度と特異性です。

手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるYuliang Yangです。まず、採取チューブに10ミリリットルの末梢血を採取し、チューブを6〜8回上下にゆっくりと反転させて内容物を混ぜます。血液サンプルは、摂氏6〜37度の採取チューブに最大72時間保存します。

収集チューブを室温で1,600倍gで10分間遠心分離します。次に、廃棄ピペットを使用して、上清または血漿をチューブから、ペレットを乱すことなく、適切にラベル付けされた4本のきれいな2ミリリットルの遠心分離管に移します。清潔な廃棄ピペットを使用して、1ミリリットルの細胞を2ミリリットルの適切にラベル付けされた遠心分離チューブに移します。

細胞をマイナス20°C以下で保存してから、ゲノムまたはgDNAを単離してください。次に、血漿を1,600倍gで摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、プラズマを適切にラベル付けしたきれいな遠心分離管にプラズマを移し、汚染を避けるために底部に約0.1ミリリットルの残留量を残します。

バフィーコートは、分離プロセス中にプラズマから避ける必要があります。そうしないと、細胞から抽出された大きなDNA断片がctDNAを希釈し、検査の感度に影響を与える可能性があります。市販のキットを使用して、製造元の指示に従って、採取した血漿の3ミリリットルからcfDNAを単離します。

次に、キットを使用して、製造元の指示に従って200マイクロリットルの白血球からgDNAを分離します。超音波処理によってgDNA制御サンプルを断片化するには、清潔な超音波処理チューブ内の100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーに1マイクログラムのgDNAサンプルを調製します。超音波処理プログラムを30秒オンと30秒オフに12サイクル、合計12分間設定します。

製品に200〜250の塩基対フラグメントが含まれていることを確認した後、すべてのフラグメンテーション製品を150マイクロリットルの磁気ビーズを含む新しい1.5ミリリットルチューブに移し、サンプルを5分間インキュベートして正しいフラグメントを選択します。次に、チューブを磁気ラックに30秒間置き、上清を取り除きます。次に、チューブをラックに置いたまま、新たに準備した80%エタノールを200マイクロリットル追加してビーズを洗います。

ビーズを30秒間インキュベートしてから上清を取り除き、洗浄を繰り返します。ビードを風乾させるために、蓋を開けたままチューブをラックに置いておきます。次に、32マイクロリットルの10ミリモルTris-HCLをビーズに添加してDNA断片を溶出します。

製造元の指示に従って最終調製反応を行うには、滅菌ヌクレアーゼフリーチューブに、7マイクロリットルの反応バッファー、3マイクロリットルの酵素混合物、30ナノグラムのcfDNA、および二重蒸留水を加えて合計60マイクロリットルにします。別のチューブに、同じ成分をcfDNAの代わりに1マイクログラムのgDNAで追加します。混合物を20°Cのサーマルサイクラーで30分間インキュベートし、続いて65°Cで蓋を加熱せずに30分間インキュベー

インキュベーションの直後に、ライゲーションマスターミックス30マイクロリットル、ライゲーションエンハンサー1マイクロリットル、および独自のシーケンシングアダプター4マイクロリットルをチューブに加えます。反応を20°Cのサーマルサイクラーで、蓋を加熱せずに15分間インキュベートします。ボルテックスして磁気ビーズを再懸濁し、ビーズを室温で少なくとも30分間放置します。

次に、再懸濁した磁気ビーズ87マイクロリットルをライゲーション反応に加えます。ピペッティングで上下させてよく混合し、サンプルを室温で5分間インキュベートします。ビーズを洗浄し、風乾した後、20マイクロリットルの10ミリモルTris-HCLを加えて、ビーズからDNAターゲットを溶出します。

20マイクロリットルのアダプターライゲーションDNAフラグメント、5マイクロリットルのインデックスプライマーi7、25マイクロリットルのライブラリ増幅マスターミックス、および合計50マイクロリットルまでの二重蒸留水を追加します。PCRは、アダプターライゲーションされたcfDNAまたはgDNAを増幅します。次に、45マイクロリットルの懸濁磁気ビーズをPCR濃縮DNAに加えます。

ピペッティングで上下させてサンプルを混合し、5分間インキュベートします。上清を取り除き、ビーズを洗浄した後、30マイクロリットルの10ミリモルTris-HCLを使用して、アダプターでDNA断片を溶出します。標的DNA捕捉を行うには、滅菌チューブ内で、1.5マイクログラムのプーリングライブラリ、P5ブロック100PおよびP7ブロック100Pの各8マイクロリットル、および1マイクロリットルのコック1つのDNAあたり1マイクログラムの5マイクロリットルを追加してサンプルをブロックします。

摂氏60度に設定された真空濃縮器を使用して、チューブの内容物を乾燥させます。8.5マイクロリットルの2Xハイブリダイゼーションバッファー、2.7マイクロリットルのハイブリダイゼーションエンハンサー、および1.8マイクロリットルのヌクレアーゼフリー二重蒸留水を加えて、DNAキャプチャプローブをライブラリとハイブリダイズします。ピペッティングで上下に混合し、95°Cのサーマルミキサーで10分間インキュベー

次に、すぐにカスタムプローブを4マイクロリットル追加します。サンプルを65°Cのサーマルミキサーでインキュベートし、蓋を75°Cに加熱して4時間加熱します。ハイブリダイズされたターゲットDNAをストレプトアビジンビーズとインキュベートし、ビーズを洗浄して未結合のDNAを除去します。

製造元の指示に従って市販のキットを使用して、捕捉されたDNA断片を含む再懸濁ビーズの最終20マイクロリットルを入手してください。ストレプトアビジンビーズからの未結合DNAの洗浄ステップは迅速であるべきです。そうしないと、標的DNAの捕捉効率が影響を受ける可能性があります。

メーカーの指示に従って、2マイクロモル骨格オリゴヌクレオチドを含む市販のキットを使用してPCRを行うことにより、捕捉されたDNA断片を増幅します。最後に、45マイクロリットルの懸濁ビーズをPCR産物に直接添加し、溶出によってビーズに結合した増幅された標的DNA断片を30マイクロリットルの10ミリモルTris-HCLで濃縮します。フラグメントを定量化し、テキストプロトコルに従ってシーケンシングとデータ解析を実行します。

この表は、ER-seqが従来の方法と比較してカバレッジ深度を23%向上させる方法を概説しています。これは、cfDNA分子を効率的に回収するためであり、希少な変異の解析を大幅に強化します。また、ER-seqで使用される独自のシーケンシングアダプターにより、自然重複とPCR誘発重複の区別が容易になることも明らかです。

この表の呼び出し結果に詳述されているように、ER-seqに基づく解析はEGFR pL858R検出で100%一貫しており、検出頻度は従来の解析と比較すると少し高かった。重要なことに、ER-seq解析により、従来の解析では高いバックグラウンドノイズのために認識されていなかったEGFR pT790Mを含む、他の比較的低頻度の変異の検出が可能になりました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば48時間で完了します。

この手順を試行する際には、抽出、ライブラリ調製、およびハイブリダイゼーション後のビーズ洗浄中に非常に少量のcfDNAが失われないように注意することが重要です。このビデオを見れば、患者からctDNAがどのように収集され、調製され、シーケンシングのために識別された一意のものに基づいて標的にされたかを十分に理解できるはずです。その開発後、この技術は、リキッドバイオプシーの分野の研究者がクリニックの意思決定を行う際のより良い実践を探求する道を開きました。