Name: 適切なポジショニングと骨のマイクロ アーキテクチャを使用して体内のマイクロ-コンピューター断層撮影の焦点の高分解能イメージングのためのラットの後肢の拘束 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: 学ぶラット後肢の適切なポジショニングと拘束法を用いた生体内マイクロCTによる骨マイクロアーキテクチャの高解像度イメージング手法。縦断的研究における骨構造変化の定量化に有用です。

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著者らは研究を認めるレベル検出グラント (#05573) と革新 (#222084) のためのカナダの基盤から、生体内でマイクロ CT を資金調達のための資金はワードが骨や筋肉の発達でカナダ研究椅子。

本研究は、動物ケア委員会の大学によって承認され、動物ケア21カナダ評議会によって確立されたガイドラインに従って実施します。
1. イソフルラン麻酔ガスによる麻酔
<ol><li>事前麻酔器 (補足図 1) から約 1 から 2 リットル/分の連続流量で高品質 O2アクリル ガラス インキュベーション室に記入します。</li>
	<li>まずインキュベーション室尾にラットを転送し、気密のシールを作成するインキュベーション室蓋を閉じる。</li>
	<li>3-4 %v/v O2 1 2 L/分 (補足図 1) の連続的な流量での解散で獣医グレード イソフルランと培養チャンバーを開始します。 注意: 廃棄物麻酔ガスは、ハンドラーに悪影響影響を及ぼします。スカベン ジャー システム (すなわち、活性炭フィルターや発煙のフードに直接排気) する必要があります常にあります。</li>
	<li>ラットが立つことができるとは、もはや、フェイス マスクまたは鼻の円錐形 1-3% イソフルランを受信するラット溶解 O2ラット 1 2 L/分の流量で主に転送で息を鼻など、鼻のマスクや鼻で覆われている限り、コーン、十分な麻酔の配信があります。</li>
	<li>任意のエスケープ イソフルラン ガスからそれらを保護するために目の繊細な膜の潤滑点眼。 注: 確実に眼潤滑抗生物質なしの介入からの結果に影響する可能性が。</li>
	<li>眼瞼 (眼瞼開口部の穏やかな刺激への応答を瞬目) を測定し、ペダル (つまんでに応えて後肢の撤退) 反射;麻酔の深さを増加、眼瞼反射する不在の前にペダルを踏む反射 (補足図 2)。</li>
	<li>麻酔の適切なレベルに達するし、ラットは眼瞼とペダルの反射神経を失ってしまった維持 0.5 2 ラット % イソフルラン O2 1 2 L/分の流量で解散。</li>
	<li>内部の監視システムと直接またはライブ ビデオ フィード (補足図 3) ラットの視覚定数を保つことによってプロシージャ全体でラットの呼吸率を継続的に監視します。</li>
</ol>2. 位置決めとラットの後肢の拘束
<ol><li>(補足図 4) 炭素繊維スキャナー ベッドに仰臥位でラットが横たわっていた。</li>
	<li>右の足を抑制、可鍛性の発泡チューブ、チューブの端から拡張するつま先。泡でしっかりと足をホールドし、密閉チューブをテープに歯科用ワックスを適用します。足を保持しているチューブの直径がプラスチック製のチューブにしっかりと収まるように十分なことを確認します。</li>
	<li>X 線スキャナー ベッド (補足図 5) にプラスチック製のチューブを挿入します。</li>
	<li>それがピンと張ったまでラット後肢を拡張します。苦しい呼吸性四肢に不随意運動を誘発する可能性がありますこれ、ラット (補足図 5) に害を引き起こすか脚を過剰拡張しません。</li>
	<li>スキャンの視野から胴体に向けて尾と共に左脚 (非スキャン後肢) を引く拡張足をスキャンするから。</li>
	<li>左足 (非スキャン後肢) とマスキング テープを使用して位置でテールを固定します。ときに、これらの材料はラットに害を与えるか、何かもっとまたはより少なく粘着性 (すなわちダクトテープや画家のテープ) を使用しない (ダクト テープ) を削除または十分に強いホールド (画家のテープ) を提供 (補足図 6)。</li>
	<li>腰、肩、そしてマスキング テープでヘッド位置にラットの体を固定します。フェイス マスクや鼻の円錐形 (補足図 6) ラットに確保します。 注: しみ、ネズミの毛に固執する能力を削除するマスキング テープの粘着面です。スキャナー ベッドに確実に固定ができるように、マスキング テープの両端は覆えない。</li>
	<li>獣医 (補足図 6) の熱損失を制限するラップでラットをラップします。 注: 全身麻酔下ラットは、本体重量比19,20の大きい表面のために急速に熱を失います。</li>
	<li>(どちらか直接またはライブ ビデオ フィード) ラットの視覚定数を保つことによってプロシージャ全体でラットの呼吸率を継続的に監視します。 注: セットアップが約 5 分を所要するここで、スキャン データ収集、取得、設定に依存して、回復時間は 60 分。</li>
	<li>µCT 画像に進みます。 注: スキャン データ収集の正確な仕様は、各スキャナーに固有いくつか方法論的出版物存在を通して文学1,2型、ソフトウェア システム、具体的な研究の質問,9。</li>
</ol>3. 麻酔からの回復
<ol><li>µCT体内スキャンの完了後、ラットのイソフルランの流れを止めるが、O2の 1 2 L/分の流量を維持します。</li>
	<li>ラットを取り戻す運動制御 (1-2 分)、レスピレーターから削除し、弱火で汎用加熱パッドで部分的に置かれたケージの中を個別に回復すること。ラットの全身麻酔第19のとき 1 ° C によって体の温度を減らすために知られています。放置しないでください、ラットまでそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。 メモ: 我々 の研究グループからの逸話的な証拠が報告を食べはじめるとすぐに次のイソフルラン麻酔から回復ラットと彼らの食糧があるし、水の回復中に利用できるようにすることが重要です。我々 はこの現象を観察している、食品摂取量や体体重1,9にも繰り返し全身麻酔上で大幅な増加は発生しません。</li>
</ol>

<ol><li>Longo, A. B., Sacco, S. M., Salmon, P. L., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+use+of+micro-computed+tomography+does+not+alter+microarchitecture+of+the+proximal+tibia+in+sham+or+ovariectomized+sprague-dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Longitudinal use of micro-computed tomography does not alter microarchitecture of the proximal tibia in sham or ovariectomized sprague-dawley rats.</a> Calcif Tissue Int. 98 (6), 631-641 (2016).</li>
<li>Sacco, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+irradiation+from+micro-computed+tomography+scanning+at+2%2C+4+and+6+months+of+age+does+not+induce+damage+to+tibial+bone+microstructure+in+male+and+female+CD-1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Rep%22%5BJournal%5D)">Repeated irradiation from micro-computed tomography scanning at 2, 4 and 6 months of age does not induce damage to tibial bone microstructure in male and female CD-1 mice.</a> Bonekey Rep. 6, 855(2017).</li>
<li>Waarsing, J. H., Day, J. S., Verhaar, J. A., Ederveen, A. G., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+loss+dynamics+result+in+trabecular+alignment+in+aging+and+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Bone loss dynamics result in trabecular alignment in aging and ovariectomized rats.</a> J Orthop Res. 24 (5), 926-935 (2006).</li>
<li>Klinck, R. J., Campbell, G. M., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+effects+on+bone+architecture+in+mice+and+rats+resulting+from+in+vivo+micro-computed+tomography+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Eng+Phys%22%5BJournal%5D)">Radiation effects on bone architecture in mice and rats resulting from in vivo micro-computed tomography scanning.</a> Med Eng Phys. 30 (7), 888-895 (2008).</li>
<li>Laperre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+micro-CT+protocols+for+in+vivo+follow-up+of+mouse+bone+architecture+without+major+radiation+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Development of micro-CT protocols for in vivo follow-up of mouse bone architecture without major radiation side effects.</a> Bone. 49 (4), 613-622 (2011).</li>
<li>Brouwers, J. E., van Rietbergen, B., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+effects+of+in+vivo+micro-CT+radiation+on+structural+parameters+and+bone+marrow+cells+in+proximal+tibia+of+wistar+rats+detected+after+eight+weekly+scans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">No effects of in vivo micro-CT radiation on structural parameters and bone marrow cells in proximal tibia of wistar rats detected after eight weekly scans.</a> J Orthop Res. 25 (10), 1325-1332 (2007).</li>
<li>Francisco, J. I., Yu, Y., Oliver, R. A., Walsh, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+age%2C+skeletal+site%2C+and+time+post-ovariectomy+on+bone+mineral+and+trabecular+microarchitecture+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between age, skeletal site, and time post-ovariectomy on bone mineral and trabecular microarchitecture in rats.</a> J Orthop Res. 29 (2), 189-196 (2011).</li>
<li>Altman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+skeletal+growth%2C+modeling%2C+and+remodeling+by+in+vivo+micro+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro computed tomography.</a> Bone. 81, 370-379 (2015).</li>
<li>Longo, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifelong+intake+of+flaxseed+or+menhaden+oil+to+provide+varying+n-6+to+n-3+PUFA+ratios+modulate+bone+microarchitecture+during+growth%2C+but+not+after+OVX+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">Lifelong intake of flaxseed or menhaden oil to provide varying n-6 to n-3 PUFA ratios modulate bone microarchitecture during growth, but not after OVX in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Nutr Food Res. 61 (8), (2017).</li>
<li>Sacco, S. M., Saint, C., LeBlanc, P. J., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+consumption+of+hesperidin+and+naringin+flavanones+exerts+transient+effects+to+tibia+bone+structure+in+female+CD-1+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Maternal consumption of hesperidin and naringin flavanones exerts transient effects to tibia bone structure in female CD-1 offspring.</a> Nutrients. 9 (3), 250(2017).</li>
<li>Campbell, G. M., Buie, H. R., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signs+of+irreversible+architectural+changes+occur+early+in+the+development+of+experimental+osteoporosis+as+assessed+by+in+vivo+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporos+Int%22%5BJournal%5D)">Signs of irreversible architectural changes occur early in the development of experimental osteoporosis as assessed by in vivo micro-CT.</a> Osteoporos Int. 19 (10), 1409-1419 (2008).</li>
<li>De Schaepdrijver, L., Delille, P., Geys, H., Boehringer-Shahidi, C., Vanhove, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+longitudinal+micro-CT+study+of+bent+long+limb+bones+in+rat+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">In vivo longitudinal micro-CT study of bent long limb bones in rat offspring.</a> Reprod Toxicol. 46, 91-97 (2014).</li>
<li>Perilli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+early+bone+changes+using+in+vivo+micro-CT+in+ovariectomized%2C+zoledronic+acid-treated%2C+and+sham-operated+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporos+Int%22%5BJournal%5D)">Detecting early bone changes using in vivo micro-CT in ovariectomized, zoledronic acid-treated, and sham-operated rats.</a> Osteoporos Int. 21 (8), 1371-1382 (2010).</li>
<li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li>
<li>Li, H., Zhang, H., Tang, Z., Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography+for+small+animal+imaging%3A+Technological+details%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Natural+Science%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography for small animal imaging: Technological details.</a> Progress in Natural Science. 18 (5), 513-521 (2008).</li>
<li>Campbell, G. M., Sophocleous, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+bone+and+soft+tissue+by+micro-computed+tomography%3A+applications+to+ex+vivo+and+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of bone and soft tissue by micro-computed tomography: applications to ex vivo and in vivo studies.</a> Bonekey Rep. 3, 564(2014).</li>
<li>Meganck, J. A., Kozloff, K. M., Thornton, M. M., Broski, S. M., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam+hardening+artifacts+in+micro-computed+tomography+scanning+can+be+reduced+by+X-ray+beam+filtration+and+the+resulting+images+can+be+used+to+accurately+measure+BMD%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Beam hardening artifacts in micro-computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD.</a> Bone. 45 (6), 1104-1116 (2009).</li>
<li>Vazquez, C. M., Molina, M. T., Ilundain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+rat+large+intestine+in+reducing+diarrhea+after+50%25+or+80%25+distal+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of rat large intestine in reducing diarrhea after 50% or 80% distal small bowel resection.</a> Dig Dis Sci. 34 (11), 1713-1719 (1989).</li>
<li>Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+isoflurane%2C+ketamine-xylazine+and+a+combination+of+medetomidine%2C+midazolam+and+fentanyl+on+physiological+variables+continuously+measured+by+telemetry+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats.</a> BMC Vet Res. 10, 198(2014).</li>
<li>Schmitz, S., Tacke, S., Guth, B., Henke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+physiological+parameters+and+anaesthesia+specific+observations+during+isoflurane%2C+ketamine-xylazine+or+medetomidine-midazolam-fentanyl+anaesthesia+in+male+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of physiological parameters and anaesthesia specific observations during isoflurane, ketamine-xylazine or medetomidine-midazolam-fentanyl anaesthesia in male guinea pigs.</a> PLoS One. 11 (9), e0161258(2016).</li>
<li>Canadian Council on Animal Care. Guide to the care and use of experimental animals. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Experimental_Animals_Vol1.pdf">http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Experimental_Animals_Vol1.pdf</a> (1993).</li>
<li>Stevens, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicities+of+halothane%2C+isoflurane%2C+and+diethyl+ether+at+subanesthetic+concentrations+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicities of halothane, isoflurane, and diethyl ether at subanesthetic concentrations in laboratory animals.</a> Anesthesiology. 42 (4), 408-419 (1975).</li>
</ol>

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このプロトコルには、適切な麻酔、配置、および拘束ラットの生体内でµCT の後肢のスキャン中に最初の詳細なガイドラインと視聴者がしています。これらのガイドラインでは、高解像度を取得する生体内のµCT スキャン システムのユーザーと 3 次元骨のマイクロ アーキテクチャの定量化のため処理することができます脛骨の高品質の画像を有効にします。不自然な位置ではなく適切な位置と拘束を伴う適切な麻酔ラットだけでなく、ピンと張った、それまで他のすべての重要な構造から後肢を拡張するために必要なプロトコルでの重要なステップです。最適なイメージングの結果、完全なリラクゼーションのレベルにラットを麻酔すること、眼瞼およびペダルの反射が失われることが不可欠です。さらに、スキャンの足を拡張する必要があります、全体の足と足首を泡で拘束する必要があります。スキャンの脚の最適な位置決めを達成するために上記の方法がように: 1) 試験中のラットの後肢の回転と各脚の同じ領域を通過する x 線ビームが可能、同じ方向に向きが一貫してサンプルとして周辺後肢の随意と不随意の 2) 両方の移動は発生しません、取得した画像の品質に影響するアーチファクトの可能性を最小限に抑える3) オブジェクト (すなわち尾) から障害物はできない、BMD と TMD の不正確な測定を生成する部分容積効果の可能性を最小限に抑える。これらのガイドラインは、イソフルラン代謝と位置決めのレートひずみと体サイズ22によって異なります、それぞれ個々 のラットの変更可能性があります。スキャン機生体内で最も一般的な実験動物用に設計された (すなわちマウス、ラット、ウサギ、モルモット) 動物の異なるサイズのスキャンを許可する交換可能な動物段階があるだろうと。したがって、体重の広い範囲に対応することができます彼ら。
体内の µCT スキャン位置し、初期スキャンから得られるイメージでは、質の悪い場合は再スキャンするラットのための許可は繰り返しスキャン、放射線およびイソフルラン麻酔の追加投与のラットを公開時間の長期間。毎月繰り返される放射線被ばくラット脛骨に焦点を当てた 4 ヵ月以上 600 mGy の骨のマイクロ アーキテクチャ1対側下肢に比較して副作用は発生しませんが、これで繰り返される 2 つのスキャンの安全性を確認しませんすぐに連続。説明した手法のさらなる制限、骨の構造のいくつかの変更を呼び出すことができますまだ、それを維持するために適用される力でピンと張った後肢を拡張する必要があります。スキャン中に後肢の抑制の重症度は、それぞれの研究目的に依存している毎月繰り返される生体内でµCT のイメージング 1 つ後肢を含む当研究室の過去の研究結果、皮質の違いでマイクロ建築パラメーター、偏心、繰り返された延長、安定化、 1スキャンを受けていない側の後肢に比較します。偏心は、皮質骨と荷重の変更への応答の変化のような楕円形の尺度です。したがって、µCT生体内イメージングを繰り返すポジショニングとの後肢の抑制のこのメソッドを使用して、考慮しなければならない荷重マイクロ建築パラメーター評価と解釈が変更されたとき。
上記のガイドラインはイメージングと骨の分析のために提供されている中、は、後肢の軟部組織を撮像するときプロトコルに若干の調整を行う必要があります。具体的には、現在のプロシージャ misshapes スキャンの時間の異常な位置に軟部組織 (筋肉、脂肪組織) の向きと後肢の胴体から拡張し、拘束の方法を考慮し、撮影する必要があります。したがって、後肢の軟部組織のイメージングに使用するこのモデルを推定する際は、減らすか、お互いに関連して組織の位置の変更を排除する拘束法にいくつかの調整を行ってください。
さらに、ガイドラインに書かれている特別に基づいて我々 の研究グループの経験、ただし、他市販生体内の µCT スキャナーに対応するため変更することができます。位置し、後肢を抑制するその他の推奨される方法は、システムをスキャンする生体内でµCT の製造業者によって可能性があります。µCT 単位最も市販体内ポリプロピレン、発泡スチロールと受容可能な材料およびスキャンの脚を抑制するための方法として足の突出を保持する歯科用ワックス、プラスチック チューブ。しかし、このプロトコルで紹介した方法より一貫した位置決めやスキャンした脚の拘束を提供し、一貫して高品質の画像を生成します。本手法で説明するガイドラインは、気化器、チューブ、マスク、誘導室、酸素など、ラットの麻酔に必要な特殊な装置を必要とします。研究者の代替以上の利点を提供する意識の特定の深さに迅速かつ正確に麻酔することができますそれ注射麻酔薬と比較してコストがやや高い装置が関連付けられていますが、メソッド。
高解像度生体内でµCT 技術を活用する研究者は、彼らの介入を調査するビデオ、本手法のガイドラインを使用して興味のこと正しく一貫してオリエント ・高のラット後肢を抑制x 線の画像。これは µCT 画像取り込み体内のフィールドに連続を提供し一貫性と正確性の研究内の最適化に向けてのステップとして機能し、文学研究間での比較を有効にします。同様に、これらのプロトコルおよび方法は、いくつかの変更が必要な2,10になりますが、マウスを含む他の齧歯動物種で使用する拡張できます。たとえば、泡管の足の拘束は、スキャン中に脚の動きの可能性を最小限に抑えるため足首を含めることができます。さらに、完全な足は、フォーム ホルダーに収まるでしょう。したがって、ラットの足を確保するようにつま先をホルダーの端を拡張しません。さらに、マウスの体では、ラットとしてテープと同じ拘束は必要ありません。小さい鼻の円錐形は、スキャン中にマウスで麻酔を維持するために使用できます。小さい鼻の円錐形を使用できない場合利用可能な鼻の円錐形をニトリル手袋を確保、小切開は、鼻の周りのシールを維持しながら麻酔を提供するためにマウスの鼻に合うことができるスペースを提供する手袋できます。
脛骨近位端骨のラットにおける微細構造変化を調査のメインのサイトですが、大腿骨や腰椎など他の骨格のサイトの適切な一貫した位置のためのガイドラインは調査して設立文献の一貫性。しかし、腰椎のイメージングを含む今後の研究に着手しているときの考慮事項は脊椎の画像化により、周囲の臓器や組織への放射線被ばくとしてなされなければなりません。

生体内でマイクロで計算された断層レントゲン写真撮影 (µCT) の使用は、齧歯動物モデルを用いた高解像度で内部構造の非破壊イメージングを含む強力なツールです。µCT生体内の非破壊的な性質を時間をかけて同じ齧歯動物のイメージングを繰り返す可能します。この機能は、実験の設計に必要な齧歯動物の総数を減らすだけでなく、被験者間変動が発生する可能性が研究者の介入の長期的なレスポンスを理解することができますが減少します。繰り返される生体内のµCT を使って、マウスおよびラットの実験は、マイクロ アーキテクチャを骨し、骨のミネラル密度 (BMD)、寿命1,2,3 の期間を通じて発達的変化を解明しました。介入ダイエット9,10などへの骨の健康の応答と同様、 ,4,5,6,7,8卵巣摘出7,11と薬理学的薬剤8,12,13。骨と脛骨近位端、大腿骨と腰椎、すなわち特定の骨格部位で骨マイクロ アーキテクチャが全体の骨の健康と維持、破壊の危険性を示すので主な措置は、レスポンスを定量化します。介入。
µCT 画像取り込み体内を含む二次元 x 線投影 x 線源と検出器調査14,15の下で動物を中心に回転、複数角度で買収されます。結果として得られる画像の品質はなど、多くの要因に依存しているが、これらに限定されない: 集録パラメーターを選択 (すなわち、空間分解能、x 線電圧、アンペア数、回転ステップ、適用されているフィルター、露光時間)、µCT の制限スキャナー (すなわち、光線または部分容積効果を引き起こすアイテム リング アイテムやほこりなどのスキャナー ベース) と適切なポジショニングと動物の拘束。これらの要因の元の 2 つをある程度操作できる特定のスキャン マシンに応じて、ユーザー、研究目標と修正に必要なスキャナーの機能または取得した画像の処理を最適化します。後者の場合、スキャンする前に齧歯動物の適切な配置、これらの要因はスキャナー ・ ベースの制限やアクイジション ・ パラメーターは特定の調査目的を達成するために選択されているに関係なく実現できます。生体内イメージングを含む多くの出版物は、文献14,15,16,17に掲載されている、古典的な原稿スタイルは詳細なように「どのように」情報含まれてすることはできません。そのため、この記事とビデオ ガイドの目的は、この隙間を埋めるためです。ここで、ラットを麻酔、位置および骨のマイクロ アーキテクチャの成果をより正確に定量化する分析することができます高品質の画像を生成する後肢を抑制する方法 µCT スキャナー体内のユーザーに指示を目指します。
後肢以外のオブジェクトを x 線ビームの防ぐ障害物が最も正確な骨密度と骨のマイクロ アーキテクチャの値を定量化するため不可欠であります。オブジェクト、厚さや密度の異なる組織を通過する x 線、x 線のいくつかは、(すなわち減衰) を通過する材料によって吸収されます。サンプルの測定質量密度は、その厚さの有無と周囲の組織の厚さによって影響を受けるので、同じ方法で骨密度を決定するために使用する校正ファントムをスキャンするが不可欠です。したがって前、にまたは関心領域を通過した後、オブジェクト (すなわち尾) を通過する x 線ビームの場合は、それらのオブジェクトは、x 線のエネルギーの一部を吸収、透過像の取得を妨げます。さらに、これらのスキャンはサンプルのスキャンのようにする必要があります密接にファントムをスキャンする場合をシミュレートするために非常に難しいでしょう。その結果、これらの減衰の違いは骨の骨密度測定の評価の不正確さに します。したがって、使いやすさと精度のために、x 線源、関心と x 線検出器の間に障害物の数を制限することをお勧めします。
前臨床モデルでの介入からの骨の構造の縦断的評価には、プロトコルをスキャン中に彼らの動きを制限する動物の繰り返しなされる麻酔が含まれます。注射と吸入麻酔1,2,4,5,6,を含む µCT スキャンを受けている動物を征服するために全身麻酔のいくつかの方法が存在します。12.、イソフルランなどの吸入麻酔薬とは異なり繰り返される麻酔注射麻酔薬を使用して低下体重、手術トレランスおよび齧歯動物、他の生理学的パラメーターの大幅な変更特にラットおよびモルモット、使用18,19,20を繰り返し重大な禁忌を示唆しています。イソフルラン、揮発性の高い、迅速な誘導と回復、注射麻酔薬は麻酔のさまざまなレベルを生成、麻酔下での時間依存ひずみ、セックス、体組成、絶食状態と概日周期の動物。彼らは全国の自治体で規制が厳しい、注射麻酔薬もそれらの使用に追加の障壁をもたらします。吸入麻酔はしかし、呼吸器系に直接配信を含む誘導と回復時間の長さと麻酔19,20の深さに対する制御の向上、このメソッドは高速にできます。吸入麻酔法に制限には、メンテナンスおよびリカバリ18,19期心拍数や血圧に専用の気化装置といくつかの変更のための要件が含まれます。

<table><tbody><tr><td>イソフルラン</td><td>フレゼニウスカビアニマルヘルス</td><td>108737</td><td></td></tr><tr><td>気化器</td><td>Dispomed</td><td>990-1091-3SINEWA</td><td></td></tr><tr><td>スカベンジャー/チャコールフィルター</td><td>Dispomed</td><td>985-1005-000</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CTスキャナー</td><td>Bruker microCT</td><td>SkyScan 1176</td><td></td></tr><tr><td>デンタルワックス</td><td>Kerr Dental Laboratory</td><td>623</td><td></td></tr><tr><td>フォーム(バッカーロッド)</td><td>ロナ</td><td>CF12086</td><td>1インチx10'</td></tr><tr><td>プラスチックチューブ</td><td>Bruker microCT</td><td>SP-3010</td><td></td></tr><tr><td>カーボンファイバーベッド</td><td>Bruker microCT</td><td>SP-3002</td><td></td></tr><tr><td>獣医用ラップ/包帯</td><td>Dura-Tech</td><td>17473</td><td></td></tr><tr><td>眼科用ジェル</td><td>OptixCare</td><td>006CLC-4256</td><td>抗生物質不使用</td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>サンビーム</td><td>000731-500-000</td><td></td></tr></tbody></table>

適切なポジショニングと骨のマイクロ アーキテクチャを使用して体内のマイクロ-コンピューター断層撮影の焦点の高分解能イメージングのためのラットの後肢の拘束

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

体内マイクロで計算された断層レントゲン写真撮影 (µCT) の使用は、生きた動物モデルの高解像度で内部構造の非破壊イメージングを含む強力なツールです。時間をかけて同じ齧歯類の繰り返しのイメージングが可能になります。この機能は、実験の設計に必要な齧歯動物の総数を減らすだけでなく、被験者間変動が発生する可能性が、長手方向または生涯のレスポンスの介入を評価するために研究者ができますが減少します。処理および骨のマイクロ アーキテクチャの成果をより正確に定量化する分析が可能な高品質の画像を取得するには、µCT スキャナー体内の必要があります正しく、ラットを麻酔位置や後肢を抑制します。これを行うには、完全なリラクゼーションのレベルにラットを麻酔すること、ペダル反射が失われることが不可欠です。これらのガイドラインは、イソフルランの代謝率はひずみと体サイズによってさまざまな種類それぞれ個々 のラットの変更可能性があります。µCT 画像取り込み体内の適切な技術は、マイクロ アーキテクチャ骨内および研究間での正確で一貫性のある測定を可能。 にします。

麻酔ラット、および位置決めのためのこのメソッドは、後肢の拘束 µCT イメージング生体内で容易に高品質の獲得のため画像脛骨マイクロ アーキテクチャの分析には適さない。完全に拡張される足と足全体と海綿骨と皮質マイクロ アーキテクチャ (の分析のための十分な品質の取得したイメージが表示される (図 1 a) 泡で拘束された足首は、ラットの後肢の適切な位置図 1 b)。不十分な配置と後肢 (図 1) の拘束 x 線走査フィールドのビュー (図 1E) からは完全に削除されませんテールが干渉しながら運動成果物 (図 1)、画像で結果することができます。スキャンされたサンプル (図 1 f) による減衰と骨と組織のミネラル密度 (TMD) 測定を変更します。これらの配置エラーのいずれかはさらに分析する必要があります質の悪いスキャンになります。質の悪い達成画像細かい骨梁ネットワークの定量化と後肢の皮質の構造が変更されます、不適切または決定的なデータ14が生成されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56346/56346fig1.jpg"> 図 1。ラット後肢の配置を代表的な画像と断面における脛骨近位端の対応する取得した画像。 (A) 泡で完全に拘束された足首とラットの後肢の適切な配置、脚延長し、脛骨から離れた尾脛骨と海綿骨・皮質 (B) 断面で十分な画像品質を提供しますマイクロ アーキテクチャ。(C) 足をラット後肢の不適切な配置が完全に拡張し、足首の泡で完全に拘束された断面の縞として見られる、(D) 運動アーティファクトがあります。(E) オブジェクトは、ビューのフィールドない脛骨 (F) から離れた尾脛骨からの x 線の減衰と干渉する変更された骨と顎関節症の結果することができます測定、視覚的に明らかではないが、間の干渉します。Fパネルの左下隅は、後脛骨を通過した x 線ビームは妨害するビューのフィールドの尾の部分を示しています。左のパネルの赤の点線で断面の右側のパネルに表示されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/56346fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足図 1。イソフルラン麻酔ユニットイソフルラン麻酔ユニット 3-4% イソフルラン O2連続全身麻酔導入 1 2 L/分の流量での溶解を提供するように設定します。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_1.jpg">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 2。麻酔の深さを確保します。連続受信ラットの足の指をつまんでメジャー ペダル反射吸入マスクまたは鼻の円錐形を用いた麻酔薬。痛みの反応は、脚をわずかに拡張より明らかです。鉗子やクランプの使用は非常に強力な抓りや組織の損傷を引き起こすことができる、したがって、使用しないようにします。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_2.jpg">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 3。ライブ フィードの生理学的監視カメラのビューのスクリーン キャプチャします。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_3.jpg">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 4。ラットのカーボンファイバー製スキャナー ベッドに仰臥位で敷設します。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_4.jpg">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 5。可鍛性発泡チューブで拘束されたラットの右足です。ラットの右の足は範囲 (ここでは描かれていない) チューブからつま先で可鍛性発泡チューブに拘束されています。発泡チューブは、プラスチック製のホルダーに拘束されている (を参照してください表特定材料/機器の詳細について)。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_5.jpg">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 6。ラットの右脚をまっすぐ延長と位置を確保します。(胴) に向かって右脚から尾と左の足をテープ、腰が固定されて、ラット胴体は獣医ラップ (青) を熱損失を制限するために包まれました。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_6.jpg">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。

本稿は、マイクロで計算された断層レントゲン写真撮影 (µCT) スキャナー体内のユーザー麻酔、正しく位置および脛骨の高分解能イメージング中に最小限の動きでラットの後肢を抑制する方法を指示します。結果は骨のマイクロ アーキテクチャを正確に定量化する処理することができます高品質の画像です。

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

この手順の全体的な目標は、In Vivo マイクロ コンピューター断層撮影を使用して、近位脛骨と遠位大腿骨の骨マイクロ アーキテクチャの焦点を合わせた高解像度画像を取得するために、ラットの後肢を適切に配置して拘束することです。この方法は、マイクロCTによるIn Vivo画像の取得に関する重要な質問に答えるのに役立ち、後肢の適切な位置決めと拘束のためのガイダンスを提供します。この手順の主な利点は、一貫性の高い画像を取得し、縦断的研究中に発生する骨のマイクロアーキテクチャの変化を定量化するために使用できることです。ラットをカーボンファイバースキャナーベッドの仰臥位に置きます。つま先をつまむことに反応しないことで適切な鎮静レベルを確認した後、動物の目に眼科用潤滑剤を塗布します。つま先が一方の端から伸びている可鍛性フォームチューブで足を拘束し、フォームが関心のある領域に伸びないように注意しながら、デンタルワックスを塗布して足をフォーム内にしっかりと保持します。チューブをテープでしっかりと密封し、フォームをチューブに挿入します。フォームとチューブがしっかりとはまっていることを確認し、チューブをX線スキャナーベッドにスライドさせます。脚がぴんと張るまで後肢を伸ばします。膝関節の位置を触診し、反対側の後肢と尾を胴体に向かって引っ張ることにより、過度の伸展の欠如を確認します。後肢を胴体から離して脚がぴんと張るまで伸ばすことで、X線が骨のすべての領域をできるだけ同様のパターンで通過することを確認します。次に、マスキングテープのいくつかの接着面を拭き取り、修正したテープを使用して、伸びていない後肢と尾を固定し、スキャン視野から外れないようにします。次に、腰、肩、頭、鼻のコーンをスキャンベッドに固定します。動物を獣医用ラップで包んで熱損失を制限し、標準プロトコルに従って適切な実験パラメータを使用してマイクロコンピューター断層撮影で動物を画像化します。すべての画像を取得したら、動物が部分的に加熱された個々のケージで回復し、完全に横臥するまで監視します。ラットの後肢の適切な位置決めには、脚を完全に伸ばし、足全体と足首を発泡スチロールで拘束することが含まれ、その結果、小柱および皮質のマイクロアーキテクチャの分析に十分な品質の画像が得られます。後肢の配置が不十分で拘束すると、動きのアーチファクトを伴う画像が作成される可能性がありますが、スキャン視野から完全に除去されていない尾部は、スキャンサンプルによるX線減衰を妨げ、骨髄と組織のミネラル密度の測定値を変化させます。習得すると、この手順は5〜10分で適切に実行できます。この手順を実行するときは、ラットの呼吸数、鎮静レベル、および放射線被曝量を常に認識することが重要です。この手順は、大腿骨遠位端や腰椎などの他の骨格部位を評価するために変更して使用できます。さらに、この手順は、マウスなどの他のげっ歯類の種に修正して使用することができます。このビデオを見た後、近位脛骨の骨マイクロアーキテクチャの焦点を合わせ、一貫した高解像度イメージングのために、ラットの後肢を適切に配置および拘束する方法を十分に理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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