マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

この手順の全体的な目標は、改変胚様体から単層への方法を使用して、マウス胚性幹細胞の有糸分裂後介在ニューロン前駆細胞に皮質介在ニューロン前駆細胞を生成することです。この方法は、皮質介在ニューロンのサブタイプが発生中に個々の運命をどのように達成するかなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、Nkx2.1を発現するインターニューロン前駆細胞の効率的な生成を可能にすること、およびパルブアルブミンまたはソマトスタチンインターニューロンサブグループを濃縮する方法を可能にすることです。

この手順を開始するには、MEF培地中の有糸分裂的に不活性なMEFフィーダー細胞を組織培養処理プレートにプレートします。mESCをプレーティングする前に、摂氏37度の細胞培養インキュベーターに落ち着くまで少なくとも12時間待ちます。すぐに使用しない場合は、MEF メディアを 3 日ごとに交換してください。

次に、マウス白血病阻害因子を含むmESCをMEFプレートに添加します。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素でインキュベートします。トリプシン-EDTAを使用してmESCを継ぎ、皿が70〜80%コンフルエントになったら、mESCをmESC培地のMEFフィーダー層に維持して多能性を維持します。

分化を開始する前に、MEFを含まないゼラチンコーティングプレートに細胞を少なくとも1回継代して希釈します。これを行うには、組織培養処理皿に0.1%ゼラチンおよびPBSをカルシウムおよびマグネシウムと共に添加してゼラチン被覆プレートを調製し、摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートします。各10センチメートルプレートに1.5〜2×10〜6番目のセルをプレートし、分化を開始する前に2日間拡大させます。

DD0では、mESCがゼラチンコーティングプレート上で2日間増殖した後、培地を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含まないPBSで細胞を1回洗浄します。次に、プレートの表面を覆うのに十分なトリプシン-EDTAを追加します。そして、細胞を摂氏37度のインキュベーターに4分間戻します。

4分後、トリプシン-EDTAをその2倍のmESC培地でクエンチします。細胞を適切なサイズの遠心チューブに移し、細胞を200倍gで5分間遠心分離します。次に、チューブを取り外し、ペレットを乱さずにメディアを吸引します。

ペレットを1ミリリットルのKSR-N2培地に再懸濁します。その後、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞濃度を測定します。非接着性組織培養皿のKSR-N2培地にミリレターあたり75, 000個の細胞を添加することにより、胚様体として細胞を増殖させ始めます。

そして、それらを摂氏37度でインキュベートします。DD1では、組織培養処理済み皿をポリ-L-リジンで少なくとも1時間または摂氏37度で一晩コーティングすることにより、細胞着地の準備をします。DD2では、ポリ-L-リジンを吸引し、プレートをラミニンで摂氏37度で一晩コーティングします。

DD3では、EB解離を開始する前に、ラミニンを吸引し、プレートを組織培養フードで完全に乾燥させます。その後、EBを媒体とともに15ミリリットルのチューブに移し、15倍のgで3〜4分間、またはEBがペレット化されるまで遠心分離します。培地を吸引し、DNaseを含む細胞剥離溶液を3ミリリットル加えます。

次に、サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートします。EBの解離を助けるために、チューブを3分ごとに静かにフリックします。EBが見えなくなったら、または15分が経過したら、DNaseを含むKSR-N2を6ミリリットル加え、200 gで5分間遠心分離します。

次いで、LDN193189、XAV939、およびROCK阻害剤Y27632を含むKSR-N2の細胞を、1cm当たりの4.5〜5倍10〜4分の1で播種する。DD5では、FGF2、IGF1、SSHを含むKSR-N2とメディアを交換してください。次に、DD1およびDD2の手順で概説されている指示を使用して、8日目に再播種するための組織培養プレートを準備します。

DD7では、FGF2、IGF1、SHHが入ったKSR-N2のメディアを交換してください。DD8では、トリプシン-EDTAを使用して細胞をプレートから取り除き、摂氏37度で5分間細胞を再播種します。KSR-N2でトリプシン-EDTAの2倍の容量を使用してクエンチします。

そして、200倍gで5分間遠心分離します。40ミクロンのフィルターチューブで細胞をろ過し、塊を取り除きます。次に、FGF2、IGF1、およびY27632を含むN2-KSRにSHHを含むN2-KSRで、250,000細胞/センチメートルの2乗で細胞を再播種します。

DD10で、SHHが入っているKSR-N2のメディアを交換してください。カルシウムとマグネシウムを含まないPBSで細胞を一度洗浄し、DNaseを含む細胞解離試薬を予熱して温めた非トリプシン含有細胞解離試薬を細胞に加えます。摂氏37度のインキュベーターに10〜30分間、または細胞が剥離するまで

次に、5分ごとにプレートを軽くたたいて、解離を助けます。DD5で、FGF2とIGF1が入ったKSR-N2のメディアを交換してください。次に、DD8に再プレーティングするための組織培養プレートを調製します。

DD7では、FGF2とIGF1が入ったKSR-N2と交換してください。DD8上で、滑らかにしたアゴニストで細胞を再播種し、非定型PKC阻害剤を添加します。DD10で、PKCiが入ったKSR-N2のメディアを交換してください。

DD11で、FACSのプレートからセルを取り外します。細胞がDD11上のFACS用にデタッチされていなかった場合は、aPKCiを含むKSR-N2を使用してDD12上のメディアを交換します。DD14 で、aPKCi を含む KSR-N2 のメディアを交換します。

また、DD16では、PKCiを含むKSR-N2のメディアを交換してください。次に、DD17でNkx-2.1:mCherry陽性細胞を採取します。ここに示されているのは、分化12日目の培養からのNkx2.1、Nkx2.1:mCherry、およびLhx6:GFPの免疫染色の代表的な画像です。

これらの画像は、同じ視野からオーバーラップするチャネルであることに注意してください。このグラフは、培養中のDD12でNkx2.1を発現するDAPI陽性核の平均割合の定量化を示しています。そして、これは代表的なFACSプロットであり、当社のデュアルレポーターmESCラインを使用して単離できる4つの異なる細胞集団を示しています。

mCherryはx軸上にあり、GFPはy軸上にあります。したがって、右上のボックスは、mCherry-GFPダブルポジティブの細胞を表しています。以下は、DD6から16までのNkx2.1:mCherryおよびLhx6:GFP誘導の時間経過であり、mCherryのみ発現する細胞、GFPのみ発現する細胞、またはmCherry-GFP共発現する培養細胞の割合で表されます。

このプロトコルを習得すると、適切に実行すれば、開始から終了まで17日以内に完了することができます。この手順を試みるときは、常に胸膜全能性で未分化の健康な幹細胞から始めることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、新生児または成体マウス新皮質への移植などの他の方法を実行して、インターニューロンの運命決定またはインターニューロン移植が回路機能および動物の行動に及ぼす影響に関する追加の質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、発生神経科学の分野の研究者が、マウス、ひいては介在ニューロン関連障害の影響を受けた患者の介在ニューロン運命決定を促進する要因を探求する道を開きました。このビデオを見れば、マウス胚性幹細胞からNkx2.1を発現する前駆細胞とその有糸分裂後の子孫を導出する方法を十分に理解できるはずです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。