哺乳類の細胞分裂量的共焦点反射顕微鏡を介して 3 D 行列

この手順の全体的な目標は、生理学的に関連性のある3D環境で哺乳類の細胞分裂と細胞マトリックスの相互作用を研究することです。この手法の主な利点は、哺乳類の細胞分裂と細胞マトリックスの相互作用を研究するための効率的で一般的なアプローチを提供することです。この方法は、正常組織と疾患組織の発生の分子基盤など、細胞生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。

トランスフェクションの前日に、100ミリリットルの細胞培養皿に500万個のHEK-293 T細胞を10ミリリットルの正常細胞培養培地にプレートします。これらの細胞を摂氏37度で24時間インキュベートし、5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーターでインキュベートします。トランスフェクションを開始する直前の翌日、トランスフェクション試薬のバイアルを摂氏4度から取り出し、室温に戻します。

次に、まず、1ミリリットルの還元血清培地を滅菌マイクロチューブに加えます。これに、トランスフェクションに使用するレンチウイルスベクタープラスミドを指定量加え、ピペッティングで混合します。チューブを室温で5分間インキュベートします。

5分後、このチューブに48マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加え、ピペッティングで穏やかに混合します。その後、この混合物を室温で少なくとも15分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、HEK-293 T細胞の入ったプレートをインキュベーターから取り出します。

調製したDNAトランスフェクション試薬混合物を細胞上にゆっくりと滴下し、プレートを静かに渦巻かせてプレート内に均一に分布させます。プレートをインキュベーターに戻します。トランスフェクションの約6時間後、プレートを取り出し、培地を吸引します。

10ミリリットルの新鮮な培地を加え、プレートをインキュベーターに戻します。トランスフェクション後24時間、48時間、72時間の複数の時点で、レンチウイルス粒子を含む培地を別々のチューブに回収します。次に、回収した培地を滅菌済みの0.45ミクロンフィルターでろ過し、細胞の破片を取り除きます。

収穫のたびに新鮮な培地と交換してください。レンチウイルス粒子を含む濾液は、すぐに形質導入に使用することも、摂氏マイナス80度で保存することもできます。ヒト乳がん細胞MDA-MB-231を正常培地中の35mm培養皿にプレート化します。

これらの細胞を摂氏37度で24時間インキュベートし、5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーターでインキュベートします。翌日、プレートから培地を吸引し、1ミリリットルのレンチウイルス粒子と1ミリリットルの新鮮な培地を加えます。インキュベーター内で細胞を約16時間インキュベー

ウイルス粒子とのインキュベーションが完了したら、プレートを取り外して培地を吸引します。次に、2ミリリットルの新鮮な培地を加え、24〜72時間インキュベーターに戻します。これらの形質導入細胞におけるH2B-mCherryの発現を落射蛍光顕微鏡を用いて確認します。

同期実験を開始するには、まず、H2B-mCherryを発現するMDA-MB-231細胞を50〜60%のコンフルエント度で24ウェルプレートにプレートします。培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。翌日、培地を2ミリモルのチミジンを含む0.5ミリリットルの培地と交換します。

プレートをインキュベーターに24時間放置します。インキュベーションが完了したら、細胞をPBSで3回洗浄して、チミジン処理から細胞を放出します。次に、細胞を0.5ミリリットルの通常の培養培地にインキュベーターで5時間放置します。

この後、有糸分裂でこれらの細胞をブロックするために、ノコダゾールを培地に加えます。細胞をインキュベーターに12時間放置します。ノコダゾール治療終了後、プレートを取り出し、オービタルシェーカーを用いて細胞を45秒から1分間振とうし、有糸分裂細胞を放出します。

続いて、抽出した有糸分裂細胞を含む培地を新しい遠心分離チューブに移します。次に、各ウェルに0.5ミリリットルの新鮮な培地を追加します。その後、細胞の振とうと抽出をさらに2回繰り返します。

収集した培地全体をプールし、遠心分離機で有糸分裂細胞をペレット化します。スピン後、細胞ペレットを0.25ミリリットルの新鮮な細胞培養培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して、細胞の数を数えます。

このステップの開始時に、50ミリリットルの10x DMEM溶液を調製し、それをろ過滅菌します。次に、テキストプロトコルで指定されている3Dコラーゲンマトリックスの作成に使用されるすべての成分の体積を決定します。これらすべての成分を氷の上で事前に冷やして、コラーゲンのゲル化を遅らせます。

次に、あらかじめ冷却した1.5ミリリットルの遠心チューブに、必要な数の細胞を培地に加え、次に10x DMEM、FBS、脱イオン水、コラーゲン、最後に水酸化ナトリウムを加えます。1ミリリットルのピペットを使用して慎重に混合します。溶液が十分に混合されたら、500マイクロリットルの混合物を24ウェルプレートの各ウェルに加えます。

24ウェルプレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。30分後、プレートを取り出し、ゲルの上に500マイクロリットルの予熱した培地を加えます。イメージングの前に、位相差顕微鏡と共焦点顕微鏡の生細胞ユニットの電源を入れます。

分裂する細胞を捕捉するには、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた細胞を含む24ウェルプレートを蛍光顕微鏡の生細胞ユニットに配置します。10倍対物レンズを使用してプレートの底を見つけ、顕微鏡がプレートの底から約500マイクロメートルに焦点を合わせるまで上に移動します。ステージを動かして、有糸分裂のさまざまな段階にある細胞を見つけ、イメージングのために複数の位置を選択します。

タイムラプス実験を 2 分間隔で設定します。次に、コラーゲンネットワークをイメージングするために、488ナノメートルレーザーからの反射光のみを捕捉するように共焦点顕微鏡を構成します。次に、コラーゲンマトリックス中の細胞を含むプレートをこの顕微鏡の生細胞ユニットに入れます。

プレートの底部を見つけてから、対物レンズを上に動かして、プレートの底面から約100マイクロメートルのところにピントを合わせます。ステージを動かして細胞を見つけ、イメージングのために複数の位置を選択します。タイムラプス実験を 5 分間隔で設定します。

コラーゲンマトリックスに埋め込まれた分裂性H2B-mCherry発現MDA-MB-231細胞の蛍光像を示します。有糸分裂のさまざまな段階は、予想どおりに容易に観察されます。共焦点反射顕微鏡を使用して同時に視覚化された白色のコラーゲン線維の分布は、有糸分裂の過程でほとんど変化しません。

G2-M期と同期した細胞をコラーゲンマトリックスに包埋すると、最初の2時間で細胞分裂が完了し、制御非同期細胞はランダムに分裂します。間期および有糸分裂期におけるコラーゲン線維の分布の定量化は、細胞分裂中のマトリックス変形が最小限であり、間期細胞ではそれ以上であることが示唆されています。この手法を習得すれば、安定細胞株の生成から3Dマトリックスでのビデオ細胞分裂の解析まで、7日間で完了することができます。

このビデオをご覧いただければ、ライブセルイメージングを使用して3Dマトリックス内の哺乳類細胞分裂を同期およびモニタリングする方法や、共焦点反射顕微鏡法と定量的イメージング解析技術を使用してマトリックスの変形を決定する方法について、十分に理解できることを願っています。