架橋 (TXL) 近視治療の組織の評価ツールとしてウサギの強膜の第 2 高調波発生信号

このプロトコルの全体的な目標は、ホルムアルデヒド放出剤のサブテノンの注入によって誘発され、示差走査熱量測定で確認されたように、強膜組織におけるコラーゲン架橋効果を視覚化および測定するための第2高調波発生顕微鏡法の使用を実証することです。この方法は、誘導された架橋効果を評価するための非侵襲的な方法を提供することにより、治療用組織架橋の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、第2高調波生成シグナルがコラージュフィブリルに非常に特異的であるため、抗体染色などの特別な組織調製が不要であることです。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、治療用角膜組織の架橋に適用される手順について読んだときでした。第2高調波発生顕微鏡法を成功させるには、組織を慎重に配置し、正しいイメージング条件を設定して、シグナル測定における組織の損傷やアーティファクトを防ぐ必要があるため、この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。テキストプロトコルで説明されているように、ウサギの眼球にほぞ下注射で治療を開始します。

ここに示すのは、サブテノンの注入部位の概略図です。目の大きさに合わせて最適なサイズの検鏡を選びます。3時間半のインキュベーション後、眼瞼鏡を使用して眼瞼を引っ込め、球体へのアクセスを最適化します。

輪部を囲む結膜を分離し、強膜挿入部位の余分な眼筋を切断します。はさみまたは刃を使用して強膜の上部を切断し、注射部位が中央に位置するように1センチメートルの領域を作成します。残りの網膜層と脈絡膜層をこすり落とし、新鮮なPBSで2回洗い、毎回約10秒間溶液に入れます。

PBS溶液で満たされた1ミリリットルのチューブに組織をセットし、イメージング施設に輸送します。SHG顕微鏡検査を行う際に信号と分解能を最大化するには、赤外光を透過するように最適化され、開口数の多い対物レンズを使用します。サンプルの深さに合わせてレンズの補正環を調整します。

この場合、0.17ミリメートルです。25倍の対物レンズを顕微鏡に取り付け、レンズ表面を覆うために水ベースの浸漬ジェルをたっぷりと追加します。サンプルを顕微鏡にマウントしてから30分以内に組織イメージングを行うことは、組織の水和を維持し、レンズ対物レンズとスライドの間の浸漬ゲルの乾燥を防ぐために重要です。

セルチャンバーの底部に25mmの丸いカバースリップを配置して、セルチャンバーを組み立てます。強膜ティッシュをカバースリップに置き、50〜100マイクロリットルの緩衝液を追加します。ティッシュを2つ目の丸いカバーで覆い、ティッシュを押したり平らにしたりせずに、チャンバーの上部にスリップしてねじ込みます。

次に、組織サンプルを載せた細胞チャンバーを顕微鏡ステージにマウントします。ステージを配置し、対物レンズの高さを調整して、サンプルの下面が接眼レンズによる明視野検査によって決定されるように焦点が合うようにします。コンピューターモニター以外のすべての照明をオフにし、顕微鏡ステージにアルミホイルシートを掛けてモニターからの光

ソフトウェアで、アイポートモードをオフにします。TI パッド パネルで、レンズの定義が正しいことを確認します。A1 Compact Graphical User Interfaceパネルで、イメージング用の赤外線レーザーを選択し、Non Descanned Detectorsを選択し、400〜450ナノメートルのバンドパスフィルターを備えたDAPIチャンネルを選択します。

A1 Multi Photonグラフィカルユーザーインターフェースパネルで、赤外線レーザーの波長を860ナノメートルに設定し、シャッターを開きます。緑色のライトが点灯するように発光波長が変化するまで待ちます。A1 Compact グラフィカルユーザーインターフェースパネルでレーザースキャン条件を設定するには、ガルバノスキャナー、ユニット指向性スキャン、フレームサイズ 1024 x 1024 ピクセル、ピクセル滞留時間 6.2 マイクロ秒、ライン平均 2X を選択します。

次に、検索モードでライブイマジングをオンにし、AI Compact Graphical User Interfaceパネルでレーザー出力と検出器のゲインを調整してイマジン条件を設定します。レーザー出力を 50 ミリワットから 150 ミリワットの間、つまり 860 ナノメートルのレーザーの場合は 2% から 6% の間に設定します。この範囲を超えると、組織の損傷が発生する可能性があります。

現在の画像のピクセル強度値のヒストグラムを表示するルックアップテーブルパネルを開き、HVラベル付きバーの検出器のゲインをさらに調整して、彩度を回避しながらピクセル値の範囲を最大化します。SHG信号が最も多いサンプルを使用して、最適なレーザーとゲインの設定を見つけます。1 回の実験で比較するすべてのサンプルの設定を同じにします。

この方法により、実験のサンプルが検出器を飽和させないようにします。プレビューモードの組織をスキャンするには、XYZ概要ツールを開きます。このモードでの画像取得を高速化するには、イメージングを低解像度に設定します。

XYZ概要パネルで、現在の位置を右クリックし、scan five x five、three by three、またはsingle view captureを選択します。スキャンが終了したら、現在のプレビュー領域の外側の領域をダブルクリックして、新しい場所に移動します。ライブスキャンモードをオンにしてから、組織の異なる領域が軸方向にわずかに異なる位置を持つ可能性があるため、組織に焦点を合わせます。

新しい 5 x 5、3 x 3、または 1 つの視野をキャプチャします。組織の大部分がプレビューされるまで、このプロセスを繰り返します。XYZオーバービューツールで、視野全体にコラーゲン繊維が見える位置をダブルクリックして、ステージをその特定の場所に移動します。

イメージングを高解像度、1024 x 1024ピクセル、2Xライン平均に設定します。ライブ検索モードをオンにし、ボトムプレーンにピントが合うように対物レンズの位置を調整し、TIパッドでZドライブを使用して光学面をこの最下層の10マイクロメートル上に移動します。キャプチャボタンを使用して画像を取得し、XYZレビューツールのプラスボタンで場所を保存します。

新しい場所をダブルクリックし、深度調整と画像キャプチャのプロセスを繰り返します。ティッシュの各ピースについて、10枚の画像をキャプチャします。ビューのフィールドは、XYZ 概要ツールで保存された位置で示されるように重ならないようにする必要があります。

最後に、顕微鏡検査が完了した直後に、その後の示差走査熱量測定分析の準備として、強膜片をPBSの入った1ミリリットルのチューブに入れます。まず、コントロールの中央部分を切り取り、はさみで強膜を治療します。各強膜の正方形を吸収性組織で乾燥させ、歯付き鉗子を使用してDSC鍋の底に平らに置きます。

ティッシュを内側に置き、唇を圧着して覆った状態で、ティッシュの湿った重量を得るために鍋の重さを量ります。次に、秤量したサンプルをDSCオートサンプラートレイの指定の場所に置きます。装置管理ソフトウェアを使用してメソッドを作成し、組織の重量を指定し、テキストプロトコルに記載されている周囲を使用して熱分析を実行します。

完了したら、装置イメージングソフトウェアを使用して熱変性が発生する転移温度ピークを抽出し、各サンプルのデータを分析します。強膜のSHG画像は、平均ピクセル輝度についてフィジーで分析されました。イメージを開き、[解析] メニューを選択してから [測定] を選択すると、信号の平均輝度を含む結果を含むテーブルが開きます。

または、[解析] メニューの [ヒストグラム] を選択して、画像内の信号の平均輝度と変動に関する情報を含むピクセル強度値のヒストグラムを作成します。この測定は、コントロールサンプルと架橋サンプルからのすべての画像に対して繰り返されました。ここでは、平均輝度を含むヒストグラム分析を伴う強膜の代表的なSHG画像を示します。

対照サンプルは、線維の波状配置によって特徴付けられます。ここに示されているのは、400ミリモルSMGと架橋されたサンプルで、ピクセル強度が増加し、コラーゲン繊維がよりまっすぐに見えることがわかります。熱解析の結果、変性温度のピークが高いことが示され、架橋効果が確認されました。

対照サンプルと、400ミリモルの架橋サンプル変性曲線が示されています。このビデオを見れば、架橋サンプルの調製方法と、強膜サンプルのSHG顕微鏡法の実施方法について十分に理解できるはずです。一般に、この方法に不慣れな個人は、ほぞ下腔への正確な注射に苦労し、注射部位の周りの正方形を外科的に抽出し、プレビューモードで組織をスキャンするための画像条件を設定します。

この手順に続いて、定量や形態学を含むエラスチン分析など、追加の質問に答えるために、自己成長などの他の方法を実行できます。この架橋剤送達技術の意味は、強膜の安定化を目的として後極へのアクセスを容易にするため、高近視および後部ブドウ腫の治療にまで及びます。この顕微鏡技術の意味は、高近視やコラーゲンの弱化によって引き起こされる合併症の診断にまで及びます。これは、罹患した強膜のコラーゲン架橋の状態を測定することや、目的の架橋手術が完了した後の結果を測定することにより、コラーゲンが弱くなる

したがって、この架橋法と第2高調波発生顕微鏡法は、強膜架橋に関する洞察を提供することができ、角膜、皮膚、軟骨、腱、心臓弁、血管などの他の組織にも適用できます。