Name: 架橋 (TXL) 近視治療の組織の評価ツールとしてウサギの強膜の第 2 高調波発生信号 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学ぶ 第2高調波発生顕微鏡を用いたウサギ強膜のコラーゲン架橋可視化法。サブテノン注射によるホルムアルデヒド遊離剤の効果を評価し、組織工学における治療的架橋評価に有用な非侵襲的手法を確立する。

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著者はありがとう sT インジェクション; 相談 Tongalp Tezel、MD は、テレサ Swayne、PhD、SHG 顕微鏡に関する相談デザインと生物統計学のリソースとコロンビア大学医療センターでアーヴィングの研究所の統計中核施設からジミー ビンズオン。
失明を防ぐために研究や健康補助金傘下 UL1RR024156 の国家機関、ネイ P30 EY019007、NCI P30 CA013696、ネイ R01EY020495 (DCP) 部分的にサポートされています。コロンビア大学関連の知的財産を所有している: 米国発行特許 no: 8,466,203 および no: 9,125,856。国際特許出願中: PCT/US2015/020276。
画像を集めた、共焦点、およびコロンビア大学、NIH 支えのハーバート ・ アーヴィング総合がんセンターの専門顕微鏡共有リソースに付与 #P30 CA013696 (国立癌研究所)。NIH で共焦点顕微鏡を購入した #S10 RR025686 を与えます。

そのままザイモグラム ウサギ頭内の死体の家兎眼を使用してすべての手順を行った。ケアと実験動物の使用のためのすべての公共機関や国立のガイドラインが続いていた。
1. 溶液の調製
<ol><li>TXL の SMG の準備:<ol>
<li>0.0165 g nahco 3 粉末 1 mL の蒸留水に溶解したを使用して炭酸水素ナトリウム ソリューション (NaHCO3) 水溶液 0.2 M 濃度の 1 mL を準備します。</li>
		<li>0.1016 mg ナトリウム粉末 hydroxymethylglycinate (SMG) を 800 mM SMG の最終的な集中を取得する蒸留水 1 mL に溶かしてください。最終濃度 0.1 M NaHCO3および 400 mM SMG に重炭酸ナトリウム溶液を調整します。希望の架橋効果に応じて SMG の濃度。ここで説明したプロトコルでは、40、100、および 400 ミリメートル SMG を使用しました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. TXL SMG を使用テノン嚢下の注入
<ol><li>それぞれ 400 μ L コントロールと SMG ソリューション 1 mL インスリン注射器 2 (25 G 針) を入力します。</li>
	<li>クッションの助けを借りてプロファイル平面にウサギの頭を配置します。発泡スチロールや紙のスタックは、最適な位置で頭を修正する使用できます。</li>
	<li>小児眼科鏡でまぶたを撤回します。</li>
	<li>球面収差トノメトリ デバイスを使用して初期眼内圧 (眼圧) を測定します。</li>
	<li>組織マーカーと角膜の上部中央部分に目的の注入のサイトをマークします。</li>
	<li>結膜結膜鉗子 (または鋸歯状の丸い先端の鉗子) 注射部位を周囲を撤回して、ほぞのカプセル マークの輪部サイト (すなわち2-3 を越えてわずかに入る結膜を通して針を挿入角膜輪部から mm)。結膜小切開は、ほぞのカプセルに針を刺しての通過を促進するためにアイリス ハサミで行うことが。</li>
	<li>一度ほぞのカプセル内で左右に移動することによって針を自由自在に移動がであることを確認します。この時間の間に世界中を移動しないでください。これは、サブ-ほぞの (sT) で強膜上針の適切な配置を確認するスペース。</li>
	<li>注射器から溶液を注入し、針を破棄します。注入直後流体は、結膜 (すなわち、結膜浮腫) を通して見た前部の膨らみを作成する sT 領域に蓄積されます。</li>
	<li>世界中の不注意による穿孔による変わらなかったことを確認するためには、眼圧測定を繰り返します。</li>
	<li>蓋鏡を削除し、約 2-3 分の閉じたまぶたを通じてデジタル マッサージを実行します。</li>
	<li>3.5 時間の潜伏期間の頭を残す (部屋の温度 18 ° C を =)、次のステップに移動する前に。</li>
</ol>3. ティッシュの準備
<ol><li>世界へのアクセスを最適化するためにまぶたの鏡を使用してまぶたを撤回します。目の大きさに応じて最適なサイズの鏡を選択します。</li>
	<li>周辺角膜輪部結膜を区切ります。注射部位近く切開されている, は約 1 × 1 cm の接種量が含まれますのでに円周方向の境界線を拡大します。</li>
	<li>強膜挿入のサイトで外眼筋をカットします。</li>
	<li>鉗子、後方から押すと眼球を昇格させます。これは後部の世界へのアクセスを提供し、眼動脈と静脈の世界中の後極の近くにある視神経の切断を容易に。</li>
	<li>カットして角膜を複雑なマークの注射部位を含む外側の境界線と。汚れは、強膜の残りの部分に表示されているはずです。</li>
	<li>コーパス硝子体とティッシュ鉗子でトラクションを適用することで、強膜の内側に接続されているすべてのレイヤーを削除します。 注: 以降の手順によって異なります次術: 4. - DSC 分析、5 - SHG 顕微鏡。</li>
</ol>4. 地域の DSC 分析のため
<ol><li>
処理の目:はさみでの残りの強膜のカップから 4 強膜分野をカットし、そのように、注射部位は上部のセクターに位置し、中心部に配置。(すなわち、鼻と時間)、側面と下部の両方から残りの 3 セクターをカットします。 注: は正方形 (1-16) に更に分けられる部門 (1-4) の番号図 1 aに示されています。</li>
	<li>4 x 4 mm 程度の小さな正方形 (1-16) に強膜のセクター (1-4) をカットします。セクター 1 は分割 9 の正方形 (正確な注射部位個々 の四角形の「角 2」を作る) 必要があります。2 と 3 に 2 の正方形 (正方形 10-11 と 12-13) のセクターとセクター 4 3 正方形 (14-16 の正方形) に分割できます。</li>
	<li>注入された領域の位置から分析された組織の距離をローカライズするために図 1 aで示すように、それぞれの正方形に番号を割り当てます。</li>
	<li>
コントロールの目:次の場所から組織の四角い部分をカット 4 強セクター (扱われたティッシュに類似) に組織を分割後: 3 トップ部門 (部門 1) から正方形の各側面 (セクター 2 と 3) とから 1 から 1、下のセクター (セクター 4)。</li>
	<li>残りの網膜と脈絡膜の層をこすり落とすし、約 10 のためのソリューションに浸漬部分を残して毎回新鮮な PBS で 2 回洗う時に s。</li>
</ol>5. SHG イメージング用
<ol><li>はさみを使用して中心部に配置する注射部位に 1 × 1 cm の領域を作成する強膜の上の部分をカットします。</li>
	<li>残りの網膜と脈絡膜の層をこすり落とすし、新鮮な PBS で 2 回洗うたびに約 10 のためのソリューションの作品を残して s。</li>
	<li>場所 1 mL 管組織イメージング施設への輸送のための PBS ソリューションでいっぱい。次の培養時間と眼球の解剖で始まるすべての手続きは、1 時間以内に行わなければなりません。</li>
</ol>6. 顕微鏡検査のプロトコル
注: 強膜組織のコラーゲンからイメージングの後方散乱 SHG 信号をこのプロトコルはレーザー顕微鏡用にカスタマイズします。
<ol><li>
顕微鏡のセットアップ
	<ol>
<li>最大化するには、光と高開口数 (NA) は、赤外線を送信する信号と SHG 顕微鏡を実行する対物レンズを使用するときの解像度を最適化します。私達の目的はニコン Apo LWD 25 x/NA1.1 水浸漬。</li>
		<li>カバーガラス、0.17 ミリの厚さであるこの場合、サンプルの深さに合わせてレンズの補正カラーを調整します。</li>
		<li>25 x 対物レンズをマウントし、サンプルをマウントする前に画像の表面をカバーするためのゲルの水ベースの潤滑油の寛大な量を追加します。水ベースのジェルは実験中に蒸発しないとそれ故に画像の品質を維持します。</li>
		<li>上と coverslip 表面間の最大接触を提供する 2 つの 25 mm ラウンド coverslips (ダウン上強膜側) の間を乾燥させず PBS で 1 mL 管から強膜組織を配置します。 注: 組織も配置できます覆いを取られた上。PBS の良い量は、画像の中に水和組織を保つ必要があります。この場合、cellchamber を組立後組織片と PBS を追加します。</li>
		<li>25 mm ラウンド coverslip、単一を置くことによってまたは商工会議所の下の部分に、サンドイッチ法で細胞チャンバーを組み立てるし、商工会議所丸シールを作成するために上部のスクリュー ダウン。しっかりとトップ coverslip 使用する場合、人為的に平坦化を避けるために、組織を損傷するためにダウンを台無ししていません。</li>
		<li>顕微鏡ステージ上細胞チャンバー内に組織サンプルをマウントします。</li>
		<li>透過光と目ビュー顕微鏡を設定します。</li>
		<li>ステージを置き、目的の高さを調整して、サンプルの下面は、フォーカス、目の部分を明視野検査によって決定されます。</li>
		<li>コンピューター モニター以外のすべてのライトをオフにし、顕微鏡ステージ上にドレープ アルミ箔シートで、できるだけモニターからできるだけ多くの光をブロックします。GaAsP NDD 探知機は高い感度を持っていると検出器に到達する任意の迷光を最小限に抑える低騒音取得いたします。</li>
		<li>ソフトウェアの Ti パッド パネルでレンズの定義が正しいことを確認します。</li>
		<li>A1 コンパクトな GUI パネルでイメージング用 IR レーザーを選択し、NDD 探知機 400-450 nm のバンドパス フィルターを装備した DAPI チャネルを選択します。</li>
		<li>A1 MP GUI パネルで 860 nm とオープンに赤外線レーザーの波長を設定シャッター。</li>
		<li>レーザー スキャン A1 コンパクトな GUI パネルで条件を次のように設定します。選択: (a) ガルバノスキャナー、(b) 単方向スキャン、(c) ピクセル ドウェル時間 6.2 μ s、(d) フレーム サイズ 1,024 x 1,024 ピクセル、(e) 2 x の平均線 注: ガルバノスキャナーと一方向のスキャン ポイントの正確なアライメントを保証します。1,024 x 1,024 の全視野の大きさは 0.5 μ m/pixel のピクセル サイズに変換します。ラインの平均はイメージでショット ノイズを低減します。</li>
		<li>レーザー パワーと検出器ゲインを調整することによってイメージング A1 コンパクトな GUI パネルで条件を設定します。現在のイメージのピクセルの輝度のヒストグラムが表示されますテーブル ・ ルックアップ テーブル パネル (Lut) を開きます。"Find"モードでライブ イメージングをオンにし、レーザー パワーと検出器ゲインを調整することによりピクセル値の検出の範囲を最大化します。飽和を避けるため。典型的な値は、2.5% のレーザー出力を 2.35 860 W の合計から nm と 100 HV (検出器ゲイン)。</li>
		<li>注: このセットアップでは、内部の電力計で測定したレーザー パワーは 5.2 mW。5.2 内部電力が一定レーザー割合を再調整実験を行うたびにイメージング セッション間 mW。レーザー パワーを設定するときに注意が必要があります。カメレオン II レーザーが 800 で 3 W レーザー nm、10% またはより高い電力組織の損傷を引き起こすことができる可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
画像の取得
	<ol>
<li>プレビュー モードで XYZ 概要ツールを使用して組織の領域をスキャンします。</li>
		<li>このモードでは画像の取得を高速化する低解像度 (256 x 256 ピクセルおよびラインの平均) に画像を設定します。</li>
		<li>5 x 5、3 x 3、または組織の表面全体をカバーする単一のフィールドの表示をキャプチャします。概要キャプチャする前に、それぞれの場所でライブ「スキャン」モードをオン焦点組織を持って来る。組織のさまざまな地域が軸方向にわずかに異なる位置にあることに注意してください。</li>
		<li>コラーゲン線維が視野全体で見られるし、概要ツールの特定の場所にステージを移動することでその位置をダブルクリックして、平坦な領域を見つけます。</li>
		<li>ライブ「スキャン」モードをオン目的の Z 位置を調整して底面は、フォーカスし、Ti パッドこの下部層上の 10-15 μ m 光の平面を移動する Z ドライブを使用。</li>
		<li>1,024 x 1,024 ピクセルと 2 x ラインの平均、「キャプチャ」ボタンを使用して高解像度で画像を取り込みます。</li>
		<li>「+」ボタンを使って XYZ 概要内の場所を保存します。これにより、組織の同じ領域を奪還しないこと。</li>
		<li>組織の各部分の非重複するビューのフィールドの 10 の画像をキャプチャします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. DSC プロトコル
注: は、ティッシュの準備が完了したら、地域の DSC 分析または組織イメージング SHGM が実行される後すぐにこの手順に進みます。
<ol><li>DSC 鍋、秤量し、ラベルを準備します。 注: この手順は、組織の乾燥を最小限に抑えるため組織切離前に提示されるべきであります。</li>
	<li>吸収性組織とそれぞれの強膜の正方形を乾燥し、歯の鉗子を用いた DSC 鍋の底にそれを置きます。</li>
	<li>内部組織と圧着蓋を鍋の重さし、濡れている重量、組織を取得するカバー (サンプルの質量は 5 に 11 mg の範囲でする必要があります)。 注: 各シールは、次の組織サンプルに進む前にクリンパを使用してパンします。鍋密閉され、熱分析の前に任意の水損失を防ぐします。</li>
	<li>一度サンプルを圧着すると、DSC トレイ上の指定された場所に配置します。コントロールの 6 サンプルと扱われた目の 16 があるはずです。</li>
	<li>ソフトウェアの管理、組織の重量を指定する器具を使用してメソッドを作成し、次のパラメーターを使用して熱伝導解析を実行: 加熱速度 40 に 80 ° C の温度範囲: 1 ° C/分、熱流: 17.37 mW、気流 (N2): 19.8 mL/分ガス圧力: 2.2 バー。</li>
	<li>完了すると、どの熱変性の遷移温度ピークが発生するソフトウェアの管理計測器を使用して抽出することにより各サンプルのデータを分析します。</li>
</ol>8. 画像解析
<ol><li>
SHG 信号
	<ol>
<li>イメージの領域は、ほとんど膠原線維で占められているように少なくとも 5-10 のそれぞれの治療のコントロールから最も代表的な画像を選択します。</li>
		<li>ImageJ ソフトウェア内の各画像をアップロードし、選択して平均輝度を測定分析 > メジャーアクティブなイメージに。</li>
		<li>抽出した値平均輝度として報告され、メニューから選択することによって強度のヒストグラムをプロットすることによって表示することも分析 > ヒストグラム。</li>
		<li>それに応じてすべての測定データを記録するテーブルを作成する Excel シートを使用してサンプル ID に</li>
		<li>平均と治療と制御条件ごとにピクセル強度の標準偏差を計算します。</li>
		<li>使用して学生の t テスト、(すなわち、対 0 と 400 ミリメートル SMG 0 対 40 mM SMG) 濃度のすべての対比較のための違いを比較します。[P≤0.05]。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
うねり
	<ol>
<li>コラーゲン線維を表示するイメージを選択します。サンプルあたりの少なくとも 10 の画像は、(それぞれの濃度 - 合計 40 少なくともコントロールのサンプルを含む) 分析必要があります。</li>
		<li>オープンImageJ > プラグイン > NeuronJ。NeuronJには、以前のインストールが必要です。</li>
		<li>開かれたNeuronJウィンドウにドラッグするすべての imagesby をアップロードします。</li>
		<li>マウスで線維の輪郭をたどる線維に沿ってトレース行を作成 (描画タブレット ペンが使用することができる)、総繊維長の距離を測定する M をクリックします。</li>
		<li>接線方向直線を描画し、開始以前に描いた繊維輪郭の端に接続する「オプション」を選択します。エンド ツー エンドの長さを測定する M をクリックします。</li>
		<li>画像ごとに少なくとも 10 の線維に同じ手順を繰り返します。</li>
		<li>10 線維のそれぞれからこれら 2 つの測定値を収集し、それぞれ長 [曲線]、[リニア] 長として総繊維長さ (輪郭) と (ストレート ラインを接続する) エンド ツー エンドの長さを表現する、excel スプレッドシートにデータを入力します。</li>
		<li>計算式を使用して波打ち指数 (W): W = [曲線] の長さ/長さ [リニア]。</li>
		<li>式を使用してコントロールのサンプルからイメージで扱われる samples(SMG) の画像からデータを比較のうねりの % の計算: (W [SMG] - 1)/(W [制御] - 1)</li>
		<li>さまざまな治療条件とコントロールのコラーゲン繊維形態の統計的違い (p 値) を決定するために波打ち指数 (W) のペアワイズ t 検定を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

コラーゲン架橋強、トリートメントを架橋用監視ツールとしてこのテクニックを使用しての将来の可能性を高める効果の評価方法として SHG 信号顕微鏡の使用を支持する証拠が示されている実験を行ったコラーゲン蛋白質をターゲットします。注記のうち、楽器は既にこの SHG 信号をキャプチャすることができます潜在的臨床使用中です。この楽器がイメージングの皮膚皮膚の真皮用では主に、イメージ角膜と強膜23に正常にそれ使用されています。
同一スキャンおよびコントロールを比較するときの条件を画像処理を維持するために必要なサンプルを扱います。強膜組織におけるコラーゲンの顕微鏡は蛍光顕微鏡多光子イメージングとの互換性を必要とする第 2 高調波発生パルス赤外レーザー 800-900 nm の波長範囲と、GaAsP など高感度検出器で可変非 descanned (NDD) 検出器。本稿で説明するガイドラインは、開始地点です。新しい実験用または別のシステム条件を決定する必要があります。
角膜と強膜も評価されていま...

近視の進行は仮定することが (光化学および化学)、非酵素的に強膜架橋を通じて治療実験フォーム剥奪 (FD) を増やすことができますコラーゲン酵素架橋ブロックことを考えれば理にかなっている-誘導近視1。Elsheikh とフィリップスの2は最近可能性と標準的な紫外線照射 (UVA) の使用の可能性を議論-リボフラビンを介した光化学架橋 (ドレスデン プロトコル) 省略 (リボフラビン CXL) として近視で軸の伸長を停止する後部強膜安定化。この光化学メソッドは、正常に円錐角膜とレーシックの記事 keratectasia に見られる前部グローブ サーフェス (すなわち、膨らんだ角膜) の不安定化を治療するために使用されています。ただし、強膜のこの CXL プロトコルのアプリケーションが多く大きい組織表面領域を変更する必要性と同様、紫外線 (UV) 光源と後部強膜へのアクセスの難しさに関連する問題によって妨げられています。言われて、CXL アプローチに使用されている視覚的にフォームで体軸の伸長を停止奪わウサギ (瞼板縫合)、後部強膜の複数の領域は、研究3で複数の独立した照射ゾーンが必須。対照的に、聖空間を介して化学安定剤 (すなわち、架橋剤) 注入は、後部強膜、紫外線光源を導入することの必要性を回避するを変更する簡単な方法を表すことができます。この注入法白内障手術4,5,6など眼科処置中に眼麻酔を誘導する便利な方法として知られています。ウォレン サック7は以前グリセルアルデヒド (化学架橋剤ホルムアルデヒド エージェント (Far) 本を解放する概念と似ています) を使用して sT インジェクションの使い方を説明してウサギ強膜と genipin を固くにはFD モルモット8,9の軸方向の長さを制限するために示されています。これらの調査官は、光化学 CXL 法上可溶性化学薬品を使用しての明確な利点を示しています。強膜の架橋 (すなわちTXL) ファールスを含むいくつかのタイプの注射薬剤を使用して10近視で強膜の伸長の進行を食い止めるための可能な治療法を提供できます。
ここで紹介するプロトコル、死体の家兎眼の強膜に sT インジェクションを介して配信されるナトリウム hydroxymethylglycinate (SMG) の化学架橋のソリューションを使用します。我々 は、角膜局所化学架橋以前に類似したプロトコルを実装しています。これらの報告された調査で特に依存効果を架橋濃度は熱変性解析11 によって決定される光化学 CXL の達成もまたがる効果範囲を持つ SMG を使用して得ることができた.
ここで我々 は強膜組織、差動スキャン熱量測定 (DSC)、および第 2 高調波発生顕微鏡 (SHGM) を使用して熱変性する sT 注射を介して配信 SMG の架橋効果を評価するためにプロトコルを説明します。
差分走査熱量測定 (DSC)、熱分析とも呼ばれますを使用して熱変性転移測定、強膜組織は主にそれらはバルクの大部分を構成するので、フィブリル型コラーゲンの性質によって導かれてタンパク質。このメソッドには、コラーゲン分子構造の安定性とコラーゲン線維、主要タンパク質立体構造の安定化架橋結合が評価されます。DSC で加熱中に臨界転移温度は三重らせん、ゼラチンと呼ばれる一般的形成プロセスの上体で、コラーゲン分子の変性の結果が達成されます。この熱変性コラーゲン分子に水素結合を中断され、誘導架橋方法12,13を通して高温にシフトすることができます。このメソッドは、革の意思を含むプロセス、特に生体材料業界で長年にわたり使用されています。ただし、このメソッドは強膜組織の抽出を必要とし、したがって前のヴィヴォ手法として有用することができますのみ。
第二高調波発生顕微鏡 (SHGM) は、非中心対称性分子環境に、特定の物質の非線型光学特性に基づいています。そのような材料は、強烈な光でたとえば光レーザーによって生成される、SHG 信号、周波数 2 倍は入射光を生成します。コラーゲン、微小管、筋ミオシン、SHG 信号を作成する知られている生物学的材料。たとえば、コラーゲン 860 nm の波長の赤外光と興奮は 430 nm の波長の可視範囲の SHG 信号を出力します。第二高調波発生 (SHG) 信号のイメージング、治療コラーゲン架橋を評価するための有望な方法です。それは、組織のコラーゲン線維を放出 SHG 信号1430 年以上知られています。しかし、ごく最近高解像度の画像を取得でした15といったさまざまな組織、腱16皮膚、軟骨17、18血管とコラーゲン ゲル19。
この知識に基づいて、本研究は、SMG は化学的に誘導されるコラーゲンの架橋を通じて強膜で SHG 信号の変化を評価します。強膜の SMG 変更組織コラーゲン線維束 (高次第四紀構造コラーゲン線維から成る) から生成された SHG 信号を増加させるし、もコラーゲンの構造の形態学的変化を生成を示唆します。ファイバー網繊維束」矯正」に反映

<table><tbody><tr><td>MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V</td><td>EMD Millipore, Massachusetts, USA</td><td></td><td>二重蒸留、脱イオン水。 - プロトコルステップ1.1.1ヒ</td></tr><tr><td>ドロキシメチルグリシン酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA</td><td></td><td>架橋試薬 - プロトコルステップ 1.1.2</td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ付き注射針</td><td>BD Eclipse, NJ, USA</td><td></td><td>シリンジ サブテノン注射用シリンジ - プロトコルステップ 2.1</td></tr><tr><td>ウサギの頭</td><td>La Granja poultry</td><td>Outbered</td> ウサギ<td>の頭を分離し、死後 1 時間以内に配送 - プロトコルステップ 2.2</td></tr><tr><td>遠野ペン&nbsp;</td><td>Reichter Technologies Depew, NY</td><td></td><td>IOP測定 - プロトコルステップ 2.4</td></tr><tr><td>DSC 6000 オートサンプラー</td><td>Perkin-Elmer Waltham, MA, USA</td><td></td><td>熱変性分析装置 - プロトコルステップ7.4</td></tr><tr><td>Pyrisソフトウェア&nbsp;</td><td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA</td><td>Ver 11.0</td><td>&nbsp;プロトコルステップ 7.5</td></tr><tr><td>CFI75 アポクロマート LWD 25X/1.10 W MP</td><td>ニコンインスツルメンツ、メルビル、ニューヨーク、米国</td><td></td><td>作動距離 2.0 mm で高い IR 透過率を持つ水浸対物レンズ - プロトコルステップ 8.1.1。</td></tr><tr><td>ジェンティール&nbsp;</td><td>アルコン、フォートワース、テキサス州&nbsp;</td><td>B000URVDQ8</td> 蒸発<td>を防ぐために水の代わりに対物浸漬媒体として使用される水性ゲル - 8.1.1</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II&nbsp;</td><td>Coherent, Santa Clara,CA, USA</td><td></td><td>Ti:Sapphire パルスレーザ、パルス幅140 fs、80 MHz、チューナブル範囲680 nm〜1080 nm。 - プロトコルステップ 8.1.11</td></tr><tr><td>AttoFluor セルチャンバー</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>A7816</td><td>カバースリップの固定 - プロトコルステップ8.1.3</td></tr><tr><td>25mm丸型カバースリップ、#1.5</td><td>Neuvitro Corporation、バンクーバー、ワシントン州、 米国</td><td>GG-25-1.5</td><td>プロトコルステップ8.1.3</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E</td><td>Nikon Instruments、メルビル、ニューヨーク、米国</td><td></td><td>プロトコルステップ8.1.4。</td></tr><tr><td>ノンデスキャン(NDD)GaAsP検出器</td><td>Nikon Instruments社、米国</td><td></td>ニューヨーク州メルビル <td>400-450nmバンドパスフィルター搭載 - プロトコルステップ 8.1.7</td></tr><tr><td>A1R-MPレーザースキャンシステム</td><td>Nikon Instruments社、ニューヨーク州メルビル、米国</td><td></td><td>赤外線(IR)多光子励起に対応 - プロトコルステップ 8.1.8</td></tr><tr><td>NIS Elementsソフトウェア</td><td>Nikon Instruments社、ニューヨーク州メルビル、米国</td><td>Ver 4.3</td><td>本文中では「ソフトウェア」と表記されています - protocol step 8.1.9</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>&nbsp;プロトコルステップ9.1.2</td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>Eric Meijering、エラスムス大学医療センター、ロッテルダム、オランダ</td><td></td><td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/、プロトコルステップ9.2.2</td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp;</td><td>Microsoft Corporation、Redmond、WA、USA</td><td>Ver 14</td>プロトコル<td>ステップ9.2.8</td></tr></tbody></table>

架橋 (txl) 近視治療の組織の評価ツールとしてウサギの強膜の第 2 高調波発生信号

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

光化学架橋と組織 (TXL) メソッドを架橋構造蛋白質 (フィブリル型コラーゲン) 療法のために (非酵素的架橋) の化学結合を導入して組織を強化するためのメソッドが含まれます。機械的組織プロパティの変更を誘導するためこのような方法採用されている角膜に進歩的な近視で強膜と同様、円錐角膜などの角膜を薄く (機械的に弱体化) 障害の間伐と後部の弱体化強膜が発生し、体軸の伸長に寄与します。このような組織を強化するための主なターゲット蛋白質は、角膜と強膜の乾燥重量タンパク質の大多数を占めるフィブリル型コラーゲンです。偶然、フィブリル型コラーゲン組織の細胞外スペースの第 2 高調波発生信号の主な源であります。したがって、治療法、架橋により誘起されたものなど、コラーゲン蛋白質の変更可能性があります潜在的検出され、第 2 高調波発生顕微鏡 (SHGM) を使用して量的に表わされます。ソースは、生物医学の広まった使用法を楽しんでいる刺激的な現代のイメージング手法レーザー スキャン顕微鏡システム赤外線励起光結合を使用して信号 SHGM を監視します。したがって、本研究の測定する手段によるサブほぞの空間 (sT) に架橋剤の化学物質の注入、ウサギ強、 ex vivo架橋効果 SHGM 顕微鏡の使用を評価するために行われた、射出はアプローチは眼科臨床プロシージャ中に眼麻酔を引き起こすための標準的な方法です。化学架橋剤、ナトリウム hydroxymethylglycinate (SMG) は、エージェント (Far) を放出するホルムアルデヒドとして知られている化粧品の防腐剤のクラスからです。SMG との反応を伴う強膜の変化した SHG 信号の増加、熱変性温度の変化と相関を評価するための標準的な方法による架橋効果組織です。

TXL 架橋効果を評価するための測定法として熱変性温度 (Tm):16 組のウサギの目の合計は、TXL プロシージャのこれらの実験で使用されました。この研究の最初の部分、として死体のウサギの頭の中の sT 領域を通じて SMG 架橋剤の単回投与による架橋効果のローカリゼーションを行った。このタイプの実験は患者の臨床治療との関連性を以来、1 つ以上の場所に注射は強膜の目的の領域を安定させるために必要かもしれない。
基本的な拡散の原則に基づいて予測される効果だった最大注入のサイトで同様に、隣接する領域で、液の濃度によって効果が図 1 aは強膜分野 (赤い中空番号フォントで 1-4) (正方形 (1-16 黒の薄い番号フォントで) にさらに分割) 別の熱変性解析と単一セント注入を施行したの概略位置を表しますカラー マッピングのインデックス。表 1</...

このプロトコルでは、第二高調波発生のイメージングおよび示差走査熱量測定を使用してウサギの強膜の化学架橋を評価するための手法について説明します。

架橋 (TXL) 近視治療の組織の評価ツールとしてウサギの強膜の第 2 高調波発生信号

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

このプロトコルの全体的な目標は、ホルムアルデヒド放出剤のサブテノンの注入によって誘発され、示差走査熱量測定で確認されたように、強膜組織におけるコラーゲン架橋効果を視覚化および測定するための第2高調波発生顕微鏡法の使用を実証することです。この方法は、誘導された架橋効果を評価するための非侵襲的な方法を提供することにより、治療用組織架橋の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、第2高調波生成シグナルがコラージュフィブリルに非常に特異的であるため、抗体染色などの特別な組織調製が不要であることです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、治療用角膜組織の架橋に適用される手順について読んだときでした。第2高調波発生顕微鏡法を成功させるには、組織を慎重に配置し、正しいイメージング条件を設定して、シグナル測定における組織の損傷やアーティファクトを防ぐ必要があるため、この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。テキストプロトコルで説明されているように、ウサギの眼球にほぞ下注射で治療を開始します。ここに示すのは、サブテノンの注入部位の概略図です。目の大きさに合わせて最適なサイズの検鏡を選びます。3時間半のインキュベーション後、眼瞼鏡を使用して眼瞼を引っ込め、球体へのアクセスを最適化します。輪部を囲む結膜を分離し、強膜挿入部位の余分な眼筋を切断します。はさみまたは刃を使用して強膜の上部を切断し、注射部位が中央に位置するように1センチメートルの領域を作成します。残りの網膜層と脈絡膜層をこすり落とし、新鮮なPBSで2回洗い、毎回約10秒間溶液に入れます。PBS溶液で満たされた1ミリリットルのチューブに組織をセットし、イメージング施設に輸送します。SHG顕微鏡検査を行う際に信号と分解能を最大化するには、赤外光を透過するように最適化され、開口数の多い対物レンズを使用します。サンプルの深さに合わせてレンズの補正環を調整します。この場合、0.17ミリメートルです。25倍の対物レンズを顕微鏡に取り付け、レンズ表面を覆うために水ベースの浸漬ジェルをたっぷりと追加します。サンプルを顕微鏡にマウントしてから30分以内に組織イメージングを行うことは、組織の水和を維持し、レンズ対物レンズとスライドの間の浸漬ゲルの乾燥を防ぐために重要です。セルチャンバーの底部に25mmの丸いカバースリップを配置して、セルチャンバーを組み立てます。強膜ティッシュをカバースリップに置き、50〜100マイクロリットルの緩衝液を追加します。ティッシュを2つ目の丸いカバーで覆い、ティッシュを押したり平らにしたりせずに、チャンバーの上部にスリップしてねじ込みます。次に、組織サンプルを載せた細胞チャンバーを顕微鏡ステージにマウントします。ステージを配置し、対物レンズの高さを調整して、サンプルの下面が接眼レンズによる明視野検査によって決定されるように焦点が合うようにします。コンピューターモニター以外のすべての照明をオフにし、顕微鏡ステージにアルミホイルシートを掛けてモニターからの光をできるだけ遮断します。ソフトウェアで、アイポートモードをオフにします。TI パッド パネルで、レンズの定義が正しいことを確認します。A1 Compact Graphical User Interfaceパネルで、イメージング用の赤外線レーザーを選択し、Non Descanned Detectorsを選択し、400〜450ナノメートルのバンドパスフィルターを備えたDAPIチャンネルを選択します。A1 Multi Photonグラフィカルユーザーインターフェースパネルで、赤外線レーザーの波長を860ナノメートルに設定し、シャッターを開きます。緑色のライトが点灯するように発光波長が変化するまで待ちます。A1 Compact グラフィカルユーザーインターフェースパネルでレーザースキャン条件を設定するには、ガルバノスキャナー、ユニット指向性スキャン、フレームサイズ 1024 x 1024 ピクセル、ピクセル滞留時間 6.2 マイクロ秒、ライン平均 2X を選択します。次に、検索モードでライブイマジングをオンにし、AI Compact Graphical User Interfaceパネルでレーザー出力と検出器のゲインを調整してイマジン条件を設定します。レーザー出力を 50 ミリワットから 150 ミリワットの間、つまり 860 ナノメートルのレーザーの場合は 2% から 6% の間に設定します。この範囲を超えると、組織の損傷が発生する可能性があります。現在の画像のピクセル強度値のヒストグラムを表示するルックアップテーブルパネルを開き、HVラベル付きバーの検出器のゲインをさらに調整して、彩度を回避しながらピクセル値の範囲を最大化します。SHG信号が最も多いサンプルを使用して、最適なレーザーとゲインの設定を見つけます。1 回の実験で比較するすべてのサンプルの設定を同じにします。この方法により、実験のサンプルが検出器を飽和させないようにします。プレビューモードの組織をスキャンするには、XYZ概要ツールを開きます。このモードでの画像取得を高速化するには、イメージングを低解像度に設定します。XYZ概要パネルで、現在の位置を右クリックし、scan five x five、three by three、またはsingle view captureを選択します。スキャンが終了したら、現在のプレビュー領域の外側の領域をダブルクリックして、新しい場所に移動します。ライブスキャンモードをオンにしてから、組織の異なる領域が軸方向にわずかに異なる位置を持つ可能性があるため、組織に焦点を合わせます。新しい 5 x 5、3 x 3、または 1 つの視野をキャプチャします。組織の大部分がプレビューされるまで、このプロセスを繰り返します。XYZオーバービューツールで、視野全体にコラーゲン繊維が見える位置をダブルクリックして、ステージをその特定の場所に移動します。イメージングを高解像度、1024 x 1024ピクセル、2Xライン平均に設定します。ライブ検索モードをオンにし、ボトムプレーンにピントが合うように対物レンズの位置を調整し、TIパッドでZドライブを使用して光学面をこの最下層の10マイクロメートル上に移動します。キャプチャボタンを使用して画像を取得し、XYZレビューツールのプラスボタンで場所を保存します。新しい場所をダブルクリックし、深度調整と画像キャプチャのプロセスを繰り返します。ティッシュの各ピースについて、10枚の画像をキャプチャします。ビューのフィールドは、XYZ 概要ツールで保存された位置で示されるように重ならないようにする必要があります。最後に、顕微鏡検査が完了した直後に、その後の示差走査熱量測定分析の準備として、強膜片をPBSの入った1ミリリットルのチューブに入れます。まず、コントロールの中央部分を切り取り、はさみで強膜を治療します。各強膜の正方形を吸収性組織で乾燥させ、歯付き鉗子を使用してDSC鍋の底に平らに置きます。ティッシュを内側に置き、唇を圧着して覆った状態で、ティッシュの湿った重量を得るために鍋の重さを量ります。次に、秤量したサンプルをDSCオートサンプラートレイの指定の場所に置きます。装置管理ソフトウェアを使用してメソッドを作成し、組織の重量を指定し、テキストプロトコルに記載されている周囲を使用して熱分析を実行します。完了したら、装置イメージングソフトウェアを使用して熱変性が発生する転移温度ピークを抽出し、各サンプルのデータを分析します。強膜のSHG画像は、平均ピクセル輝度についてフィジーで分析されました。イメージを開き、[解析] メニューを選択してから [測定] を選択すると、信号の平均輝度を含む結果を含むテーブルが開きます。または、[解析] メニューの [ヒストグラム] を選択して、画像内の信号の平均輝度と変動に関する情報を含むピクセル強度値のヒストグラムを作成します。この測定は、コントロールサンプルと架橋サンプルからのすべての画像に対して繰り返されました。ここでは、平均輝度を含むヒストグラム分析を伴う強膜の代表的なSHG画像を示します。対照サンプルは、線維の波状配置によって特徴付けられます。ここに示されているのは、400ミリモルSMGと架橋されたサンプルで、ピクセル強度が増加し、コラーゲン繊維がよりまっすぐに見えることがわかります。熱解析の結果、変性温度のピークが高いことが示され、架橋効果が確認されました。対照サンプルと、400ミリモルの架橋サンプル変性曲線が示されています。このビデオを見れば、架橋サンプルの調製方法と、強膜サンプルのSHG顕微鏡法の実施方法について十分に理解できるはずです。一般に、この方法に不慣れな個人は、ほぞ下腔への正確な注射に苦労し、注射部位の周りの正方形を外科的に抽出し、プレビューモードで組織をスキャンするための画像条件を設定します。この手順に続いて、定量や形態学を含むエラスチン分析など、追加の質問に答えるために、自己成長などの他の方法を実行できます。この架橋剤送達技術の意味は、強膜の安定化を目的として後極へのアクセスを容易にするため、高近視および後部ブドウ腫の治療にまで及びます。この顕微鏡技術の意味は、高近視やコラーゲンの弱化によって引き起こされる合併症の診断にまで及びます。これは、罹患した強膜のコラーゲン架橋の状態を測定することや、目的の架橋手術が完了した後の結果を測定することにより、コラーゲンが弱くなることによるものとなります。したがって、この架橋法と第2高調波発生顕微鏡法は、強膜架橋に関する洞察を提供することができ、角膜、皮膚、軟骨、腱、心臓弁、血管などの他の組織にも適用できます。

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