Name: 神経変性疾患のマウスモデルで FITC 標識アルブミンの点滴静注による血液脳関門透過性の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学ぶ FITC標識アルブミンの頸静脈内投与によるマウス神経変性疾患モデルでの血液脳関門透過性評価法。この迅速かつ簡便な手法は、神経変性と関門損傷の関連解明に有用です。

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この作品が"Fondazione Neuromed"でサポートされている、健康参加する「Ricerca グラーヴェ」イタリア省の資金

動物のすべてのプロシージャは IRCCS Neuromed 動物介護審査会によって、承認された &#34; 会館 Istituto スペリオーレ ディ Sanità &#34; (許可番号: 1163/2015-PR) され、2010 年の EU 指令のガイドラインに従って/63/EU 動物実験。
 1 頸静脈に挿入される FITC-アルブミン溶液の調製 注: すべての実験が実施をマニフェスト (週齢 11) HD R6/2 マウス、時代、性別一致の野生型 (WT) コントロール。同腹子。
<ol><li>ディゾルブ FITC-アルブミン パウダー (材料表 参照) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 10 mg/ml で 。
	注: 最適な結果を得るには、このため準備されるべき新鮮な各ラベルの反応</li>。
</ol> 2。手術中に使用する機器の準備 <ol><li>以前オートクレーブの手術器具 (材料の表 を参照) をレイアウトします</li>。
	<li>はクリーン アルコール (70% エタノール溶液) で手術のベンチです。手術滅菌使い捨てタオル ドレープで外科領域 (45 cm × 45 cm) を準備し、営業の実体顕微鏡を設定します</li>。
</ol> 3。頸静脈へ FITC-アルブミン注入術 <ol><li>麻酔マウスの体重を記録します</li>。
	<li>麻酔マウス腹腔内注射 (i.p) ケタミン (100 mg/kg) - キシラジン (10 mg/kg) ソリューションの適切な投与量と</li>。
	穏やかなつま先ピンチによる <li>モニター動物鎮静反射を撤回は、Walantus ら に示すよう 11, 12.</li> <li>フェイス アップ仰臥位で麻酔下のマウスを置き、4 本の脚と尾を手術ワークベンチに粘着テープで固定します</li>。
	<li>電気カミソリで首に適切な外科的マージンを慎重に剃るマウスを確保した後 (材料の表 を参照) し、ポビドン ヨード ソリューションと 70% エタノールで消毒します</li>。
	<li>綿棒で露出剃毛表面を乾燥します</li>。
	<li>優しく剃毛の皮膚を引き上げ、1.5 cm 長い縦切開を行う、メス、鎖骨の中央で線胸部上中間の開始と首の下だけを拡張する.</li>
	<li>鉗子外頸静脈を公開する顕微鏡観察 (5 倍) の下で慎重に離れて結合組織を伸ばす</li>。
	<li>右側に、FITC-アルブミン液の注入用 30 G 針の挿入を容易にするために頸静脈の左側に十分なスペースを確保する</li>。
	<li>動物を静脈内注入 (右頸静脈) ゆっくり (3 分以上) 10 mL/kg FITC-アルブミンの 100 μ L に 30 G の針を使用しています</li>。
	<li>15 分後、斬首でマウスを安楽死させる急速に前述 13 として頭蓋骨から脳を取り除く、中古冷蔵イソペンタンの少なくとも 10 倍脳自体のボリュームで 15 分間浸します</li>。
	<li>中古冷蔵チューブに脳を冷凍イソペンタンを移動し、組織学的断面まで-80 ° C のフリーザーに保存します</li>。
</ol> 4。組織切片の脳を流し込んで FITC-アルブミン <ol><li>埋め込む最適な切削温度 (OCT) で脳を複合冷凍クライオスタットを区分する前に (材料の表 を参照してください).</li>
	<li>直列クライオスタットで 20 μ m 厚いセクションに脳を切る (材料の表 を参照)、顕微鏡用スライド グラスの上にそれらをマウントと</li>。
	<li>特定を用いて FITC-アルブミン/ラミニン共同染色を行う抗ラミニン抗体前述 6 の方法 (材料の表を参照してください).
	<ol><li>簡潔に、一次抗体の抗ラミニン (pAb 1: 1000) でセクションを一晩インキュベート、Cy3 標識適切な二次抗体を続行します</li>。
		<li>Coverslip スライド 4 を含むメディアをマウントを &#39;、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (吸収ピーク = 360 nm; 発光ピーク = 460 nm (材料の表 を参照してください).</li>
		<li>暗闇の中で 4 ° C で一晩乾燥してスライドのまま</li>。
		<li>蛍光顕微鏡下で染色する蛍光を観察 (材料の表 を参照してください) 両方の FITC 装備 20 倍の倍率で (吸収ピーク = 495 nm; 発光ピーク = 525 nm) および Cy3 フィルター (吸収ピーク = 550 nm; 排出量ピーク = 570 nm)。
		<ol><li>染色後すぐにサンプルを表示するのにはマニキュアを使用してコーナーで coverslip を確保し、(4.3.3) 上記として顕微鏡の下でそれらを検討します</li>。
		</ol></li></ol></li></ol> 5。蛍光顕微鏡を設定とカラー画像集録 <ol><li>蛍光顕微鏡を次のように設定します。
	<ol><li>蛍光ランプをオンに使用する前に約 10 分。顕微鏡、接続されているコンピューターやデジタル カメラをオンにします。画像解析ソフトウェアを実行 (材料の表 を参照してください).</li>
		<li>最適な信号収集および空間分解能の適切な目的を使用し、適切なフィルターを選択します</li>。
	</ol></li> <li>カラー画像の取得 <ol><li>画像解析ソフトウェアの [live] コマンドを選択 (材料の表 を参照してください)、各フィルターの最適な照明のパラメーター設定</li>。
		<li>単一チャネルのカラー画像を取り出してスケールバーを追加 [凍結] コマンドを選択する (&#39; 編集 &#62; を燃やすスケール &#39;)</li>
		<li>内の各イメージを保存、&#39; .tiff &#39; 形式</li>。
		<li>を選択してチャンネルを単一のイメージにマージ &#39; ファイル &#62; マージ チャネル &#39; の保存と、</li>
		<li>tiff &#39; 形式</li>。
		<li>脳スライス (スライドごと 6 セクション) ごと (2200 μ x 3400 μ m) を写真 4 の 24 ビット色の最小値を取得します</li>。
	</ol></li></ol> 6。FITC-アルブミン漏出の評価 <ol><li>自由に利用できる ImageJ 14 , 15 を使用して各単一チャネルの蛍光強度を分析します</li>。
	<li>合計各画像ごとラミニン CY3 蛍光強度による FITC-アルブミンの全蛍光信号強度を正常化し、グリーンの蛍光強度として血管外管外アルブミンを報告します</li>。
</ol>

<ol><li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).</li>
<li>Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the blood-brain barrier.</a> Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).</li>
<li>Moretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+dysfunction+in+disorders+of+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain.</a> Front Neurosci. 9, 40(2015).</li>
<li>Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Dysfunction+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier.</a> Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).</li>
<li>Drouin-Ouellet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+and+blood-brain+barrier+impairments+in+Huntington%27s+disease%3A+Potential+implications+for+its+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology.</a> Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).</li>
<li>Di Pardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+blood-brain+barrier+is+an+early+event+in+R6%2F2+mouse+model+of+Huntington+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease.</a> Sci Rep. 7, 41316(2017).</li>
<li>Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier+Leakage+in+Early+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease.</a> Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).</li>
<li>van de Haar, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier+Leakage+in+Patients+with+Early+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease.</a> Radiology. 282 (2), 615(2017).</li>
<li>Fernandez-Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+permeability+is+increased+after+acute+adult+stroke+but+not+neonatal+stroke+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat.</a> J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).</li>
<li>Yang, Y., Rosenberg, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+acute+and+chronic+cerebrovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease.</a> Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J Vis Exp. (9), e404(2007).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>McCloy, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).</li>
<li>Burgess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+human+Greatwall+results+in+G2+arrest+and+multiple+mitotic+defects+due+to+deregulation+of+the+cyclin+B-Cdc2%2FPP2A+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).</li>
<li>Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+after+embolic+stroke+in+rats+occurs+without+ultrastructural+evidence+for+disrupting+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions.</a> PLoS One. 8 (2), e56419(2013).</li>
<li>Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+the+blood-brain+barrier+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease.</a> Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).</li>
</ol>

著者がある利益相反を開示するには

我々 はここで説明する手法は、主に脳疾患条件下で BBB の漏れを検出するため便利です。BBB の機能不全が多様な神経学的疾患4の共通の特徴として注目されています。我々 は以前 HD6のようなまれな神経変性疾患のマウスモデルで BBB 整合性の初期の異常を説明するのにこのアプローチを使用します。
このメソッドは、相対的な簡易性の利点と正確で信頼性の高い結果を提供するプロシージャの有効性を取ります。それは高感度プレクリニカル ・ リサーチ ツールを表す、スピードと BBB の中断を断面化された脳組織内の蛍光グリーンのシンプルな可視化による質的評価を提供しています即時性のため便利です。ただし、生化学および分子の分析と組み合わせると、テクニックの BBB の相関解析を許可が血管内皮 TJs の構造と機能の整合性についての定量的な情報を提供することに成功したと脳のホメオスタシスを中断。
高分解能電子顕微鏡による<sup class="xre...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56389/assessment-blood-brain-barrier-permeability-intravenous-infusion-fitc">Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease</a>. One of the author&#39;s names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione

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Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

中枢神経系 (CNS) 内の恒常性は、適切なコミュニケーションと神経細胞の機能のための前提条件です。中枢神経系柔密によって封鎖される周辺から、内皮細胞血液脳関門 (BBB)、末梢血流と脳との間のインターフェイスを表し、これらの 2 つの地区の1 間のクロストークで極めて重要な役割を果たしています。 ,2。BBB は複雑な専門マイクロ血管内皮細胞) 細胞複合体 - タイトな接合 (TJs) - によって互いにリンク、囲まれて周を主体とする立体構造物の動的ニューロン終末とアストロ サイトの足プロセス1,2。
生理学的な条件の下でそのまま BBB の非常に低透磁率により、脳の栄養素および他の分子の輸送の厳しい規制とにより中枢神経系の変化からユニークな保護、潜在的な末梢神経活動に影響を与える可能性があります血液の組成は、1,2,3を侮辱します。
BBB の整合性および高められた透磁率の中断長い神経の多くの重要な機能を構成するため知られている、神経変性障害4ただしハンティントンの病気 (HD)5,6, を含む、かどうかこのような機能不全が原因の現象や病気の過程で繁殖イベントはまだ不明です。BBB 破壊のタイミングもとらえどころのないまま、しかし、中断の BBB の整合性が、後半イベント早期のステップ6ではなく、病気の進行で,7を表さないことを示します出現の私達のグループと他の証拠,8、長期的な影響を持っている可能性があります。
これを念頭において、早熟役に立つ病気の進行と脳損傷を予測し、正常に代替しよりターゲットを絞った介入できるを開発する戦略を開発するために神経変性の BBB の内訳を明らかにすることが重要です。このような混乱の臨床結果を軽減します。したがって、BBB 減損の信頼性の高い画像は、脳疾患の診療・研究の主要な重要なのです。
本稿では高分子量フルオレセイン イソチオ シアン酸ラベル-アルブミン (FITC-アルブミン) を使用して、HD マウス モデルの BBB 透過性の評価の成功と単純な手順をについて説明します。通常、脳実質にバリアを越えることはできません FITC-アルブミンの漏出を BBB 漏れの指標として測定しました。この手法は、ラットと cerebrovasculature 障害9,10によって特徴付けられる他の病理学の条件に容易に適応可能であります。

<table><tbody><tr><td>アルブミンフルオレシンイソチオシアネートコンジウゲート</td><td>SIGMA</td><td>A9771-100MG</td><td></td></tr><tr><td>pAb 抗ラミニン</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-144</td><td></td></tr><tr><td>CY3 抗ウサギ ヤギ製</td><td>MILLIPORE</td><td>AP132</td><td></td></tr><tr><td>SUPERFROST PLUS</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ 24 X 50 mm</td><td>Thermo Scientific (DIAPATH)</td><td>61050</td><td></td></tr><tr><td>Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound</td><td>Bio Optica</td><td>05-9801</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 封入剤</td><td>VECTOR</td><td>H-1500</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>iNSu/Light Insulin 付き封入剤 ディスポーザブルシリンジ</td><td>RAYS Health &安全</td><td>INS1ML26G13</td><td></td></tr><tr><td>30G 1/2 "</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td>インスリンのための針 使い捨てシリンジ</td></tr><tr><td>メスのハンドル</td><td>F.S.T.91003-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#22 使い捨てメスのblads</td><td>F.S.T.</td><td>10022-00</td><td></td></tr><tr><td>ファインアイリスハサミ 10.5cm</td><td>F.S.T.</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>デュモン鉗子 #5745 45°; 0.10 x 0.06 mm</td><td>F.S.T.</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子 10 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>デュモン鉗子 #5 0.1 X 0.06 mm</td><td>F.S.T.</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>医療パッチ</td><td>Medicalis</td><td>34788</td><td></td></tr><tr><td>滅菌使い捨てタオル ドレープ</td><td>Dispotech</td><td>TVO50VE</td><td></td></tr><tr><td>立体顕微鏡</td><td>NIKON</td><td>SMZ 745 T</td><td></td></tr><tr><td>光学イルミネーター LED ライト (C-FLED2)</td><td>NIKON</td><td>1003167</td><td>立体顕微鏡用光学イルミネーター</td></tr><tr><td>エクリプス Ni-U 顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>932162</td><td>落射蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>顕微鏡 デジタルカメラ</td><td>ニコン</td><td>DS-Ri2</td><td>顕微鏡カメラ</td></tr><tr><td>Intenslight</td><td>ニコン</td><td>C-HGFI</td><td>顕微鏡ランプ</td></tr><tr><td>NIS-Elements 64ビット</td><td>ニコン</td><td>AR 4.40.00</td><td>分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>電気カミソ</td>リ <td>Gemei</td><td>GM-3007</td><td></td></tr></tbody></table>

神経変性疾患のマウスモデルで fitc 標識アルブミンの点滴静注による血液脳関門透過性の評価

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

血液脳関門 (BBB) 整合性の破壊は、異なる神経と神経変性疾患の一般的な機能です。開発と BBB の変化を正確に検出する信頼性の高いプロシージャの検証が重要であるし、便利なツールを表す摂動の BBB の恒常性と脳疾患の病態との間の相互作用は、さらなる調査を必要とするが潜在的疾患を予測するためターゲットを絞った治療戦略を進行と開発。
ここでは、BBB の BBB 透過性の欠陥は明らかに早熟で検出可能なハンチントン病のマウスの前臨床モデルで発生するそのような変性条件で漏れを評価するための簡単で効率的な手順を提案します。病気。具体的には、高分子量かにラベル (FITC)-アルブミン、後者は障害時にのみ、BBB を交差することがあるがマウスの頸静脈と血管や実質地区におけるその分布に鋭く融合その後、蛍光顕微鏡によって決定されます。
脳実質の緑色蛍光アルブミンの蓄積異常 BBB 透過性の指標として機能し、J の画像処理ソフトウェアを使用して量的に表わされるとき緑の蛍光強度として報告されます。

FITC-アルブミン血流から緑色の蛍光トレーサーの BBB は脳 parenchymawhen に血管外漏出に頸静脈結果の適切な注入は、6を妥協しました。生理学的な条件の下で注入蛍光アルブミンの分布は脳の血管の内側に制限と周囲の血管領域や脳実質内に信号が検出できなかった (図 1 a、顕微鏡写真で、トップ)。逆に、BBB 神経病理学的状況下で危険にさらされて FITC-アルブミンの血管周囲スペースに沿うそして脳実質 (図 1 a, 顕微鏡下に) びまん性蛍光パターンが表示されます。血管マーカー染色、ラミニン、はっきり FITC-アルブミン蓄積 (図 1 a) のサイトのローカライズに使用されます。侵害された BBB FITC-アルブミンによって放出される増加緑蛍光画像処理ソフトを使用して評価された (材料の表を参照...

本研究では神経変性条件下で血液-脳関門の破壊を評価するための簡単で効率的な手順を提案する.我々 の目的を達成するために我々 は高分子量かにラベル (FITC) を注入-マウス頸静脈にアルブミン静脈および蛍光顕微鏡による脳実質にその漏洩を評価します。

神経変性疾患のマウスモデルで FITC 標識アルブミンの点滴静注による血液脳関門透過性の評価

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

この手順の全体的な目標は、FITC標識アルブミンの頸静脈内注射により、変性疾患のマウスモデルにおける脳血液関門透過性を評価することです。この方法は、脳の恒常性の研究における主要な質問に答えるのに役立ちます。血液脳関門の損傷と神経変性との間の可能性のある関連を調査することは、特に有用です。この技術の主な利点は、迅速かつ簡単に実行でき、より大きな動物モデルや他の神経病理学的設定にも適用できることです。FITC-卵白の頸静脈内注射の外科的処置を実演するのは、ルカ・カポッチです。サルヴァトーレ・カスタルドは、脳の組織学的切片形成を実演します。また、Enrico Amicoは、顕微鏡写真取得の手順を実演します。まず、FITC卵白粉末をリン酸緩衝生理食塩水に10ミリグラム/ミリリットルで溶解することにより、FITC卵白溶液を調製します。オートクレーブ滅菌された手術器具をレイアウトします。手術用ベンチを70%エタノールで洗浄し、手術用滅菌使い捨てドレープを置きます。次に、操作用の実体顕微鏡をセットアップします。適切なケタミンキシラジン溶液の腹腔内注射でマウスを麻酔した後、つま先を優しくつまんで動物の鎮静を監視し、離脱反射がないことを確認します。.麻酔をかけたマウスを仰向けの位置に置き、4本の脚と尻尾を粘着テープで手術台に固定します。マウスを固定した後、首の適切な手術用マージンを慎重に剃り、70%エタノール中のポビドンヨード溶液で消毒します。露出した削った表面を綿棒で乾かします。次に、鎖骨中央部に胸部の中間から首のすぐ下まで1.5cmの縦切開を行った後、顕微鏡観察下で鉗子で結合組織を慎重に引き離し、外頸静脈を露出させます。FITC卵白溶液の注入のための30ゲージ半ゲージ針の挿入を容易にするために、頸静脈の右側と左側に十分なスペースを確保します。.100マイクロリットル/ミリリットルあたり10ミリグラムのFITC卵白を右頸静脈に3分間かけて注入します。これは、手順で最も重要なステップです。針の挿入を誤ると、静脈壁に不可逆的な損傷を与え、実験全体を損なう可能性があります。注射の15分後、マウスを斬首して安楽死させた後、頭蓋骨から脳を急速に取り出し、脳の10倍である予め冷却したイソペンタンの量に15分間浸します。イソペンタン凍結脳を予め冷却したチューブに移し、組織学的切片になるまで摂氏80度の冷凍庫で保存します。凍結した脳を最適な切断温度のコンパウンドに埋め込んでから、クライオスタット切片化を行います。クライオスタットで脳を20ミクロンの厚さに切り取り、顕微鏡のスライドガラスに取り付けます。FITCアルブミンラミニン共染色は、前述のように、特異的な抗ラミニン抗体を用いて行います。DAPIを含む封入剤でスライドスライドを覆い、暗所で4°Cで一晩乾燥させます。翌日、FITCフィルター

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神経科学

このビデオでは、フルオレセインナトリウム分子を使用してin...

血液脳関門模倣透過性アッセイ:トレーサー分子に対するBBB模倣物の透過性を評価するためのIn vitroアッセイ

このビデオは、EAEマウスモデルにおける血液脳関門の破壊を評価する手順を示しています。さまざまなサイズの蛍光色素が眼窩後方向に注入され、脳の血管を循環します。小さい色素は隙間から脳組織に漏れますが、大きい色素は混乱が深刻な場合にのみ入り、バリア損傷の程度と相関します。...

EAEマウスモデルにおける蛍光色素を用いた血液脳関門破壊の決定

このビデオは、遊離FITCおよびFITCをロードしたフェリチンを使用して、膜インサート上の星状細胞と内皮細胞を使用して、in...

In Vitro血液脳関門モデルによるFITCおよびFITC-フェリチンの浸透の研究

ラット脳微小血管内皮細胞とアストロサイトの共培養に基づく血液脳関門のin...

Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

血液脳関門の機能障害の動物モデルに適用可能な灌流が続く蛍光トレーサーの腹腔内注入によるマウス脳血管透過性アッセイをご紹介します。1 逸見脳は、透水性の定量的評価と可視化トレーサー/染色の他に使用されます。10 匹のマウスに 5-6...

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

この手順の全体的な目標は、虚血性脳卒中のモデルラットの血液脳関門の破壊の生体内評価の再現性の高い技術を提供することです。...

虚血性脳卒中のモデルラットの血液脳関門の破壊のIn Vivo評価

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の障害を調査するためのプロトコルを紹介します。具体的にはグリア limitans...

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

中枢神経系腫瘍にターゲティングは大きな課題です。ここで我々 はマウスやヒトの細胞を用いた血液脳腫瘍関門の in vitro...

皿に血液脳腫瘍-障壁を使用して生体ペイロード配信で予測

このプロトコルは、げっ歯類の脳サンプルの同じセット上の虚血性脳損傷の3つの最も重要なパラメータを測定する新しい技術を記述する。1つの脳サンプルのみを使用することは、倫理的および経済的コストの面で非常に有利である。...

げっ歯類の脳サンプルの単一のセットで脳卒中後脳浮腫、梗塞ゾーンおよび血液脳関門破壊を測定する

血液脳関門(BBB)の破壊による色素の血管外漏出を可視化する方法として、異なる時点のマウスに2種類の蛍光色素を投与することで可視化する方法を開発しました。グリセロールを凍結保護剤として使用すると、同じサンプルでの免疫組織化学が促進されました。...

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

このプロトコルは、エヴァンの青色色素ベースの評価を使用して、成体ゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)モデルの血液脳関門(BBB)の完全性を評価する信頼性の高い方法を提示し、神経血管破壊の定性的分析と定量的分析の両方を可能にします。...

ゲートキーパーの視覚化:成体ゼブラフィッシュにおける血液脳関門透過性のEvanの青色色素ベースの評価

学ぶ FITC標識アルブミンの頸静脈内投与によるマウス神経変性疾患モデルでの血液脳関門透過性評価法。この迅速かつ簡便な手法は、神経変性と関門損傷の関連解明に有用です。

神経変性疾患のマウスモデルで FITC 標識アルブミンの点滴静注による血液脳関門透過性の評価

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