Name: MEK 阻害剤 PD0325901 とビタミン C を用いたマウス胚性幹細胞のゲノムの低いメチル化を維持するために代替カルチャ メソッド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学ぶマウス胚性幹細胞の低メチル化維持法。PD0325901とビタミンCを用いて多能性と優れた細胞形態を保持する培養プロトコルを解説。幹細胞生物学研究に有用です。

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この作品は、国家自然科学基金、中国の (21435008、h. w. に 21327006) と中国の科学アカデミーの戦略的な重点研究課題によって支持された (h. w. を XDB14030200)。

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li>
<li>Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> Plos One. 8 (12), e81156(2013).</li>
<li>Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM14+ensures+naive+pluripotency+through+dual+regulation+of+signaling+and+epigenetic+pathways+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li>
<li>Smith, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+regulatory+phase+of+DNA+methylation+in+the+early+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo.</a> Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+induction+of+Id+proteins+suppresses+differentiation+and+sustains+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+collaboration+with+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3.</a> Cell. 115 (3), 281-292 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+pluripotency+is+associated+with+global+DNA+hypomethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).</li>
<li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li>
<li>Yin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+Tet-mediated+5-methylcytosine+oxidation+and+promotes+DNA+demethylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).</li>
<li>Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+modulates+NF%CE%BAB+phosphorylation+and+enhances+antimicrobial+activity+against+Staphylococcus+aureus+in+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells.</a> Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171(2017).</li>
<li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+Tet+protein-mediated+5-methylcytosine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).</li>
<li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-dependent+loss+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos.</a> Science. 334 (6053), 194(2011).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Maiti, A., Drohat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymine+DNA+glycosylase+can+rapidly+excise+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%3A+Potential+implications+for+active+demethylation+of+CpG+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites.</a> J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).</li>
<li>Habibi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+bisulfite+sequencing+of+two+distinct+interconvertible+DNA+methylomes+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).</li>
<li>von Meyenn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+DNA+methylation+maintenance+is+the+main+cause+of+global+demethylation+in+naive+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).</li>
<li>Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEK+inhibitor+PD0325901+and+vitamin+C+synergistically+induce+hypomethylation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells.</a> Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).</li>
<li>Hackett, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+mechanisms+of+DNA+demethylation+during+transition+to+ground-state+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency.</a> Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).</li>
<li>Nakaki, F., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM14%3A+a+unique+regulator+for+pluripotency+and+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming.</a> Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22855723">Pluripotency in the embryo and in culture.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).</li>
</ol>

著者は潜在的な利益相反を開示ないです。

仕事で行った Vc と PD0325901 未分化と hypomethylated 州は、Vc によって DNA 脱メチル化を促進し、 de novo DNA の抑制の相乗作用によって達成されたマウスの ES 細胞を維持するために組み合わせるの手法PD0325901 によるメチル化。また、マウスの ES 細胞は、Vc/PD0325901 文化システムの下で偉大な形態を示した。
良い Vc/PD0325901 培養系におけるマウス ES 細胞の状態を維持、いくつかの重要な手順があります。まず、FBS バッチを見つけるし、最高のバッチを買いだめする事前選別する必要があります。また、血清の交換の頻度は細胞増殖し、多能性の維持に支障をきたすです。第二に、ピペッティング セルに単一細胞懸濁液に細胞コロニーの解離細胞の道の段階の間に避けます。第三に、細胞培養中にトリプシンの悪影響を減衰させる細胞を継代した料理でセルをカバーした直後にトリプシンが除去されるべき。また、Vc/PD0325901 培は Vc の不安定なため毎日置き換える必要があります。
<p class="...

ES 細胞は胚盤胞1の ICM に由来します。細胞は多能性の状態で、すべての体細胞系列と生殖細胞2を形成することができます。ES 細胞の樹立は、開発を調査する機会の in vitroを処理し、多能性3に基づく再生医療医療関連性の細胞を生成することができますを提供します。
2 つのグループは、1981 年にマウス ES 細胞を形づくる設立し、初期のマウス胚由来細胞がウシ胎児血清 (FBS) で培養したとき-フィーダー層の1,4 としてマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) 媒体を含む.MEFs 有糸分裂不活化された ES 細胞を培養する前に料理で育った事前.MEFs は、マウス ES 細胞接着と伝播を促進し、FBS は不可欠な栄養因子と細胞増殖のホルモンを提供しています5分化を抑制する成長因子の生成をサポートします。その後の研究は、LIF フィーダー細胞によって産生された自己複製とマウス ES 細胞の多能性維持のためのキーのサイトカインと培地へ添加 LIF フィーダー細胞6の代わりに示されます。現在、FBS/LIF 中の餌箱にマウス ES 細胞の維持はまだ多くの研究者によって採用された標準的な方法です。しかし、この古典文化のアプローチをいくつかの問題が発生します。まず、フィーダー細胞は過剰と制御されていない要因を分泌して7病原汚染を引き起こす可能性があります。血清含有 LIF 添加ゼラチンで料理の表面をコーティング、この干渉を避けるために媒体がフィーダー層セルを持たないマウスの ES 細胞を維持するための代替方法です。さらに、血清/LIF 条件下で栽培したマウス ES 細胞は、細胞集団とも8多能性関連因子の発現レベル形態学的多様性を示します。最近の研究は血清/LIF の条件下で (SOX2, Nanog、OCT4 など) コアの多能性関連転写因子は LIF と WNT シグナル伝達; 多能性を維持できるお勧めただし、特に、彼らもアクティブに分化8をトリガーする線維芽細胞成長因子 (FGF) 信号。コア転写因子のどっちつかずのデュアル アクションによるマウス ES 細胞無血清培養は ICM およびプライミング胚盤葉上層の状態8に似た別に類似した 2 つの交換可能な集団から成るの不均一性を提示します。また、血清中マウス ES 細胞はしばしばグローバル領域のメチル化9を展示する一方、ICM と PGCs の多能性9,10と密接にリンクされているグローバル hypomethylated 状態で。
マウスの ES 細胞を培養するための新しい方法を開発するかなりの需要があります。200311以降いくつか改良されたプロトコルが確立されているが、いくつかの制限事項と短所7が継続します。PD0325901 の 2 つ・小分子キナーゼ阻害剤の結合された使用率、2008 年以来 (マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) の阻害剤/細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) (MEK)) と CHIR99021 (グリコーゲン合成酵素の阻害剤キナーゼ 3 (GSK3)) の培養マウス ES 細胞12N2B27 LIF と血清中が新たな視点を開いたが。この新しい定義された媒体は、2 つの阻害剤 (2 i) の使用によって特徴付けられます。2i/LIF 培地で培養したマウス ES 細胞より均一な細胞集団で多能性因子の発現。加えて、2i LIF 培養したマウス ES 細胞示す DNA 低いメチル化グローバル、ICM のような細胞9,13に近づいています。それでも、2i 文化は、その欠点を持っています。PD0325901 と CHIR99021 が水で溶けるとジメチルスルホキシド (DMSO) で一般に溶解している-ベースの培地でそれらを追加するストック ソリューション。研究は長期的なことを示したが、DMSO にセルの低線量の露出が細胞毒性14につながることができます。
ここでは、我々 は 2 つの低分子化合物を利用、マウス ES 細胞の新しい培養法を開発。新規培養法は、Vc、MEK 阻害剤 PD0325901 DNA 低いメチル化を急速に促進するためを結合し、効果的に Vc/PD0325901 培養プロトコルとして名前を PGC の対等なレベルに。マウス ES 細胞血清含有培地の Vc/PD0325901 追加の形態で均一性を展示し、基底状態の持続します。2i 文化と比較して、Vc/PD0325901 条件下で培養したマウス ES 細胞は DNA 脱メチル化の高速動力学を展示し、PGC に匹敵する低いメチル化レベルに到達することができます。さらに、単一の阻害剤 (PD0325901) の使用減少と比較して 2 i で使用中に DMSO の投入量 (PD0325901/CHIR99021) と細胞へのダメージを軽減。

<table><tbody><tr><td>ウシ胎児血清 オーストラリア ソース</td><td>Corning</td><td>35-076-CV</td><td>マウスES細胞培地の成分</td></tr><tr><td>DMEM/高グルコース</td><td>ハイクロン</td><td>SH30022</td><td>マウスES細胞培地の成分</td></tr><tr><td>LIF</td><td>ミリポア</td><td>ESG1107</td><td>マウスES細胞培地の成分</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸(NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>マウスES細胞培地</td></tr><tr>の成分<td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>マウスES細胞培地の成分</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>マウスES細胞培地の成分</td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン溶液</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>マウスES細胞培地の成分</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td> 細胞はトリプシン<td>をすすぎます</td></tr><tr><td></td><td>Hyclone</td><td>SH30042</td><td>細胞解離</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td>48722</td>皿<td>コーティング</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemolecule</td><td>04-0006-10</td><td>細胞培養用低分子薬品</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemolecule</td><td>04-0004</td><td>細胞培養用低分子薬品</td></tr><tr><td>ビタミンC</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd&nbsp;</td><td></td><td>細胞培養のためのXW00508171低分子化学物質</td></tr><tr><td>ウルトラバイオサイエンス 浄水システム</td><td>Purelab</td><td>ウルトラ</td><td>ウルトラ水</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ</td><td>D8418</td><td>細胞凍結培地</td></tr><tr><td>遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5427R</td><td>DNAおよびタンパク質抽出</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>シグマ</td><td>P8340</td><td>RIPAバッファー</td></tr><tr>の成分<td>PMSFプロテアーゼ阻害剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>36978</td><td>RIPAバッファーの成分</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>RIPAバッファーの成分</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>RIPAバッファーの成分</td></tr><tr><td>ゲノムDNA精製キット&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td>ゲノムDNA抽出</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>DNA濃度の定量</td></tr><tr><td>ウシ腸ホスファターゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0290</td><td>DNA消化</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0303</td><td>DNA消化ヘ</td></tr><tr><td>ビ毒ホスホジエステラーゼI</td><td>シグマ</td><td>P4506</td><td>DNA消化</td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C35</td><td>Filtration of digested DNA</td></tr><tr><td>1290 UHPLC system</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>1290</td><td>UHPLC分離</td></tr><tr><td>G6410Bトリプル四重極質量分析計</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>G6410B</td><td>MS/MS 分析</td></tr><tr><td>Zorbax Eclipse Plus C18 カラム</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>UHPLC分離のための</td><td>Zorbax Eclipse Plus</td>のcolume</tr><tr><td>5-methylcytosine</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SM8900&nbsp;</td><td>標準 5mC</td></tr><tr><td>5-ヒドロキシメチルシトシン (標準)</td><td>トロントリサーチケミカルズ</td><td>M295900</td><td>標準 5hmC</td></tr><tr><td>Prdm14 抗体</td><td>バイオワールド</td><td>BS7634</td><td>ウェスタンブロット分析-一次抗体</td></tr><tr><td>Dnmt3a 抗体</td><td>バイオワールド</td><td>BS6587</td><td>ウェスタンブロット分析-一次抗体</td></tr><tr><td>Dnmt3b 抗体</td><td>abcam</td><td>ab13604</td><td>ウェスタンブロット分析-一次抗体</td></tr><tr><td>Dnmt3l 抗体</td><td>abcam</td><td>ab3493</td><td>ウェスタンブロット解析-一次抗体</td></tr><tr><td>Dnmt1 抗体</td><td>abcam</td><td>ab13537</td><td>ウェスタンブロット解析-一次抗体</td></tr><tr><td>&β;-チューブリン抗体</td><td>バイオワールド</td><td></td><td>BS1482MH ウェスタンブロット解析-一次抗体</td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ IgG</td><td>abcam</td><td>ab6721</td><td>ウェスタンブロット解析-二次抗体</td></tr><tr><td>ヤギ 抗マウス IgG</td><td>abcam</td><td>ab6789</td><td>ウェスタンブロット分析-二次抗体</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>逆転写システム</td><td>プロメガ</td><td>A3500</td><td>RNA逆転写</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR マスターミックス</td><td>プロメガ</td><td>A6001</td><td>RT-PCR</td></tr><tr><td>StemTAG アルカリホスファターゼ染色および活性アッセイキット</td><td>細胞株式会社バイオラボ</td><td>CBA-302</td><td>&nbsp;アルカリホスファターゼ染色分析</td></tr><tr><td>マウスES細胞:WT、129 SvEv</td><td>Guoliang Xu教授(Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)</td><td></td>マウス<td>ES細胞の細胞株</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>細胞観察</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Prism Software Inc.</td><td>5.0</td><td>統計分析</td></tr></tbody></table>

mek 阻害剤 pd0325901 とビタミン c を用いたマウス胚性幹細胞のゲノムの低いメチル化を維持するために代替カルチャ メソッド

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

胚性幹 (ES) 細胞は 3 つの胚葉 (内胚葉、中胚葉、または外胚葉) のいずれかに分化する可能性があるし、再生医療のための多くの系統を生成できます。ES 細胞培養体外長い広範な懸念の対象とされています。血清及び白血病抑制因子 (LIF) のマウス ES 細胞を維持する古典的な-媒体を含んでいます。しかし、血清/LIF の条件下で細胞は形態および多能性関連遺伝子の発現プロファイルの不均一性を示す、主に準安定状態。さらに、ES 細胞を示すグローバル領域のメチル化が、内部細胞塊 (ICM) の始原生殖細胞 (PGCs) 素朴な ES 細胞は、グローバルの低いメチル化の状態。ICM と始原生殖の hypomethylated 状態は、多能性と密接に関連します。マウス ES 細胞培養方法を改善するために DNA hypomethylated および多能性の状態を維持するために 2 つの低分子化合物の選択的に結合された使用率に基づいて新しい方法最近行った。ここでは、ビタミン C (Vc) の共同治療を示す、PD0325901 はマウス ES 細胞で 5 日で 5-メチルシトシン (5mC) の約 90% を消去できます。生成された 5mC コンテンツは孵卵に匹敵します。PD0325901 アップ調整をする Prdm14 式 Dnmt3b を抑制する制御機構の解明を示します (de novo DNA メチル基転移酵素)、Dnmt3l (Dnmt3b の補因子)、 de novo 5mC 合成を減らすことによって。Vc は、パッシブとアクティブの両方の DNA demethylations の関与を示す 5mC の 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) 主に Tet1 と Tet2、触媒への変換を促進します。さらに, Vc/PD0325901 の条件下でマウス ES 細胞示す同種形態と多能性の状態。総称して、小説と DNA 低いメチル化とマウス ES 細胞の多能性を維持達成するため化学シナジー培養法を提案します。小分子の化学依存法は、血清が文化、さらに臨床応用研究のための均質な ES 細胞を生成する将来性の主要な欠点を克服します。

Vc/PD0325901 相乗的マウス ES 細胞の世界的な消去を誘発します。血清中マウス ES 細胞の多能性 ICM 細胞と始原生殖を示す DNA のメチル化の世界的な消去、hypomethylated 状態が密接に関連付けられて、多能性9,10DNA メチル化を展示します。
以前は、我々 と他の Vc がテトを介した 5mC 脱メチル化15,17を高めることができることを発見します。一方、2 i は、5mC のde novo合成を阻害することもわかった。さらにこれらの調査結果のコンテキストで、一緒に Vc と 2 i を用いたマウス ES 細胞の相乗的操作を提案する.UHPLC MS/MS の分析の...

我々 はマウス胚性幹細胞を培養するための 2 つの化学ベースのプロトコルについて説明します。この新しいメソッドは、(ビタミン C)、テトを介した酸化を促進し、DNA 低いメチル化とマウス胚性幹細胞の多能性を維持するために、5-メチルシトシン (PD0325901) でのデノボ合成を抑制の相乗効果のメカニズムを利用しています。

MEK 阻害剤 PD0325901 とビタミン C を用いたマウス胚性幹細胞のゲノムの低いメチル化を維持するために代替カルチャ メソッド

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

このプロトコルの全体的な目標は、低分子化合物のPD0325901とビタミンCを使用して、マウス胚性幹細胞の低メチル化および多能性状態を維持することです。この方法は、FBS培養マウス胚性幹細胞の分野における重要な問題、例えば形態学におけるヘテロジェネリティや脱メチル化などの課題に答えるのに役立ちます。したがって、この技術の主な利点は、マウス胚性幹細胞が優れた形態と低メチル化および未分化状態を維持できることです。プレートとバッファーを調製した後、テキストプロトコルに従って、マウスES細胞、培地、トリプシン、およびPBSを摂氏37度の水浴で予温します。細胞を継代するには、皿から培地を吸引し、2ミリリットルのPBSを使用して細胞を2回すすぎます。次に、PBSを取り外し、0.3ミリリットルのトリプソンEDTAを細胞に加え、溶液中の細胞を覆うように皿をすばやく傾けます。直ちにトリプシンを除去し、プレートを摂氏37度で1分間インキュベートして細胞を剥離します。予め温めた血清培地を2ミリリットル加えてトリプシンを不活性化し、5ミリリットルのピペットを使用して細胞コロニーを10回再懸濁して単一細胞懸濁液にします。150マイクロリットルの細胞溶液を新しい6センチメートルのゼラチンコーティングされた皿にプレートし、3ミリリットルの新しく作られたVCPD0325901培地を補充します。Vcが不安定であるため、インキュベート中に24時間ごとに古い培地を取り出し、3ミリリットルの新鮮なVcpd0325901培地を追加します。70〜80%のコンフルエントに達した後、細胞を継代し、示したように培養を続けます。DNA抽出を行うには、前に示したようにトリプシンで細胞を採取し、製造元の指示に従ってゲノムDNA精製キットを使用します。DNAのチューブに100マイクロリットルの超純水を加え、約15回ピペッティングしてDNAを溶解します。次に、分光光度計を使用してOd260と280の比率を測定し、DNAの濃度と品質を決定します。DNA濃度は、マイクロリットルあたり約500ノノグラムである必要があります。次に、5マイクロリットルの100ミリモルトリス塩酸塩PH7.6、2単位の子牛腸ホスファターゼ、1単位のDNA酵素1個、および0.005単位のヘビ毒、ホスホジエステラーゼ1と組み合わせて、5マイクログラムのDNAを消化します。次に、超純水を使用して容量を50マイクロリットルに上げます。反応を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、室温で1, 000xgで遠心分離してサンプルを1分間収集します。次に、溶液を限外ろ過チューブに移し、サンプルを13、000xg、摂氏4度で30分間回転させて、消化酵素を除去します。5HMC分析用のサンプルを調製するには、36マイクロリットルの濾液を新しい1ミリリットルのチューブに移し、4マイクロリットルのD35HMCを追加して最終濃度を3ナノモルにします。5MC解析では、196マイクロリットルの超純水を新しい遠心分離管にピペットで移し、ゲノムDNA中の5MCの密度が高いため、4マイクロリットルの濾液を追加します。希釈した5MC溶液36マイクロリットルを新しい遠心分離チューブに移し、D35MCを4マイクロリットル加えて最終濃度を50ナノモルにします。D35HMCとD35MCを内部標準として使用して、それぞれ5HMCと5MCを校正します。UHPLCMS ソフトウェアで 5MC および 5HMC を分析するためのパラメーターを設定した後、テキスト・プロトコルに従って、「MS QQQ」をクリックして QQQMSMS のパラメーターを設定します。停止時間については、[No limit/As Pump]を選択します。イオン源としてESIを選択します。時間フィルタリングには、[ピーク幅] をオンにして 0.07 分を入力します。時間セグメントを設定するには、[start time] で [zero] を選択します。MRM でスキャン モードを設定して列からの言及を分析するには、スキャン タイプとして [MRM] を選択します。[Div Value] で [To MS] を選択します。[Delta EMV plus] には 200 を入力し、[Delta EMV minus] には 0 を入力します。遷移を監視するためのパラメーターを作成するには、最初に MSQQQ 1 acquisition をクリックします。スキャンセグメントを設定するには、[Dwell] に 90 と入力します。フラグメントの電圧をフラグメントに設定するには、90を入力します。[Collision Energy] に「5」と入力します。[Cell Accelerator Voltage] に「4」と入力します。ポジティブイオンモードを設定するには、[Polarity] で [positive] を選択します。モノヌクレオシドのUHPLC分離を行うには、500ミリリットルの超純水と500マイクロリットルのギ酸を溶液aに混合することにより、5MCおよびシトシンを結合するための溶液aおよびbを調製します。次に、500ミリリットルの100%メタノールと溶液bを測定し、溶液aと溶液bを95対5の体積比で混合し、移動相として5MCとCを溶出させます。次に、流量を0.25ミリリットル/分に設定します。最適化されたグラジエントの暗示を使用して5HMCを分離します。次に、流量を毎分0.25ミリリットルに設定します。5MC、D35MC、DC、5HMC、および D35HMC の遷移をモニターします。キャピラリー電圧を3, 500ボルトに設定します。次に、注入量を5マイクロリットルに設定し、各サンプルを3回分析します。対応する標準曲線を使用して、テキストプロトコルに従って5MCと5HMCの量を評価します。UHPLC MSMSによるマウスES細胞のゲノムDNAのこの分析で見られるように、VcPD0325901処理はDNAメチル化のより急速な低下をもたらし、5日後に安定した5つのMCレベルに達しましたが、Vc2i処理は11日目に同等のレベルをもたらしました。このグラフは、Vc含有処理が1日後に5HMCの頻度を劇的に増加させ、その後、5MC基質の漸進的な減少により5HMCレベルが徐々に低下したことを示しています。ウェスタンブロット解析では、Prdm14は有意に上昇し、細胞がPD0325901で後退するとDnmt3bとその補因子であるDnmt3lは大幅に低下したことが示され、5MCの消去におけるPD0325901の作用が示されました。このアルカリホスファターゼアッセイでは、VcPD032590で26日間培養したところ、マウスES細胞はすべて球状形態で紫色に染色され、未分化状態であることが示されました。対照的に、培地のみを含むFBSで増殖した細胞は、色が薄く見え、部分的な広がりが部分的な分化を示しています。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間で完了します。この手順を試みる際には、FBSを事前にスクリーニングする必要があることを覚えておくことが重要です。また、継代を通じて細胞を過度にピペッティングしたり、VcPDO325901培地を毎日交換したりすることは避けてください。この開発後、この技術は、マウスES細胞をin vitroで培養する分野の研究者が、in vitroでの胚の発生とプロセス、および再生医療に医学的に関連する生成細胞を探求する道を開くことになります。このビデオを見た後、MEK阻害剤であるPD0325901という2つの小さな分子成分を使用して、マウスES細胞の成長形態と高メチル化および複数の強力な状態を維持する方法について、より深く理解できるはずです。Trisol、DMSまたはPMS、およびDTTでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋、マスク、ゴーグルの着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

an-alternative-culture-method-to-maintain-genomic-hypomethylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

マウス胚性線維芽細胞（MEF）の品質は、例えば、CF-1のようなマウスの右歪みによって決定されます。これらから得られた多能性·支持のMEFと馴化培地（CM）が共同で動作可能な自己再生および多能性を維持するために、アクチビン/ノードおよびFGF経路に必要なアクチビンA、グレムリンとTGFβ1の最適な濃度を含める必要があります。...

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

ここでは、解離した単一細胞の非コロニー型単層(NCM)増殖に基づくヒト多能性幹細胞(hPSC)培養プロトコルを紹介します。この新しい方法は、Rho関連キナーゼ阻害剤またはラミニンアイソフォーム521(LN-521)を利用しており、大量の均質なhPSCの産生、遺伝子操作、および創薬に適しています。...

ヒト多能性のための代替培養はセル生産、メンテナンス、および遺伝子解析幹

このプロトコルは、マウス胚性幹細胞（MESC）を収集するための方法を提供するメディア-conditioned（MESC-CM）血清（ウシ胎児血清、FBS）に由来する - とフィーダー細胞のための（マウス胚線維芽細胞、MEFの）フリー条件フリーアプローチ。これは、老化や老化関連疾患の治療のために適用することができます。...

血清やフィーダーフリーのマウス胚のコレクションは、無細胞アプローチのための細胞馴化培地を幹

タンパク質は、多くの場合、異なる細胞機能を発揮することができ、複数のドメインを含みます。遺伝子ノックアウト（KO）は、この機能的多様性を考慮していません。ここでは、様々な機能ドメインまたはタンパク質の変異体の分子解剖を可能KO胚性幹細胞における組み換え媒介カセット交換（RMCE）ベースの構造と機能のアプローチを報告しています。...

リコンビナーゼ媒介カセット交換を用いて、マウス胚性幹細胞における構造と機能の研究

我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。...

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

クロマチン環境規制、適切な遺伝子発現に必要な重要なプロセスです。ここでは、クロマチン修飾の採用によって遺伝子発現を制御する手法について述べる遺伝子特異的かつ可逆的に機械。...

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

このレポートの目的は、エピジェネティックな遺伝子マーカーの堅牢な免疫組織化学的検出のためのプロトコルを記述するためです、5-メチルシトシン (5mC) および 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)...

5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

ここでは、非ランダム X 染色体の不活化を伴う生存可能な雌マウスモデルを生成するためのプロトコルについて述べる、すなわち、母親-継承された X 染色体は、細胞の 100% で不活性である。我々はまた、インビボにおける不活性 X...

不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル

ここでは、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせて、遺伝子トランスフェクションやレトロウイルスベクターを必要とせずに哺乳類の多能性細胞を効率的に生成する方法を紹介します。したがって、この戦略はトランスレーショナル医療にとって有望であり、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を表しています。...

エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

本プロトコルは、アクチノマイシンD処理、RT-qPCR、非線形回帰解析を用いて、マウス胚性幹細胞における遺伝子間および遺伝子内強化RNAの安定性と半減期を定量的に測定します。位置特異的な正規化戦略を組み込み、文脈依存的なeRNA崩壊動態を正確にモデル化します。...

マウス胚性幹細胞におけるエンハンサーRNA安定性の最適化された定量的評価

学ぶマウス胚性幹細胞の低メチル化維持法。PD0325901とビタミンCを用いて多能性と優れた細胞形態を保持する培養プロトコルを解説。幹細胞生物学研究に有用です。

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