MEK 阻害剤 PD0325901 とビタミン C を用いたマウス胚性幹細胞のゲノムの低いメチル化を維持するために代替カルチャ メソッド

我々 はマウス胚性幹細胞を培養するための 2 つの化学ベースのプロトコルについて説明します。この新しいメソッドは、(ビタミン C)、テトを介した酸化を促進し、DNA 低いメチル化とマウス胚性幹細胞の多能性を維持するために、5-メチルシトシン (PD0325901) でのデノボ合成を抑制の相乗効果のメカニズムを利用しています。

このプロトコルの全体的な目標は、低分子化合物のPD0325901とビタミンCを使用して、マウス胚性幹細胞の低メチル化および多能性状態を維持することです。この方法は、FBS培養マウス胚性幹細胞の分野における重要な問題、例えば形態学におけるヘテロジェネリティや脱メチル化などの課題に答えるのに役立ちます。したがって、この技術の主な利点は、マウス胚性幹細胞が優れた形態と低メチル化および未分化状態を維持できることです。

プレートとバッファーを調製した後、テキストプロトコルに従って、マウスES細胞、培地、トリプシン、およびPBSを摂氏37度の水浴で予温します。細胞を継代するには、皿から培地を吸引し、2ミリリットルのPBSを使用して細胞を2回すすぎます。次に、PBSを取り外し、0.3ミリリットルのトリプソンEDTAを細胞に加え、溶液中の細胞を覆うように皿をすばやく傾けます。

直ちにトリプシンを除去し、プレートを摂氏37度で1分間インキュベートして細胞を剥離します。予め温めた血清培地を2ミリリットル加えてトリプシンを不活性化し、5ミリリットルのピペットを使用して細胞コロニーを10回再懸濁して単一細胞懸濁液にします。150マイクロリットルの細胞溶液を新しい6センチメートルのゼラチンコーティングされた皿にプレートし、3ミリリットルの新しく作られたVCPD0325901培地を補充します。

Vcが不安定であるため、インキュベート中に24時間ごとに古い培地を取り出し、3ミリリットルの新鮮なVcpd0325901培地を追加します。70〜80%のコンフルエントに達した後、細胞を継代し、示したように培養を続けます。

DNA抽出を行うには、前に示したようにトリプシンで細胞を採取し、製造元の指示に従ってゲノムDNA精製キットを使用します。DNAのチューブに100マイクロリットルの超純水を加え、約15回ピペッティングしてDNAを溶解します。次に、分光光度計を使用してOd260と280の比率を測定し、DNAの濃度と品質を決定します。

DNA濃度は、マイクロリットルあたり約500ノノグラムである必要があります。次に、5マイクロリットルの100ミリモルトリス塩酸塩PH7.6、2単位の子牛腸ホスファターゼ、1単位のDNA酵素1個、および0.005単位のヘビ毒、ホスホジエステラーゼ1と組み合わせて、5マイクログラムのDNAを消化します。次に、超純水を使用して容量を50マイクロリットルに上げます。

反応を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、室温で1, 000xgで遠心分離してサンプルを1分間収集します。次に、溶液を限外ろ過チューブに移し、サンプルを13、000xg、摂氏4度で30分間回転させて、消化酵素を除去します。

5HMC分析用のサンプルを調製するには、36マイクロリットルの濾液を新しい1ミリリットルのチューブに移し、4マイクロリットルのD35HMCを追加して最終濃度を3ナノモルにします。5MC解析では、196マイクロリットルの超純水を新しい遠心分離管にピペットで移し、ゲノムDNA中の5MCの密度が高いため、4マイクロリットルの濾液を追加します。希釈した5MC溶液36マイクロリットルを新しい遠心分離チューブに移し、D35MCを4マイクロリットル加えて最終濃度を50ナノモルにします。

D35HMCとD35MCを内部標準として使用して、それぞれ5HMCと5MCを校正します。UHPLCMS ソフトウェアで 5MC および 5HMC を分析するためのパラメーターを設定した後、テキスト・プロトコルに従って、「MS QQQ」をクリックして QQQMSMS のパラメーターを設定します。停止時間については、[No limit/As Pump]を選択します。

イオン源としてESIを選択します。時間フィルタリングには、[ピーク幅] をオンにして 0.07 分を入力します。時間セグメントを設定するには、[start time] で [zero] を選択します。

MRM でスキャン モードを設定して列からの言及を分析するには、スキャン タイプとして [MRM] を選択します。[Div Value] で [To MS] を選択します。[Delta EMV plus] には 200 を入力し、[Delta EMV minus] には 0 を入力します。遷移を監視するためのパラメーターを作成するには、最初に MSQQQ 1 acquisition をクリックします。

スキャンセグメントを設定するには、[Dwell] に 90 と入力します。フラグメントの電圧をフラグメントに設定するには、90を入力します。[Collision Energy] に「5」と入力します。

[Cell Accelerator Voltage] に「4」と入力します。ポジティブイオンモードを設定するには、[Polarity] で [positive] を選択します。モノヌクレオシドのUHPLC分離を行うには、500ミリリットルの超純水と500マイクロリットルのギ酸を溶液aに混合することにより、5MCおよびシトシンを結合するための溶液aおよびbを調製します。

次に、500ミリリットルの100%メタノールと溶液bを測定し、溶液aと溶液bを95対5の体積比で混合し、移動相として5MCとCを溶出させます。次に、流量を0.25ミリリットル/分に設定します。最適化されたグラジエントの暗示を使用して5HMCを分離します。

次に、流量を毎分0.25ミリリットルに設定します。5MC、D35MC、DC、5HMC、および D35HMC の遷移をモニターします。キャピラリー電圧を3, 500ボルトに設定します。

次に、注入量を5マイクロリットルに設定し、各サンプルを3回分析します。対応する標準曲線を使用して、テキストプロトコルに従って5MCと5HMCの量を評価します。UHPLC MSMSによるマウスES細胞のゲノムDNAのこの分析で見られるように、VcPD0325901処理はDNAメチル化のより急速な低下をもたらし、5日後に安定した5つのMCレベルに達しましたが、Vc2i処理は11日目に同等のレベルをもたらしました。

このグラフは、Vc含有処理が1日後に5HMCの頻度を劇的に増加させ、その後、5MC基質の漸進的な減少により5HMCレベルが徐々に低下したことを示しています。ウェスタンブロット解析では、Prdm14は有意に上昇し、細胞がPD0325901で後退するとDnmt3bとその補因子であるDnmt3lは大幅に低下したことが示され、5MCの消去におけるPD0325901の作用が示されました。このアルカリホスファターゼアッセイでは、VcPD032590で26日間培養したところ、マウスES細胞はすべて球状形態で紫色に染色され、未分化状態であることが示されました。

対照的に、培地のみを含むFBSで増殖した細胞は、色が薄く見え、部分的な広がりが部分的な分化を示しています。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間で完了します。この手順を試みる際には、FBSを事前にスクリーニングする必要があることを覚えておくことが重要です。

また、継代を通じて細胞を過度にピペッティングしたり、VcPDO325901培地を毎日交換したりすることは避けてください。この開発後、この技術は、マウスES細胞をin vitroで培養する分野の研究者が、in vitroでの胚の発生とプロセス、および再生医療に医学的に関連する生成細胞を探求する道を開くことになります。このビデオを見た後、MEK阻害剤であるPD0325901という2つの小さな分子成分を使用して、マウスES細胞の成長形態と高メチル化および複数の強力な状態を維持する方法について、より深く理解できるはずです。

Trisol、DMSまたはPMS、およびDTTでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋、マスク、ゴーグルの着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。