Name: 複数の栄養源の微生物代謝を調査するため同位体トレーサー実験の組み合わせに基づいてワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 学ぶ同位体トレーサー実験による複数栄養源の微生物代謝解析法。酵母の窒素代謝を定量的に調査し、消費された栄養素の行方と合成化合物の代謝的起源を明らかにする。再現性のある発酵技術が鍵となる。

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ジャン ・ ロッシュ ムレ、シルヴィ Dequin と発酵のロボット支援システムの構想に貢献するジャン = マリー ・ Sabalyrolles とマルティーヌ Pradal、ニコラ ・ ブーヴィエとパスカル Brial テクニカル サポートのために感謝しますこのプロジェクトは、凝った et ミニステール ・ デ ・教育、国立図書館、デ ラによって提供された資金デ ラ テク。

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微生物代謝の操作を理解するための有望なアプローチは、同位体トレーサー実験による代謝ネットワークを通じて化合物の分配を定量化します。この手法は、1 つまたは 2 つのラベルの付いた基板で正常に適用されている間現在実装できません複数標識元素同位体 (すなわち、2 つ以上の基板) を使用してさまざまなソースの代謝を研究します。確かに、利用可能な分析技術は、共同 2 つの要素をラベル付けするとき単一の要素の同位体を使用する場合にのみ蛋白質構成アミノ酸と分子のラベリング パターンの正確な決定を有効にします。その結果、これらの制限に対処して微生物による複数の栄養源の管理を評価するには、我々 は13C と15 選択した基板をラベリングしながら同じ環境条件の下で文化のセットを繰り返す選んだN 同位体。さらには、各13C や15N トレーサー実験によって提供される特定の情報の組み合わせは複数の情報源の代謝の定量的拡張表示するご利用いただけます。
報告アプローチの成果は、再現可能な一連の標準的な条...

理解微生物代謝の動作方法は、発酵プロセスを改善し、発酵化合物の生産を調節する効率的な戦略の設計にとって重要な問題です。ゲノミクス、これらの最後の 2 つの数十年の機能ゲノミクスの進歩は主多くの微生物の代謝ネットワークのトポロジの知識の拡張に貢献しました。この情報へのアクセスは、1細胞機能の包括的な概観を目指すアプローチの開発につながった。これらの方法論はしばしばモデルに基づく測定可能なパラメーターの解釈に依存しています。これらの実験データは一方で、代謝産物の吸収と生産率、そして、同位体トレーサーから得られる定量的な細胞内の情報が、他の一方で、実験します。これらのデータは、定義された代謝ネットワーク2,3,4で異なる経路の体内活動の控除の基本情報を提供します。現在、利用可能な解析技術だけ単一要素の同位体を用いたとき分子のパターンを分類の正確な検出を有効にしておそらく共同 2 つの同位体要素をラベル付けするとき。さらに、ほとんどの成長条件の下で炭素源はのみ 1 つまたは 2 つの化合物の構成します。その結果、炭素基板から13C 同位体トレーサーの手法を用いて広くそして首尾よく適用された炭素代謝ネットワーク操作5,6,7 の完全な理解を開発するには ,8。
対照的に、多くの自然と産業環境微生物の発育をサポートする利用可能な窒素リソースは分子の広い範囲の多くの場合で構成します。たとえば、ワインやビールの発酵中に窒素は 18 のアミノ酸と可変濃度9時アンモニウムの混合物として提供されます。この同化のためのアクセス可能な N 化合物の配列は通常アンモニウム窒素のユニークなソースを使用して、後者が達成、大きく異なる生理学的な研究は、一般的に使用されるこれらの複雑なメディア状況を作る。
全体的にみて、窒素化合物を直接タンパク質に組み込むか異化が内在化しています。酵母を含む多くの微生物の窒素代謝のネットワーク構造は基材の多様性に従って非常に複雑です。図解すると、このシステムは、グルタミン、グルタミン酸、および α-ケトグルタル酸10、11トランスアミナーゼと deaminases の相互変換を触媒する窒素代謝の中核の組み合わせに基づいています。このネットワークを通じてアンモニウムまたは他のアミノ酸のアミン グループを集められ α-ケト酸をリリースします。これらの中間体から中央の炭素代謝 (CCM)12,13synthetized しています。この多数分岐反応と中間体、外因性の窒素源の異化と蛋白質構成アミノ酸の同化作用に関与するは、細胞の同化の要件を満たしています。これらの異なる相互接続されたルート経由でアクティビティは、代謝産物の排泄にもなります。特に、α-ケト酸は、高級アルコールとその酢酸エステル誘導体14製品の感覚のプロファイルに不可欠な貢献を生成するエールリッヒ経路を介してリダイレクトされます。その後、窒素代謝がどのように動作するバイオマス生産と揮発性分子 (香り) の形成に重要な役割を果たしています。
反応、酵素、窒素代謝に関与する遺伝子が広範囲の文献に記載されています。ただし、代謝ネットワーク全体で複数の窒素源の分布の問題がまだ解決されていません。この情報の欠如を説明する 2 つの主な理由があります。まず、窒素代謝ネットワークの重要な複雑さの観点から大量の定量的データは利用できなかったその操作の完全な理解に必要な今まで。第二に、多くの実験的制約と分析法の制限防止 CCM 機能の解明のために以前使用されたアプローチの実装。
これらの問題を克服するために、一連の同位体トレーサー実験からのデータの照合に基づいているシステム レベルのアプローチを開発しました。ワークフローは次のとおりです。 -同じ環境条件の下で発酵のセット実施別選択した栄養源 (基質) はたびにラベルが付いています。 ● ラベルの付いた基板と濃度の残留濃度の由来化合物の同位体濃縮発酵の各段階での正確な定量分析法 (HPLC、GC-MS) の組み合わせで派生バイオマスを含む分類された分子の異化。 -それぞれの質量、同位体のバランスの計算消費標識分子と流束比の決定することによって微生物による複数の栄養源の管理のグローバル概要を取得するデータセットのそれ以上の統合解析.
この方法論を適用するには、文化のひずみ/微生物の再現可能な動作に注意を支払わなければなりません。さらに、異なった文化からのサンプルは、同じの明確に定義された発酵進行中に取られなければなりません。本稿で報告した実験的な作品、ロボット支援システムはこれらの制約を考慮して発酵のオンライン監視の使用です。
さらに、研究の科学的な問題に対処する適切なラベル付けされた基板 (化合物、自然とラベルの位置) のセットを選ぶことが不可欠です。ここでは、アルギニン、グルタミン、 15N 標識アンモニアは、グレープ ジュースは、3 つの主要な窒素源として選択されました。これは窒素化合物の消費から蛋白質構成アミノ酸に再分配のパターンを評価する許可。また揮発性分子の生産への貢献と消費されるアミノ酸の炭素骨格の運命を調査することを目指しました。満たすためにこの目的、均一に13C 標識ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシンに含まれていた研究エールリッヒ経路の主要な中間体から派生するアミノ酸として。
全体的に、酵母が外因性窒素源として炭素前駆体の過剰をさらに除去しながら発酵を通してその同化の要件を満たすための再配布によって複雑な窒素リソースを管理する方法を模索して定量的揮発性分子。本稿で報告した実験の手順は、他の微生物によって使用される他の複数の栄養源を調査に適用できます。それは、微生物の代謝に及ぼす遺伝的背景や環境の影響の分析のための適切なアプローチのように見えます。

<table><tbody><tr><td>D-グルコース</td><td>PanReac</td><td>141341.0416</td><td></td></tr><tr><td>D-フルクトース</td><td>PanReac</td><td>142728.0416</td><td></td></tr><tr><td>DL-リンゴ酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0875</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸一水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>硫酸カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>Σ Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Σ Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>A4514</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マンガン一水和物</td><td>Σ Aldrich</td><td>M7634</td><td></td></tr><tr><td>硫酸亜鉛七水和物</td><td>Σ Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>銅 (II) 硫酸五水和物</td><td>Σ Aldrich</td><td>C7631</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ素カリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>P4286</td><td></td></tr><tr><td>塩化コバルト (II) 六水和物</td><td>Σ Aldrich</td><td>C3169</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>B7660</td><td></td></tr>七<tr><td>モリブデン酸アンモニウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A7302</td><td></td></tr>ミ<tr><td>オイノシトール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>I5125D</td><td></td></tr><tr><td>-パントテン酸ヘミカルシウム塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>21210</td><td></td></tr><tr><td>チアミン、塩酸塩</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>T4625</td><td></td></tr>ニコ<tr><td>チン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>ピリドキシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Ergost&eacute;rol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6510</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 絶対</td><td>VWR 化学薬品</td><td>101074F</td><td></td></tr><tr><td>鉄 (III) 塩化物 六水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸</td><td>Σ Aldrich</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>L-アラニン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-アルギニン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-イソロイシン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-メチオニン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-フェニルアラニン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-プロリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-セリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-スレオニン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-トリプトファン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-チロシン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-バリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>13C5-L-バリン</td><td>ユーリソトップ</td><td>CLM-2249-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>13C6-L-ロイシン</td><td>ユーリソトップ</td><td>CLM-2262-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>15N-塩化アンモニウム</td><td>ユーリソトップ</td><td>NLM-467-1</td><td></td></tr><tr><td>ALPHA-15N-L-グルタミン</td><td>ユーリソトップ</td><td>NLM-1016-1</td><td></td></tr><tr><td>U-15N4-L-アルギニン</td><td>ユーリソトップ</td><td>NLM-396-PK</td><td></td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>270989エチルプロパン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>112305</td><td></td></tr><tr><td>エチル2-メチルプロパン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>246085</td><td></td></tr><tr><td>エチルブタノエート</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>E15701</td><td></td></tr>エ<tr><td>チル2-メチルブタン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>306886</td><td></td></tr><tr><td>エチル3-メチルブタン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>8.08541.0250</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン酸エチル</td><td>Σ Aldrich</td><td>148962</td><td></td></tr><tr><td>オクタン酸エチル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244910</td><td></td></tr><tr><td>デカン酸エチル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W243205</td><td></td></tr><tr><td>ドデカン酸エチル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244112</td><td></td></tr><tr><td>乳酸エチル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244015</td><td></td></tr><tr><td>コハク酸ジエチル</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>W237701</tr><tr><td>2-メチルプロピルアセテート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W217514</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルブチルアセテート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W364401</td><td></td></tr><tr><td>3-メチルブチルアセテート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>287725</td><td></td></tr><tr><td>2-フェニルエチルアセテート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>290580</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルプロパノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>294829</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルブタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>133051</td><td></td></tr><tr><td>3-メチルブタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309435</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>128570</td><td></td></tr><tr><td>2-フェニルエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77861</td><td></td></tr><tr><td>プロパン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94425</td><td></td></tr><tr><td>ブタン酸</td><td>Σ Aldrich</td><td>19215</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルプロパン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58360</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルブタン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>193070</td><td></td></tr><tr><td>3-メチルブタン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W310212</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>153745</td><td></td></tr><tr><td>オクタン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W279900</td><td></td></tr><tr><td>デカン酸</td><td>Σ Aldrich</td><td>W236403</td><td></td></tr><tr><td>ドデカン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L556</td><td></td></tr><tr><td>発酵槽 1L</td><td>Legallais</td><td>AT1357</td><td>発酵用手作り発酵槽</td></tr><tr><td>使い捨て真空ろ過システム</td><td>ドミニク・ドイッチャー</td><td>029311</td><td></td></tr><tr><td>発酵槽 (250 ml)</td><td>Legallais</td><td>AT1352</td><td>発酵用手作り発酵槽</td></tr><tr><td>滅菌チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>発酵ロック</td><td>Legallais</td><td>AT1356</td>発酵<td>のために手作りされた発酵ロック</td></tr><tr><td>BactoYeast抽出物ベ</td><td>クトン、ディキンソンアンドカンパニー212750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー</td><td></td> 211677<td></td></tr><tr><td>インキュベーターシェーカーInforsHT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パーティクルカウンター</td><td>ベックマンコールター</td><td>6605697</td><td>Multisizer 3 コールターカウンター</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Jouan</td><td></td><td>GR412</td></tr><tr><td>プレートバトラー ロボットシステム</td><td>ラボサービス BV</td><td>PF0X-MA</td><td>自動計器</td></tr>プレート<tr><td>バトラーソフトウェア</td><td>ラボサービス BV</td><td></td><td>ロボットモニターソフトウェア</td></tr><tr><td>RobView</td><td></td><td></td><td>自社開発の計算ソフト</td></tr><tr><td>My SQL</td><td></td><td></td><td>国際ソースデータベース</td></tr><tr><td>Cimarec i Telesystem マルチポイントスターラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック サイエンティフィック</td><td>50088009</td><td>ストリングドライブ 60</td></tr><tr><td>BenchBlotter プラットフォームロッカー</td><td>Dutscher</td><td>60903</td><td></td></tr><tr><td>アンモニア酵素キット</td><td>R-Biopharm AG</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計 キュベット</td><td>VWR</td><td>634-0678</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計 UviLine9400</td><td>Secomam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アミノ酸標準 生理学的 - 酸性および中性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6407</td><td></td></tr><tr><td>アミノ酸標準 生理学的 - 基本</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6282</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸リチウムバッファー - ウルトラニンヒドリン試薬</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6000-06</td><td></td></tr><tr><td>スルホサリチル酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2130</td><td></td></tr><tr><td>Norleucine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N1398</td><td></td></tr><tr><td>Biochrom 30 AAA</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZChrom Elite</td><td>Biochrom</td><td></td><td>機器制御およびデータ分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Ultropac 8 樹脂 リチウム</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6002-47</td><td>リチウム 高分解能生理学的カラム</td></tr><tr><td>フィルター Millex GV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVX13NL</td><td>Millex GV 13mm (細孔径 0.22 & micro;m)</td></tr><tr><td>メンブレンフィルターPALL</td><td>VWR</td><td>514-4157</td><td>Supor-450 47mm 0.45&micro;m</td></tr><tr><td>真空ポンプ ミリバックミニ</td><td>ミリポア</td><td>XF5423050</td><td></td></tr><tr><td>アルミ製スムースウェイトディッシュ 70mm</td><td>VWR</td><td>611-1380</td><td></td></tr><tr><td>精密バランス</td><td>メトラー</td><td></td><td>仕様 AE163</td></tr><tr><td>ジメチルスルフォキシド乾燥</td><td>メルク</td><td>1029310161</td><td>(最大0.025%) H2O) SeccoSolv</td></tr><tr><td>燃焼オーブン</td><td>リーガルライス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA タンパク質アッセイキット</td><td>Interchim</td><td>UP40840A</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>塩酸 発煙 37%</td><td>Emsure Merck</td><td>1003171000</td><td>グレード ACS、ISO、Reag.Ph Eur</td></tr><tr><td>酢酸リチウム緩衝液</td><td>Biochrom</td><td>80-2038-10</td><td></td></tr><tr><td>加水分解アミノ酸の商業溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AAS18</td><td></td></tr><tr><td>L-メチオニンスルホン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0876</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン酸一水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30170</td><td></td></tr><tr><td>パイレックスガラス培養管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z653586</td><td></td></tr><tr><td>ピリジン</td><td>アクロスオーガニックス</td><td>131780500</td><td>99% 超純</td></tr><tr><td>クロロギ酸エチル</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>23131</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>32222</td><td></td></tr><tr><td>バイアル</td> シ<td>グマ アルドリッチ</td><td></td> 854165 <td></td></tr><tr><td>1.5ml バイアル用マイクロインサート</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td> SU860066 <td></td></tr><tr><td>GC/MS</td><td>アジレント テクノロジーズ</td><td>5890 GC/5973 MS</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>機器制御およびデータ解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Chromasolv, HPLC</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>ChromasolvPlus, HPLC</td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド ジメチルアセタール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>394963</td><td></td></tr><tr><td>BSTFA</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>33024</td><td></td></tr><tr><td>DB-17MSカラム</td><td>Agilent Technologies</td><td>122-4731</td><td>30m * 0.25mm * 0.15&micro;m</td></tr><tr><td>硫酸ナトリウム、無水</td><td>シグマ Aldrich</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>テクニカル窒素</td><td>空気製品</td><td>14629</td><td></td></tr><tr><td>ゼブロン ZB-WAX カラム</td><td>Phenomenex</td><td>7HG-G007-11</td><td>30m*0.25mm*0.25&micro;m</td></tr><tr><td>ヘリウムBIP</td><td>の空気プロダクト</td><td>26699</td><td></td></tr><tr><td>ガラス パスツールピペットVWR</td><td></td><td>612-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

複数の栄養源の微生物代謝を調査するため同位体トレーサー実験の組み合わせに基づいてワークフロー

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

微生物学の分野の研究は、幅広い方法論の実装に依存します。特に、適切なメソッドの開発は大幅にユニークな窒素と炭素源を含む化学的に定義されているメディアに成長している微生物の代謝の広範な知識を提供することに貢献しています。対照的に、自然や産業の環境の彼らの広範な存在にもかかわらず、複数の栄養源の代謝を通して管理ほぼ未踏のままです。このような状況は、調査を妨げる適切な方法論の不足のために主にです。
定量的かつ包括的には、異なる分子、すなわち、複雑なリソースの混合物として、栄養が提供されるときの代謝の動作を調べる実験方法を報告する.ここでは、酵母の代謝ネットワークを介して複数の窒素源の分割の評価への応用について述べる。ワークフローは、選択された13c や15N 標識基板を用いた安定同位体トレーサー実験時に得られた情報を組み合わせたものです。それは最初の N を含む分子の混合物が含まれています同じ媒体で並列で再現可能な発酵に成っています。ただし、選択した窒素源は、各時間が付いています。分析的手続 (HPLC、GC-MS) の組み合わせを実装するは、ターゲット化合物のラベリング パターンを評価し、消費および他の代謝産物の基板の回収を定量化します。完全なデータセットの統合的解析は、細胞内で消費された基板の運命の概要を説明します。このアプローチが発酵のオンライン監視用ロボット支援システムによるサンプル-容易のコレクションの正確なプロトコルを必要とする- と多くの時間がかかる解析の成果。これらの制約にもかかわらず、それは酵母の代謝ネットワーク全体で複数の窒素源の分割を初めて理解できました。我々 は他の N 化合物へより豊かな情報源からの窒素の再分配を解明し、揮発性分子とアミノ酸の代謝の起源を決定します。

ワインの発酵中に見つかった複数の窒素源の酵母によって管理を調査するために実装されたワークフローの模式図を図 3に示します。 サンプリング、生物学的パラメーター-生育特性、窒素消費パターン、および蛋白質構成アミノ酸-ショー発酵 (図 4) の間で再現性の高いプロファイルの異なるポイント。この一貫性は、一連の 14 の独立した発酵中に生成されたデータの組み合わせに基づくアプローチの妥当性を検証します。
図 5は、すべてのアミノ酸にグレープ ジュースの利用可能なソースからの窒素の再分配の包括的な概要を示します。この分析は、 15N 標識化合物の存在下で行う実験から得られた結果によって主にサポートされます。質量、同位体のバランスの測定と組み合わせると、アミ...

このプロトコルでは、定量的かつ包括的に複数の栄養源の代謝を調査する実験手順について説明します。このワークフローは、同位体トレーサー実験と分析手順の組み合わせに基づいて決定する微生物による消費された栄養素の運命と分子 synthetized の代謝の起源をことができます。

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

この手順の全体的な目標は、標識基質を使用して複数の栄養源の代謝を定量的に調査することです。このワークフローにより、消費された栄養素の運命と、酵母によって合成された化合物の代謝起源を決定することができます。この方法は、環境条件に応じてすべての代謝がどのように機能するかなど、微生物代謝分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、複数の供給源からの栄養素分布のタンパク質の解明と定量化を可能にすることです。この方法は、酵母の窒素代謝を調べるために使用されましたが、他の代謝や微生物にも適用できます。この実験の成功の鍵は、発酵の再現性にあります。ユーザーは、定義された同じ生理学的段階にある細胞を収集するために特に注意を払う必要があります。この手順を実演するのは、技術スタッフのChristian Picou氏、研究室の博士課程の学生であるPauline Seguinot氏、ポスドク研究員のStephanie Rollero氏です。オートクレーブで、各窒素源用に調製した各合成培地を、磁気攪拌棒を含む1リットルのフラスコで低温殺菌します。適切な量の標識分子を溶解して、培地中の所望の最終濃度に到達します。使い捨て真空ろ過システムを使用して培地を滅菌します。滅菌計量シリンダーを使用して、マグネティックスターバーを含み、酸素の侵入を防ぎながら二酸化炭素の放出を可能にする発酵ロックが装備されている2つの滅菌済み発酵槽に培地を分割します。YPD培地でセレビジエ株を増殖させた後、層流下で培養前アリコートを採取し、100マイクロメートルの開口部が取り付けられた電子粒子カウンターを使用して細胞集団を定量化します。前培養物を遠心分離した後、ペレットを適量の滅菌水に懸濁して、10の2.5倍の最終濃度を得るため、10〜9細胞/mLになります。次に、各発酵槽に1ミリリットルの細胞懸濁液を接種します。これに続いて、21ポジションの攪拌プレートに適切に配置されたサポートガイドに発酵槽を設置し、攪拌速度を270RPMに設定して、発酵プラットフォームを準備します。各発酵のオンラインモニタリングを開始するには、ロボット制御アプリケーションを起動し、[アッセイの開始]ボタンをクリックして、実行する発酵量を選択します。表示されたインターフェースでプラットフォーム上の発酵槽の数と位置を表示できるようにするには、スロットの位置を右クリックして[無効]を選択し、空位置の監視を無効にします。計算ソフトウェアを初期化するには、初期化ボタンをクリックして、OKで検証します。次に、ロボット制御アプリケーションの[開始]ボタンをクリックして、重量取得を開始します。次に、発酵槽から採取した2つの6ミリリットルのサンプルを2, 000倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。終了したら、凍結した上清をそれぞれ2本のチューブに移し、マイナス80°Cで保存します。各ペレットを5ミリリットルの蒸留水で2回洗浄し、同位体濃縮の測定のために摂氏マイナス80度で保存します。2.5ミリモルのノルロイシンを内部標準として含む25%スルホサリチル酸溶液を800マイクロリットルのサンプルに200マイクロリットル加えて、高分子量の分子を除去します。インキュベーションおよび遠心分離後、0.22μmの細孔サイズのニトロセルロースメンブレンで混合物をろ過し、サンプルをアミノ酸分析システムに入れます。分析システムのプログラムまたはソフトウェアで、「実行」ボタンをクリックして、陽イオン交換カラムを装備した分析装置で液体クロマトグラフィー分析を開始します。次に、予め調製した標識細胞ペレットを200マイクロリットルの過ギ酸に懸濁することにより、酸化抽出物を調製します。摂氏4度で4時間インキュベートした後、33.6ミリグラムの硫酸ナトリウムを加えて反応を停止します。酸化抽出物に800マイクロリットルの6つの正常塩酸を加え、サンプルをハーブシールガラス管内で乾熱オーブンで摂氏110度で16時間インキュベートします。サンプルを室温まで冷ました後、200マイクロリットルの2.5ミリモルニューロロイシンを加え、窒素の流れで塩化水素ガスを除去します。乾燥抽出物を800マイクロリットルの蒸留水で2回洗浄し、次に800マイクロリットルのエタノールで洗浄します。次に、800マイクロリットルの200ミリモル酢酸リチウムバッファーを抽出物に加えます。サンプル中のタンパク質中のアミノ酸の相対濃度を、前述のクロマトグラフィー法を用いて測定します。標識細胞ペレットを加水分解するには、1.2ミリリットルの6モル塩酸を添加し、乾熱オーブン内の密閉ガラス管内でサンプルを摂氏105度で16時間インキュベートします。サンプルを室温まで冷ました後、1.2ミリリットルの蒸留水を加えます。遠心分離して細胞の破片を除去した後、上清を開放ガラス管内の6つの400マイクロリットルの画分に分配します。フラクションを105°Cの乾熱オーブンで4〜5時間乾燥させ、シロップの粘稠度に達するまで乾燥させます。バイオマス加水分解中に、操作の酸を頻繁に制御することにより、シロップの粘稠度になるまで画分を乾燥させます。ECF誘導体化のためには、冷却した乾燥加水分解物を200マイクロリットルの20ミリモル塩酸と133マイクロリットルのピリジンとエタノールの1対4混合物に溶解します。50マイクロリットルのクロロギ酸エチルを添加して、アミノ酸を誘導体化します。二酸化炭素が放出された後、混合物を500マイクロリットルのジクロロメタンを含む遠心分離管に移し、誘導体化された化合物を抽出します。サンプルを10秒間ボルテックスします。Gの10, 000倍で4分間遠心分離した後、パスツールピペットで各サンプルの下部有機相を収集し、円錐形のガラスインサートを含むGCオートサンプラーバイアルに移して、各サンプルをGCMS装置に直接注入できるようにします。ECFの手続きには、HPLC誘導体化試薬が使用されます。ECF試薬は頻繁に交換してください。DMF-DMA誘導体化の場合は、乾燥加水分解物を50マイクロリットルのメタノールと200マイクロリットルのアセトニトリルに溶解します。300マイクロリットルのDMF-DMAを加え、サンプルをボルテックスします。次に、円錐形のガラスインサートを含むGCオートサンプラーバイアルにサンプルを移します。BSTFA誘導体化の場合は、加水分解物を200マイクロリットルのアセトニトリルに懸濁します。200マイクロリットルのBSTFAをサンプルに加え、ガラス管を密閉します。摂氏135度で4時間インキュベートした後、冷却した抽出物を円錐形のガラスインサートを含むGCオートサンプラーバイアルに直接移します。次に、オートサンプラーインジェクターを装備し、質量分析計に結合したガスクロマトグラフでサンプルを分析します。コンピュータソフトウェアのメニューで[機器]をクリックします。[Sequence] タブで、[Edit Sample Log Table] をクリックしてサンプルリストを作成し、[Run] および [Run Sequence] をクリックして注入を開始します。分析が完了したら、各アミノ酸の異なる質量同位体に対応する強度のクラスターを記録します。15ミリリットルのガラス管中の5ミリリットルの上清に、10マイクロリットルの適切な重水素化内部標準液を加えます。1ミリリットルのジクロロメタンを加え、チューブをしっかりと閉じて、ロッキングプラットフォームでサンプルを20分間振とうします。遠心分離後、下部有機相を15ミリリットルのガラス管に集めます。ジクロロメタン抽出を繰り返した後、有機抽出物を無水硫酸ナトリウム500ミリグラム以上乾燥させ、パスツールピペットで液相を回収します。窒素フラックス下で抽出物を4倍に濃縮します。次に、濃縮したサンプルをGCオートサンプラーバイアルに移します。GCMS の定量では、2 マイクロリットルのサンプルを 10:1 の分割比で注入し、抽出した揮発性分子を適切なオーブン温度プロファイルを使用して分離します。テキストプロトコルのスプレッドシートを使用して、細胞外アミノ酸の濃度、細胞乾燥重量、細胞のタンパク質含有量、揮発性分子の濃度、タンパク質新生アミノ酸と揮発性分子の同位体濃縮に対応する生データ値を入力します。ここでは、ワイン発酵中に発見される複数の窒素源の酵母による管理を調査するワークフローの概略図を示します。サンプリングの異なるポイントについて、生物学的パラメータはフェルメンテーション間で高い再現性を示しています。ブドウジュースの供給源からすべてのタンパク質新生アミノ酸への窒素の再分布の概要を以下に示します。物質収支の決定と組み合わせたタンパク新生アミノ酸の同位体濃縮の測定により、窒素由来のアルギニン、グルタミン、アンモニウム、およびその他の供給源がこれらの各化合物のアミン基に寄与する最初の定量化が得られました。ここでは、バイオマスに直接回収される消費されたアミノ酸の量の比較が示されています。酵母の代謝ネットワークにおける消費された脂肪族アミノ酸、ロイシン、バリンの分配がここに示されています。消費されたバリンとロイシンの96%以上が、それらの変換製品で回収されています。驚くべきことに、バリンとロイシンのかなりの部分が、培地中のこれらの化合物の利用可能性とバイオマス中のそれらの含有量との間にかなりの不均衡があるにもかかわらず、異化されています。一度習得すれば、このテクニックは5日で完了することができます。この手順を試みる際には、科学的な問題に応じて基板のラベリング部分を慎重に選択することを覚えておくことが重要です。良好な生物学的再現性を確保するには、発酵分析とクロマトグラフィー分析を二重に実行します。この技術は、その開発後、微生物学分野の研究者が環境条件に応じて微生物の代謝と生理機能がどのように変化するかを探求する道を開きました。誘導体化試薬やアルギニン溶媒の取り扱いは非常に危険であるため、この手順を実行する際には、手袋を着用したり、ヒュームフードの下で作業したりするなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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学ぶ同位体トレーサー実験による複数栄養源の微生物代謝解析法。酵母の窒素代謝を定量的に調査し、消費された栄養素の行方と合成化合物の代謝的起源を明らかにする。再現性のある発酵技術が鍵となる。

複数の栄養源の微生物代謝を調査するため同位体トレーサー実験の組み合わせに基づいてワークフロー

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