複数の栄養源の微生物代謝を調査するため同位体トレーサー実験の組み合わせに基づいてワークフロー

この手順の全体的な目標は、標識基質を使用して複数の栄養源の代謝を定量的に調査することです。このワークフローにより、消費された栄養素の運命と、酵母によって合成された化合物の代謝起源を決定することができます。この方法は、環境条件に応じてすべての代謝がどのように機能するかなど、微生物代謝分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、複数の供給源からの栄養素分布のタンパク質の解明と定量化を可能にすることです。この方法は、酵母の窒素代謝を調べるために使用されましたが、他の代謝や微生物にも適用できます。この実験の成功の鍵は、発酵の再現性にあります。

ユーザーは、定義された同じ生理学的段階にある細胞を収集するために特に注意を払う必要があります。この手順を実演するのは、技術スタッフのChristian Picou氏、研究室の博士課程の学生であるPauline Seguinot氏、ポスドク研究員のStephanie Rollero氏です。オートクレーブで、各窒素源用に調製した各合成培地を、磁気攪拌棒を含む1リットルのフラスコで低温殺菌します。

適切な量の標識分子を溶解して、培地中の所望の最終濃度に到達します。使い捨て真空ろ過システムを使用して培地を滅菌します。滅菌計量シリンダーを使用して、マグネティックスターバーを含み、酸素の侵入を防ぎながら二酸化炭素の放出を可能にする発酵ロックが装備されている2つの滅菌済み発酵槽に培地を分割します。

YPD培地でセレビジエ株を増殖させた後、層流下で培養前アリコートを採取し、100マイクロメートルの開口部が取り付けられた電子粒子カウンターを使用して細胞集団を定量化します。前培養物を遠心分離した後、ペレットを適量の滅菌水に懸濁して、10の2.5倍の最終濃度を得るため、10〜9細胞/mLになります。次に、各発酵槽に1ミリリットルの細胞懸濁液を接種します。

これに続いて、21ポジションの攪拌プレートに適切に配置されたサポートガイドに発酵槽を設置し、攪拌速度を270RPMに設定して、発酵プラットフォームを準備します。各発酵のオンラインモニタリングを開始するには、ロボット制御アプリケーションを起動し、[アッセイの開始]ボタンをクリックして、実行する発酵量を選択します。表示されたインターフェースでプラットフォーム上の発酵槽の数と位置を表示できるようにするには、スロットの位置を右クリックして[無効]を選択し、空位置の監視を無効にします。

計算ソフトウェアを初期化するには、初期化ボタンをクリックして、OKで検証します。次に、ロボット制御アプリケーションの[開始]ボタンをクリックして、重量取得を開始します。次に、発酵槽から採取した2つの6ミリリットルのサンプルを2, 000倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。終了したら、凍結した上清をそれぞれ2本のチューブに移し、マイナス80°Cで保存します。

各ペレットを5ミリリットルの蒸留水で2回洗浄し、同位体濃縮の測定のために摂氏マイナス80度で保存します。2.5ミリモルのノルロイシンを内部標準として含む25%スルホサリチル酸溶液を800マイクロリットルのサンプルに200マイクロリットル加えて、高分子量の分子を除去します。インキュベーションおよび遠心分離後、0.22μmの細孔サイズのニトロセルロースメンブレンで混合物をろ過し、サンプルをアミノ酸分析システムに入れます。

分析システムのプログラムまたはソフトウェアで、「実行」ボタンをクリックして、陽イオン交換カラムを装備した分析装置で液体クロマトグラフィー分析を開始します。次に、予め調製した標識細胞ペレットを200マイクロリットルの過ギ酸に懸濁することにより、酸化抽出物を調製します。摂氏4度で4時間インキュベートした後、33.6ミリグラムの硫酸ナトリウムを加えて反応を停止します。

酸化抽出物に800マイクロリットルの6つの正常塩酸を加え、サンプルをハーブシールガラス管内で乾熱オーブンで摂氏110度で16時間インキュベートします。サンプルを室温まで冷ました後、200マイクロリットルの2.5ミリモルニューロロイシンを加え、窒素の流れで塩化水素ガスを除去します。乾燥抽出物を800マイクロリットルの蒸留水で2回洗浄し、次に800マイクロリットルのエタノールで洗浄します。

次に、800マイクロリットルの200ミリモル酢酸リチウムバッファーを抽出物に加えます。サンプル中のタンパク質中のアミノ酸の相対濃度を、前述のクロマトグラフィー法を用いて測定します。標識細胞ペレットを加水分解するには、1.2ミリリットルの6モル塩酸を添加し、乾熱オーブン内の密閉ガラス管内でサンプルを摂氏105度で16時間インキュベー

サンプルを室温まで冷ました後、1.2ミリリットルの蒸留水を加えます。遠心分離して細胞の破片を除去した後、上清を開放ガラス管内の6つの400マイクロリットルの画分に分配します。フラクションを105°Cの乾熱オーブンで4〜5時間乾燥させ、シロップの粘稠度に達するまで乾燥させます。

バイオマス加水分解中に、操作の酸を頻繁に制御することにより、シロップの粘稠度になるまで画分を乾燥させます。ECF誘導体化のためには、冷却した乾燥加水分解物を200マイクロリットルの20ミリモル塩酸と133マイクロリットルのピリジンとエタノールの1対4混合物に溶解します。50マイクロリットルのクロロギ酸エチルを添加して、アミノ酸を誘導体化します。

二酸化炭素が放出された後、混合物を500マイクロリットルのジクロロメタンを含む遠心分離管に移し、誘導体化された化合物を抽出します。サンプルを10秒間ボルテックスします。Gの10, 000倍で4分間遠心分離した後、パスツールピペットで各サンプルの下部有機相を収集し、円錐形のガラスインサートを含むGCオートサンプラーバイアルに移して、各サンプルをGCMS装置に直接注入できるようにします。

ECFの手続きには、HPLC誘導体化試薬が使用されます。ECF試薬は頻繁に交換してください。DMF-DMA誘導体化の場合は、乾燥加水分解物を50マイクロリットルのメタノールと200マイクロリットルのアセトニトリルに溶解します。

300マイクロリットルのDMF-DMAを加え、サンプルをボルテックスします。次に、円錐形のガラスインサートを含むGCオートサンプラーバイアルにサンプルを移します。BSTFA誘導体化の場合は、加水分解物を200マイクロリットルのアセトニトリルに懸濁します。

200マイクロリットルのBSTFAをサンプルに加え、ガラス管を密閉します。摂氏135度で4時間インキュベートした後、冷却した抽出物を円錐形のガラスインサートを含むGCオートサンプラーバイアルに直接移します。次に、オートサンプラーインジェクターを装備し、質量分析計に結合したガスクロマトグラフでサンプルを分析します。

コンピュータソフトウェアのメニューで[機器]をクリックします。[Sequence] タブで、[Edit Sample Log Table] をクリックしてサンプルリストを作成し、[Run] および [Run Sequence] をクリックして注入を開始します。分析が完了したら、各アミノ酸の異なる質量同位体に対応する強度のクラスターを記録します。

15ミリリットルのガラス管中の5ミリリットルの上清に、10マイクロリットルの適切な重水素化内部標準液を加えます。1ミリリットルのジクロロメタンを加え、チューブをしっかりと閉じて、ロッキングプラットフォームでサンプルを20分間振とうします。遠心分離後、下部有機相を15ミリリットルのガラス管に集めます。

ジクロロメタン抽出を繰り返した後、有機抽出物を無水硫酸ナトリウム500ミリグラム以上乾燥させ、パスツールピペットで液相を回収します。窒素フラックス下で抽出物を4倍に濃縮します。次に、濃縮したサンプルをGCオートサンプラーバイアルに移します。

GCMS の定量では、2 マイクロリットルのサンプルを 10:1 の分割比で注入し、抽出した揮発性分子を適切なオーブン温度プロファイルを使用して分離します。テキストプロトコルのスプレッドシートを使用して、細胞外アミノ酸の濃度、細胞乾燥重量、細胞のタンパク質含有量、揮発性分子の濃度、タンパク質新生アミノ酸と揮発性分子の同位体濃縮に対応する生データ値を入力します。ここでは、ワイン発酵中に発見される複数の窒素源の酵母による管理を調査するワークフローの概略図を示します。

サンプリングの異なるポイントについて、生物学的パラメータはフェルメンテーション間で高い再現性を示しています。ブドウジュースの供給源からすべてのタンパク質新生アミノ酸への窒素の再分布の概要を以下に示します。物質収支の決定と組み合わせたタンパク新生アミノ酸の同位体濃縮の測定により、窒素由来のアルギニン、グルタミン、アンモニウム、およびその他の供給源がこれらの各化合物のアミン基に寄与する最初の定量化が得られました。

ここでは、バイオマスに直接回収される消費されたアミノ酸の量の比較が示されています。酵母の代謝ネットワークにおける消費された脂肪族アミノ酸、ロイシン、バリンの分配がここに示されています。消費されたバリンとロイシンの96%以上が、それらの変換製品で回収されています。

驚くべきことに、バリンとロイシンのかなりの部分が、培地中のこれらの化合物の利用可能性とバイオマス中のそれらの含有量との間にかなりの不均衡があるにもかかわらず、異化されています。一度習得すれば、このテクニックは5日で完了することができます。この手順を試みる際には、科学的な問題に応じて基板のラベリング部分を慎重に選択することを覚えておくことが重要です。

良好な生物学的再現性を確保するには、発酵分析とクロマトグラフィー分析を二重に実行します。この技術は、その開発後、微生物学分野の研究者が環境条件に応じて微生物の代謝と生理機能がどのように変化するかを探求する道を開きました。誘導体化試薬やアルギニン溶媒の取り扱いは非常に危険であるため、この手順を実行する際には、手袋を着用したり、ヒュームフードの下で作業したりするなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。