単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

この手順の全体的な目標は、細胞を細胞懸濁液から単離し、単一細胞の下流分析に利用できるようにすることです。この方法は、リキッドバイオプシーや細胞の不均一性に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一細胞の抗体ベースの単離と、その後の単一細胞レベルでの分子遺伝学的解析のためのそれらの回復を可能にすることです。

患者での使用が許可されれば、この技術はがん患者の循環腫瘍細胞の特性評価を可能にします。この方法は、単一細胞間の不均一性に関する洞察を得ることができるため、血液サンプル、細胞培養からのサンプル、または解離した組織や臓器など、亜集団を含むあらゆる種類の細胞懸濁液に適用できます。この方法のアイデアが最初に浮かんだのは、下流の分析を目的として、細胞を放出することができないin vivo濃縮デバイスを使用したときでした。

レーザーマイクロダイセクションまたはマイクロマニピュレーションを使用して単一細胞を回収するステップは、単一細胞を回収するプロセスが細胞損失を起こしやすく、高度な専門知識を必要とするため、成功させることが難しいため、この方法を視覚的に実証することが重要です。予熱した細胞培養液1ミリリットルで、HT-29 CFSE標識細胞を再懸濁し、摂氏37度で30分間再生させます。細胞を回収するには、300 gで3分間遠心分離します。

次に、細胞ペレットを1ミリリットルの既製Hoechst 33342 DNA染色溶液に摂氏37度で10分間再懸濁します。次に、細胞懸濁液を300gで3分間遠心分離します。次に、上清を捨て、細胞ペレットを4ミリリットルの1Xリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁します。

次に、血球計算盤を使用して細胞数をカウントし、蛍光顕微鏡で蛍光標識を確認します。次に、細胞を300gで3分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットをミリリットルあたり約500,000細胞で再懸濁し、細胞を氷上に置く。末梢血の5ミリリットルに、約500から500, 000の細胞を加え、次いでチューブを反転させて混合する。

収納コンパートメントからワイヤーを取り外した後、ワイヤーを固定しているゴムキャップを取り外し、ワイヤーを1Xリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、チューブのキャップに取り付けます。次に、傾斜させたローラーミキサーでチューブを毎分5回転、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、1Xリン酸緩衝生理食塩水でワイヤーを3回すすぎます。

次に、1Xリン酸緩衝生理食塩水が入った15ミリリットルのチューブにワイヤーを暗所で保管します。グリースペンを使用してスライドガラスに長方形の領域を描き、その上に500マイクロリットルの1Xリン酸緩衝生理食塩水を追加します。ワイヤーの機能部分を1Xリン酸緩衝生理食塩水に浸すには、ワイヤーの機能していない部分を曲げてスライドガラスの上に置きます。

キャプチャされたセルの数をカウントするには、ワイヤの両側を目視検査します。検査後、ワイヤーを1Xリン酸緩衝生理食塩水を入れた15ミリリットルのチューブに戻し、暗所に保管します。1ミリリットルの1Xリン酸緩衝生理食塩水に、4ミリグラムの放出緩衝液成分を溶解し、0.2マイクロメートルの滅菌フィルターで溶液をろ過して、すぐに使用できる緩衝液を得ます。

次に、リリースバッファーを摂氏37度で5分間温めます。温めたら、1.6ミリリットルの放出バッファーを移して、1.5ミリリットルの反応チューブを完全に満たします。次に、ワイヤーの機能部分を37°Cのリリースバッファーに含み、ウォーターバスで20分間インキュベー

インキュベーション後、ワイヤーを毎分500回転で15分間シェーカーに置きます。次に、ワイヤーを300gで10分間遠心分離します。遠心分離が終了したら、チューブからワイヤーをずらし、キャップを閉じて、チューブを再度300gで10分間遠心分離します。

細胞懸濁液の量を減らすには、マイクロマニピュレーション用に100マイクロリットルの上清を除くすべての上清を廃棄するか、その後の細胞遠心分離およびレーザーマイクロダイセクション用に300マイクロリットルを廃棄します。その後、すぐにシングルセルサンプリングに進みます。マイクロマニピュレーションでは、100マイクロリットルの細胞懸濁液全体をスライドガラスに移します。

次に、スライドガラスをマイクロマニピュレーターを備えた顕微鏡に置き、細胞を5分間沈殿させます。次に、0.2ミリリットルのPCRチューブで、2マイクロリットルの細胞溶解マスターミックスをピペットでピペットで移動させ、氷上に移します。マイクロマニピュレーターを使用して、1マイクロリットルの1Xリン酸緩衝生理食塩水に1つの細胞を採取します。

次に、細胞を2マイクロリットルの細胞溶解マスターミックスに直接移します。デスクトップマイクロフュージを使用して、サンプルを2, 000 gで3秒間すばやくスピンダウンし、チューブの底に液体を収集します。その後、サンプルを氷上に移し、アダプターリンカーベースの全ゲノム増幅に進みます。

最大で1マイクロリットルのバッファーを使用して、1つの細胞のみを吸引します。細胞を溶解液に移すときは、溶液から気泡が発生し、すべての吸引量が移されたことを確認してください。レーザーマイクロダイセクションの場合、300マイクロリットルの細胞懸濁液全体を300gのメンブレンコーティングスライドに5分間細胞遠心分離します。

次に、メンブレンコーティングされたスライドをレーザー顕微鏡で解剖できる顕微鏡に置きます。次に、4.5マイクロリットルの細胞溶解マスターミックスを0.2ミリリットルPCRチューブのキャップにピペットで挿入します。サンプルの上にキャップを置き、レーザーマイクロダイセクションによって単一細胞を回収します。

その後すぐに、PCRキャップに単離された細胞がないか確認し、レーザーマイクロダイセクション顕微鏡からPCRチューブを取り外し、チューブを閉じます。チューブの底にすべての液体を短いスピンで集めます。サンプルを氷上で移し、アダプターリンカーベースの全ゲノム増幅に進みます。

レーザーマイクロダイセンテッドセルを必ず回復させてください。そのため、チューブキャップ全体を溶解液で覆うことが重要です。マイクロダイセクション後、チューブキャップに細胞が存在するかどうかを確認します。

CFSEおよびHoechst 33342で染色された細胞を示すために、ワイヤーを充電する前、細胞をワイヤーに付着させている間、次にワイヤーから分離し、最後にスライド上で免疫蛍光イメージングを行いました。チャージ前の細胞の免疫蛍光画像は、青色で明るい核染色を示していますが、細胞の細胞質は、不均一な細胞間強度で緑色のCFSE染色を示しています。同様の染色パターンは、ワイヤーに付着し、その後ワイヤーから剥離した細胞にも観察されます。

全ゲノム増幅産物の品質を確認するために、1%アガロースゲルを泳動しました。アガロースゲルは、全ゲノム増幅のPCR産物について、0.2から1キロベースを超える範囲のDNA塗抹標本を示します。シングルセルから得られた4plex品質管理PCR産物は、100、200、300、および400塩基対の産物をもたらします。

バンドが 3 つ未満の製品は、以降の分析から除外されます。この手法を習得すると、適切に実行すれば、細胞懸濁液から単一細胞を4時間で単離することができます。この手順を試みるときは、特に細胞がワイヤーに取り付けられている間は、細胞を傷つけないように、細胞をバッファーに沈めておくことを忘れないでください。

この手順に続いて、コピー数の変動と突然変異に基づいて単一細胞を特徴付けるために、領域比較ゲノムハイブリダイゼーション、次世代シーケンシング、標的特異的PCRなどの解析方法を実行できます。このビデオを見れば、官能基化ワイヤーを使用して細胞懸濁液から細胞を単離および回収する方法や、複数のダウンストリーム分子遺伝学的解析のために単一細胞をサンプリングする方法について十分に理解できるはずです。人間の血液を扱う作業は感染の可能性があるため、この手順を実行する際には手袋と白衣の着用が義務付けられていることを忘れないでください。