Name: 単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶ単一細胞分離法による希少標的細胞の前濃縮と全ゲノム増幅技術。抗体ベースのワイヤー分離とマイクロマニピュレーションを用いて、循環腫瘍細胞の分子遺伝学的解析を可能にする革新的な液体バイオプシー手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、オーストリア科学基金 (FWF)、プロジェクト no によって賄われていた。私は ERANET プロジェクト並進癌研究 (TRANSCAN)「前立腺がん (CTC スキャン) 微小残存病変に対するバイオ マーカーとして循環腫瘍細胞」の一部として (の ps) に 1220 B19。博士後期課程サウスカロライナは、グラーツ医科大学の PhD プログラム分子医学の枠内で訓練されました。著者感謝して、専門的な技術支援のニーナ反応における触媒表面、ダニエル ・ クンマー、ガビ Wendt、クラウディア Chudak、ジュリア シュルツ、ヨハンナ ・ シラーを認めます。著者はゲオルク ・ Peinhaupt のグラフィック デザイン サポートをありがちましょう。

<ol><li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li>
<li>Kuske, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+circulating+tumor+cells+in+non-metastatic+high-risk+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients.</a> Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).</li>
<li>van Beers, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR+predictor+for+aCGH+success+of+FFPE+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples.</a> Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).</li>
<li>El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Multiplex+PCR+for+Assessing+the+Quality+of+Whole+Genome+Amplified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA.</a> Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).</li>
<li>Möhlendick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust+Method+to+Analyze+Copy+Number+Alterations+of+Less+than+100+kb+in+Single+Cells+Using+Oligonucleotide+Array+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67031(2013).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+Release%3A+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci Rep-UK. 7, 43424(2017).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+molecular+characterization+of+circulating+tumor+cell+using+an+in+vivo+capture+system+in+squamous+cell+carcinoma+of+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck.</a> Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).</li>
<li>Carter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+circulating+tumor+cells+identifies+distinct+copy-number+profiles+in+patients+with+chemosensitive+and+chemorefractory+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).</li>
<li>Luca, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+single+circulating+tumor+cells+by+next+generation+sequencing+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+of+Circulating+Tumor+DNA+for+Early+Cancer+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection.</a> Cell. 168 (4), 571-574 (2017).</li>
<li>Page, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+Sequencing+of+Circulating+Cell-Free+DNA+for+Evaluating+Mutations+and+Gene+Amplification+in+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer.</a> Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).</li>
<li>Kalinich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-based+signature+enables+high+specificity+detection+of+circulating+tumor+cells+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accession+of+Tumor+Heterogeneity+by+Multiplex+Transcriptome+Profiling+of+Single+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells.</a> Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).</li>
<li>Sinkala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+protein+expression+in+circulating+tumour+cells+using+microfluidic+western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting.</a> Nat Commun. 8, 14622(2017).</li>
<li>Morrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumourigenic+non-small-cell+lung+cancer+mesenchymal+circulating+tumour+cells%3A+a+clinical+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study.</a> Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).</li>
<li>Williamson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+in+small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer.</a> Nat Commun. 7, 13322(2016).</li>
<li>Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Microdissection+of+FFPE+Tissue+Areas+and+Subsequent+Whole+Genome+Amplification+by+Ampli1TM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM.</a> Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).</li>
<li>Czyż, Z. T., Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+Whole-Genome+Amplification+of+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells.</a> Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+retrieval+of+single+microchimeric+cells+and+verification+of+identity+by+on-chip+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li>
<li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219(2017).</li>
<li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-53661-3_12">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24556840">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S157478911600017X">Circulating tumor cell technologies.</a> Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

記述されていたプロトコルは前のヴィヴォ単一細胞のゲノム解析の機能性ワイヤ (デバイスと呼ばれる) からのセルの取得を目指しています。3 EpCAM 陽性細胞 (HT 29、LNCaP, と VCaP) をテストしました、EpCAM を表現する任意のセルの行には、原則としてこの方法を適用できます。EpCAM 肯定的な標的細胞を純粋な細胞懸濁液としてデバイスに表示できる (2.1 を参照してください). または背景セルの黒字に混合 (e.g。 末梢血, 2.2 を参照してください。)。特に後者を使用する珍しいセル条件下で分離能力を試験するのに対し、ワイヤーに接続されているセルの数の微調整を行うことが記載されている低ボリュームを使用してアプローチ (2.3 を参照してください).。細胞ライン間の相違が予想されるとおり、ワイヤー、回転を充電するための適切なセル密度速度同様インキュベーション時間は蛍光顕微鏡を使用して接続されているセルの数を評価することによって実験的にテストする必要があります。
WGA の単一細胞レベルでゲノム下位アプリケーションが必要です。WGA の選択の方法は、ラボによって異なるかもしれませんが、原則として、本手法はマイクロマニピュレーションやレーザー顕微解剖から得られたサンプルを処理できるよりもすべてのメソッドにオープン。このプロトコルでは熱の断片化による WGA7と比較してパフォーマンスを向上させるための酵素によって断片化された DNA に基づくメソッドを使います。省略可能な単一セルは、20,21以降 DNA を許可する等温 WGA に転送できます。
記述されていたプロトコルは、ゲノムの単一細胞解析の機能ワイヤの新しい世代にアタッチした後はそのままなセルの回復を目指しています。これまでのところ市場で生体内で唯一の CE 承認された濃縮デバイスを表し、官能のワイヤの最初の世代は、転移がん患者で Ctc を列挙するために使用されました。以前の出版物および私達の自身のデータは、現在のゴールド スタンダード技術2と比較してより敏感であるため生体内で分離手法を提案します。したがって、単一細胞レベルでの解析と高 CTC 復旧を組み合わせることにより、デバイスで実現、この生体内で分離手法では回復機能を装備します。
しかし、患者で使用するため、デバイスは消去されません、したがって、臨床データはご利用いただけません。前のヴィヴォアプリケーション (すなわちサンプリング後の末梢血から Ctc を分離する) 技術の設定肘無駄、例えば低直径無駄 (増加の確率の存在に適応としては推奨されませんCtc とキャッチ抗体間の接触を直接) と長い保持時間 (30 分) 2-3 L 血のワイヤーを渡すことができます。しかしで説明セクション 2.2。標的細胞の混合サンプル7から分離も可能です。
メソッドの現在の制限は、電線から剥離後未固定細胞の非効率的なリカバリです。これはしかし、セル固定が剥離治療前に一歩改善可能性があります。
要約すると、このプロトコルは遺伝的単一細胞を特徴付けるための細胞回復と生体内での分離法の併用への第一歩です。一層の努力は、細胞回復、患者1,2への応用にクリアランスの最適化に対処する必要があります。しかし、治療のモニタリングと治療の決定のための個別化医療は Ctc の列挙体外です。したがって、このメソッドは、単一セルのレベルでゲノムの CTC 特性への第一歩です。
単一細胞のトランスクリプトーム解析に向けてのアプリケーションはようそのままなセルを収穫可能。ただし、それは復元の手順 RNA 整合性 (例えば転送直接溶解 Rt-qpcr22続いて回復された単一セル) の影響があるかどうか評価する残ります。成功した場合は、トランスクリプトームのレベルより詳細な解析を可能に単一細胞 (Ctcなど) の特性を移すことができます。この点、RNA シーケンス (RNA シーケンス ライブラリの準備時に得られた) preamplified cDNA を量的な PCR に受けることができます、単一細胞の RNA 下流解析の貴重なツールを提供しますスマート seq2 を使用します。これは、結合されたターゲットと回復した単細胞22,23のスクリーニングに基づく解析が許可されます。
現在の機能性線は Ctc24の肯定的な選択のために広く使用されている上皮性マーカーである抗 EpCAM 抗体に基づいています。いくつか Ctc では、レセプター サイトケラチンなど EpCAM25上皮系マーカーを可能性があります、HER2/新しいなどの抗体を追加で CTC 分離のチャンスを高めるでしょう。いくつかの抗体と濃縮戦略開発・ フェレイラらによって検討しました。201626。ワイヤに固定化した抗体の混合物より高い番号の分離と Ctc のサブタイプにつながる技術の将来の改善可能性があります。
ワイヤは、その機能を維持するために溶液中浸漬ワイヤの一部の機能を維持する処理を含むすべての手順は必須です。1x PBS で評価 (顕微鏡; 中にワイヤを配置するをお勧めします例えば。 3.1 の手順。-3.3.)そして記憶。不適切な染色を避けるために、手順 1.2.1 で染色液を準備たてを使用をお勧めします。1.2.2 と。弱陽性細胞細胞を頼りにワイヤーを妨げるし、接続されたセルの過小評価につながる可能性があります。
細胞懸濁液 (手順 2.3.4。) の後続の読み込みをパスツール ピペットでワイヤーを挿入するときにゴム製のキャップをパスツール ピペットを差し込むことは避けるべきです。ゴム製のキャップは、パスツール ピペットの先端内部機能の一部にあるので、場所にワイヤーを保持するために使用されます。キャップは、パスツール ピペットの後部にもしっかりと接続されている場合、細胞懸濁液の読み込みは不可能です。この場合、読み込まれた細胞懸濁液によって転置される空気は、ピペットを残すことができますようにキャップを緩和します。
ワイヤーを曲げは、3.2 の手順を数えるセル中にその方向に不可欠です。3.3。ワイヤーの非機能的な一端を 1 つの側面に嘘をつくような粘着テープを使用してワイヤーをマウントします。一部の機能の全体の長さをスキャンした後、ワイヤーは機能ワイヤの他の半分をスキャンすることができますので 180 ° がロールバックされます。この手順は、ワイヤ上のセルの数を評価する最初の実験のために重要です。セルをカウントせずに手順を繰り返すことができます特定の細胞およびプロシージャのための細胞の数が評価されると (e.g。 だけ細胞の存在を確認し、この手順を省略)。注意ピペッティング ステップ 4.8 の上澄みの量を減らすとき、セル損失を避けるために重要です。ペレットに乱れを発生させることがなくスムーズに行われ、ピペッティングを確認します。

最近、CellCollector DC01、修飾と癌患者の末梢血から Ctc を隔離するため抗 EpCAM 抗体医療用ワイヤー線は CTC 列挙1,2,3 の整然としたスペクトルに追加されました.非転移性前立腺癌で現在進行中の研究、この官能ワイヤー レポートは CTC 陽性 2 回ほぼ多くの患者および CellSearch、CTC 列挙型3 のゴールド スタンダードと比較して CTC 陽性で高い CTC カウント.この奨励のパフォーマンスによる単一細胞解析用機能性医療線からセルの隔離が望ましいが細胞剥離ソリューション (例えばトリプシン) で酵素処理もレーザ切断可能そのままなセル (データは示されていない) の回復。
キャプチャされた細胞の剥離をできるように、官能のワイヤの新世代は特定のポリマーが装備されていた。キャプチャー抗体をワイヤーにリンク、このポリマーは (CellCollector DC03 のデバイスとする呼ばれる) そのままなセルの取り外しを許可するリリース バッファー処理に影響を受けやすい。新しい機能性デバイスにより、癌細胞にウシ血清アルブミン (BSA) スパイクの濃度から標的細胞の分離/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と末梢血、それぞれ。
デバイスに回復後、細胞の視覚的検出を容易に標的がん細胞が付けられて carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) と回復の治療前に DNA 染色 (すなわち。 充電およびデタッチ)。単一細胞の DNA の品質に、治療の効果、品質コントロール PCR4、5、アレイ CGH6,7によって WGA 後以前に評価したし、ターゲット シーケンス7差が認められなかったに比べて非処理細胞 micromanipulated 細胞懸濁液7から。この方法の利点は、まれなターゲット細胞前濃縮の組み合わせと単一細胞下流解析 (図 1) のための細胞の回復であります。現在体内に CE ラベル コレクション デバイスは、単一細胞分子生物学2,8ではなく、Ctc の列挙に一般的に使用されます。ただし、Ctc の不均一性を調査するためのより包括的な解析 (すなわち対象と単一細胞レベルのシーケンス) 個々 のセル レベル分析の長い。他のセル ベースの方法は、免疫 EpCAM 正 CTCs 及びその後の分子遺伝学的解析9,10の誘電泳動に基づく単一細胞処理の分離に基づいています。Ctc の分子特性は臨床の現場で役に立つ実装にとって重要な要件と転移連鎖の基礎的研究にも同様に重要。Ctc に並行して、循環腫瘍 DNA (葉緑体) なっている非常に重要なことで最小限の技術分離手順11,12と腫瘍の重荷の DNA 解析。セルベース アプローチ RNA13,14タンパク質15式分析の相補的な貢献として役立つかもしれないこと、また CTC 派生セル文化または異種16,17. 低細胞の回復と患者の使用のためのクリアランスなどの障害物は、まだ克服しなければならない必要ですが、キャッチとリリース メソッドはまれなターゲット セルの特性評価に向けた重要な次のステップです。

<table><tbody><tr><td>Gilupi Release Buffer</td><td>Gilupi</td><td>GIL083</td><td>ワイヤーから細胞を取り外すために使用</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16600-082</td><td>HT-29細胞に使用した培地は、実験に使用した細胞株に培地を適応させます</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td><td>PAA</td><td>S11-001</td><td>Supplement for McCoy's 5A Medium</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Supplement for McCoy's 5a modified medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td>Supplement for McCoy's 5a Modified</td></tr><tr><td>Medium Phosphate Buffered Saline (1x PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biowest</td><td>L0950-100</td><td>Cell detachment solution (cell culture)</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>GFL</td><td>Type 1003</td><td>温め液に使用</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>細胞のインキュベート(細胞培養)に使用</td></tr><tr><td>50mL 反応チューブ</td><td>VWR</td><td>525-0403</td><td></td></tr><tr><td>ローラーミキサー</td><td>スチュアート・サイエンティフィック</td><td>SRT6D</td><td>細胞が沈殿するのを防ぎながら、細胞をワイヤーに取り付けて使用</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 細胞増殖キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C34554</td><td>生細胞の標識に使用(細胞質標識)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>H3570</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>DNAの染色に使用(核対比染色)</td></tr><tr><td>遠心分離機(15 mLおよび50 mLの反応チューブを保持するために装備)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ヘレウスメガフュージ40R</td><td>細胞のペレット化に使用</td></tr><tr><td>オブザーバーZ1(蛍光/レーザーマイクロダイセクション顕微鏡)</td><td>カールツァイスマイクロイメージング</td><td></td><td>レーザーマイクロダイセクションが可能な倒立型(免疫蛍光)顕微鏡。蛍光顕微鏡は、Hoechst 33342(DAPIフィルター)およびCFSE(FITCフィルター)</td></tr>ウ<tr><td>シ血清アルブミン(BSA)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A4503-50G</td><td>ガラス/プラスチック表面のコーティングに使用</td></tr><tr><td>MS1ミニシェーカー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>Z404039</td><td></td></tr> バ<tr><td>キュテイナーEDTA(またはNa-ヘパリン)チューブ</td><td>BD</td><td>366450(または366480)</td><td>ターゲット細胞のex vivoキャプチャのための反応チューブとして使用されます</td></tr><tr><td>Detektor CANCER03 DC03</td><td>Gilupi</td><td>GIL003</td><td>EpCAM陽性細胞(catch&;とも呼ばれます)を分離および剥離できる機能化ワイヤーリリース、C&R)</td></tr><tr><td>シリンジ針(G20)</td><td>VWR</td><td>613-0554</td><td>C&の非機能部分を可能にするためにゴムキャップを穿刺するために使用されます。それを通して導くためにR</td></tr><tr><td>ノイバウアー</td><td>チャンバーRoth</td><td>T729.1</td><td>細胞を数えるために使用されます</td></tr><tr><td>パスツールピペット 150 mm</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>C&R</td></tr><tr><td>グリースペン</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>スライドガラスに使用して細胞懸濁液を所定の位置に保持</td></tr><tr><td>滅菌シリンジフィルター (0.2 & micro;m)</td><td>コーニング</td><td>431219</td><td>新たに調製されたGilupiリリースバッファーDelfia</td></tr><tr><td>PlateShakerパー</td><td>キンエル</td><td>マー1296-003</td>をろ過するため <td>細胞剥離中の攪拌に使用</td></tr><tr><td>1.5mLチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>30,125,150</td><td></td></tr><tr><td>Ampli1 WGAキット</td><td>シリコンバイオシステム</td><td></td> シリコン<td>バイオシステムズを介して注文する</td></tr><tr><td>ミクロマニピュレーターMMJとCellTram vario</td><td>Zeiss/Eppendorf</td><td></td><td>手元でマイクロマニピュレーションを使用</td></tr><tr><td>マイクロキャピラリー (25 & micro;直径m)、CustomTip Type I</td><td>エッペンドルフ</td><td>930001201</td><td>細胞のマイクロマニピュレーションに使用</td></tr><tr><td>0.2mL PCRチューブ</td><td>Biozym</td><td>710920</td><td></td></tr><tr><td>サイト遠心分離機および機器</td><td>Hettich</td><td>Universal 32</td><td>手元でサイト遠心分離機を使用</td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>DNAエンジン ダイアド</td><td>加熱蓋付きのすべてのサーモサイクラーは、</td></tr>マイクロ<tr><td>遠心分離機</td><td>ロスを使用できます</td><td>CX73.1</td><td>手元に卓上遠心分離機を使用</td></tr><tr><td>MembraneSlide 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415101-4401-050</td><td>レーザーマイクロダイセクションに使用されるメンブレンコーティングガラススライド</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>DNAクロスリンカーを手元に使用</td></tr><tr><td>標準PCR試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6x DNA ローディング</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R0611</td><td>ゲルを使用手元に色素をローディング</td></tr><tr><td>DNAラダー</td><td>BioLabs</td><td>N0551G</td><td>手元に100 bpのラダーを使用</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>ゲル電気泳動ステーション</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td>手元に電気泳動システムを使用</td></tr><tr><td>ゲル レッド核酸染色</td><td>ビオチウム</td><td>41003</td><td>DNA可視化のためのインターカレート色素 アガロースゲル</td></tr></tbody></table>

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

まれな標的細胞は標的細胞の表面蛋白質の特異抗体を用いた非標的細胞の高いバック グラウンドから分離することができます。最近開発された方法は、医療用ワイヤー線の循環腫瘍細胞 (CTCs)1の絶縁に生体内で抗上皮細胞接着分子 (EpCAM) 抗体修飾を使用します。非転移性前立腺癌患者照合のコホートは、生体内で分離技術は、Ctc として CTC 列挙体の現在のゴールド スタンダードと比較して高い CTC 数陽性患者の割合が高いの結果を示した。セルは、現在の医療機器から復旧できない、(デバイスと呼ばれる) 新しい機能性ワイヤーはキャプチャと後続の剥離細胞の酵素処理でに製造されました。細胞は顕微鏡で視覚化、酵素処理を使用して、デバイスに接続できるとしています。回復した細胞膜コーティング スライド cytocentrifuged、レーザ切断またはマイクロマニピュレーションによる個別に収穫します。単一セルのサンプル スクリーニングとターゲット固有のアプローチを含む複数のダウン ストリーム解析を許可する単一細胞ゲノム増幅を受けます。隔離および復元の手順は単一セルから高品質 DNA を生成し、以降の全ゲノムの拡大 (WGA) を損なうことはありませんできます。単一セルの増幅された DNA のスクリーニングに転送することができますおよび/または配列比較ゲノム交配 (アレイ CGH) やシーケンスなどの分析を対象としました。デバイスには、珍しい人工細胞サンプル (すなわち500 標的細胞が末梢血 5 mL にスパイク) から分離前のヴィヴォことができます。広い範囲の細胞ラインの使用に依存して細胞の剥離料金は許容範囲 (50-90%) である一方スライド上に剥離細胞の回収率にまたがる (< 10 - > 50%) といくつかのさらなる注意が必要があります。患者の使用のため、このデバイスは消去されません。

CFSE と核酸染色後の細胞は、DAPI の FITC フィルター搭載蛍光顕微鏡を用いた評価できます。細胞の細胞質を示す (図 2 aと2 e) 異種のセル間強度と CFSE と制服ラベルに対し核を DAPI チャネルで明るい対比染色と提示します。似た形や強度を染色がワイヤ (図 2 bと2 f) に接続されているセルからの期待と同様ワイヤーを切り離す、スライド (図 2 Dと2 H) の回復します。
高細胞密度 (例えば&gt; 1 000 000 細胞/ml) ワイヤーを充電時細胞とワイヤの全体をカバーになります。しかし、細胞の密度を低く、インキュベーション中に回転速度の変化と別の細胞ラインの使用の分離効率に影響を与える個別にテストする必要があります。ときワイヤー培養 5 ml 100 000 で HT 29 セルのセル/セクション 2.1 で説明として mL。、254 ± 103 セルの平均値 (n = 5) ワイヤで捕えられました。同じ平均 440 ± 319 細胞 LNCaP 細胞を用いた実験 (n = 5) ワイヤあたりが得られました。
75 ± 18 セル、25 ± 9 セル、および 47 ± 57 細胞の捕獲で起因した提示 (プロトコル セクション 2.2) によるとワイヤーに末梢血 5 mL のバック グラウンドで 500、5 000、50 000 の HT 29 細胞 (n = 3、それぞれ)、それぞれ。ワイヤーはセクション 2.3 でプロトコルに従って細胞懸濁液 (1 000 000 細胞/mL) の 15 μ L と満たされるかどうか。、1 000 (HT 29) まで細胞をワイヤーに添付可能性があります。
HT 29 セルで 81% であった剥離効率を細胞 (54.9% 93.2%、および n の範囲 = 5) 81% (63.51%-92.87%、n の範囲 = 6) と 91% (84.7%-95.3%、n の範囲 = 6) VCaP と LNCaP 細胞それぞれ。同様に、剥離細胞の回復は違い細胞: 戸建 HT 29 セルの 28% の平均が cytocentrifugation によって回復されました。LNCaP の回収率は 10% よりも低い、VCaP セルの平均回収率 55% であった。
単一細胞の約 75% が収量高品質 WGA WGA を受ける: これは 1) 0.1 から &gt; 1 kb (図 4、上部パネル)、2) 3 まで WGA 製品の汚れまたは 4 plex 品質の 4 バンド コントロール PCR (図 4下のパネル).WGA 製品の 1) アレイ CGH 後再増幅 WGA 7単一セル配列 CGH プロファイル6,7と 2) ターゲットを絞った NGS の品質基準を満たすプロファイルを使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> 図 1: 分離および単一細胞解析のための標的細胞を回復するためのワークフロー 。(A) 90% の confluency に培養される細胞および(B)単一細胞懸濁液を取得する収穫します。CFSE と核酸染色、 (C)官能のワイヤを染色後は 5 mL の反応管を使用してのボリューム、パスツール ピペット チップを使用して少量の細胞の存在下で培養しました。後者は、細胞懸濁液ボリュームのアプリケーション 15 μ L と低(D)セルは充電後 4 時間以内にデタッチする必要があります。したがって、ワイヤは、1.5 mL の反作用の管をリリース バッファーでいっぱいに配置されます。ロッカーで 10 分遠心 15 分後、ワイヤが削除され、セルをペレットに細胞懸濁液を遠心しました。(E)回復済みセルがどちらか単一セル マイクロマニピュレーション (上) または cytocentrifuged 膜コーティング スライドにスライド ガラスに転送され、レーザーマイクロダイ セクション (下部) に転送されます。(F)最後に、収穫の単一セルは、全ゲノムの拡大 (WGA) によって増幅されます。WGA の製品は、アレイ CGH と NGS 下流解析と互換性が。EpCAM エピトープ: 細胞表面に緑色の円。ワイヤーを官能基化: 灰色のトリプル ヘリカル ワイヤ デバイス。ポリマー: 紫のライン。アンチ EpCAM 抗体: オレンジ。解放バッファー活動: 赤い矢印。代わりに細胞懸濁液を保持するグリース マーカー: 暗い青色の楕円。細胞懸濁液を回復: 水色します。マイクロマニピュレーション用キャピラリー: 黒のライン。倍率: マイクロマニピュレーションにより収穫された回復されたセル、膜で覆われた上 cytospin 回復を含んでいるセル (灰色塗りつぶし楕円) をスライドさせます。倍率: 回復されたセルがされている microdissected のレーザー (灰色の円の線: レーザ切断のためのバックボーンとして膜スライドから膜)、レーザー (膜スライドを下から近づいて青線) を用いた客観的。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> 図 2: ラベル付きセルの視覚化します。(A ・ E)充電する前にセル: セルを付けられて CFSE して染料 CFSE 範囲 (緑) の信号強度を示す間をインターカ レート DNA と counterstained。(B、F)ワイヤーでキャプチャされた細胞。(C、G)細胞の剥離処理後に配線します。(D,H)セル ワイヤから切断し、スライドに cytocentrifugation によって回復します。CFSE: FITC チャンネル (グリーン)。DNA 染色: DAPI チャネル (青)。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> 図 3: ワイヤーおよびストレージコン パートメント。(A)電線のコンパートメント。(B)機能部分のディテール。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> 図 4: WGA 製品の品質管理は、単一の micromanipulated 細胞から得られた。上部パネル: 単一細胞から得られた WGA 製品通常 DNA の結果塗抹 0.5 kb のまわりでピーク強度と &gt; 1.0 kb 0.2 kb に至る。サンプル数 1、7、13 (アスタリスクで示される) 最適ではない表示または DNA を塗りません。底板: WGA 製品が十分な品質の 3 つまたは 4 つの PCR の製品の 4 4 plex PCR が得られます (100、200、300、400 で bp)。1、7、10、および 13 のサンプルより少ない 3 つのバンドを表示、さらに分析から除外されます。レーン M 100 bp ラダーを含み、アスタリスクが不十分な WGA 製品品質のサンプルを示します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>プライマー シーケンス</td>
			<td>メモ</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' gtt cca ata tga ttc cac cc-3 '</td>
			<td>100 bp 前方プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 '</td>
			<td>100 bp 逆プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' agg tgg agc ギャグ gct agc-3 '</td>
			<td>200 bp 前方プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 '</td>
			<td>200 bp 逆プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' agg tga gac att ctt gct gg-3 '</td>
			<td>300 bp 前方プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' tcc 法 aac cag tca gcg tc-3 '</td>
			<td>300 bp 逆プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-aca gtc 猫 gcc atc 法 gc-3 '</td>
			<td>400 bp 前方プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' gct tga caa agt ggt cgt tg-3 '</td>
			<td>400 bp 逆プライマー</td>
		</tr>
</tbody></table>4 plex 品質コントロール PCR のプライマー シーケンスを表 1:

このプロトコルは、回復し、単一細胞レベルの分子遺伝学的解析の非対象の背景セルの混合物から珍しいターゲット セルを準備することです。DNA の品質は非処理の単一細胞であるし、により、単一セルに適用 (両方のスクリーニング ベースし、解析を対象とした)。

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

この手順の全体的な目標は、細胞を細胞懸濁液から単離し、単一細胞の下流分析に利用できるようにすることです。この方法は、リキッドバイオプシーや細胞の不均一性に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一細胞の抗体ベースの単離と、その後の単一細胞レベルでの分子遺伝学的解析のためのそれらの回復を可能にすることです。患者での使用が許可されれば、この技術はがん患者の循環腫瘍細胞の特性評価を可能にします。この方法は、単一細胞間の不均一性に関する洞察を得ることができるため、血液サンプル、細胞培養からのサンプル、または解離した組織や臓器など、亜集団を含むあらゆる種類の細胞懸濁液に適用できます。この方法のアイデアが最初に浮かんだのは、下流の分析を目的として、細胞を放出することができないin vivo濃縮デバイスを使用したときでした。レーザーマイクロダイセクションまたはマイクロマニピュレーションを使用して単一細胞を回収するステップは、単一細胞を回収するプロセスが細胞損失を起こしやすく、高度な専門知識を必要とするため、成功させることが難しいため、この方法を視覚的に実証することが重要です。予熱した細胞培養液1ミリリットルで、HT-29 CFSE標識細胞を再懸濁し、摂氏37度で30分間再生させます。細胞を回収するには、300 gで3分間遠心分離します。次に、細胞ペレットを1ミリリットルの既製Hoechst 33342 DNA染色溶液に摂氏37度で10分間再懸濁します。次に、細胞懸濁液を300gで3分間遠心分離します。次に、上清を捨て、細胞ペレットを4ミリリットルの1Xリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁します。次に、血球計算盤を使用して細胞数をカウントし、蛍光顕微鏡で蛍光標識を確認します。次に、細胞を300gで3分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットをミリリットルあたり約500,000細胞で再懸濁し、細胞を氷上に置く。末梢血の5ミリリットルに、約500から500, 000の細胞を加え、次いでチューブを反転させて混合する。収納コンパートメントからワイヤーを取り外した後、ワイヤーを固定しているゴムキャップを取り外し、ワイヤーを1Xリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、チューブのキャップに取り付けます。次に、傾斜させたローラーミキサーでチューブを毎分5回転、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、1Xリン酸緩衝生理食塩水でワイヤーを3回すすぎます。次に、1Xリン酸緩衝生理食塩水が入った15ミリリットルのチューブにワイヤーを暗所で保管します。グリースペンを使用してスライドガラスに長方形の領域を描き、その上に500マイクロリットルの1Xリン酸緩衝生理食塩水を追加します。ワイヤーの機能部分を1Xリン酸緩衝生理食塩水に浸すには、ワイヤーの機能していない部分を曲げてスライドガラスの上に置きます。キャプチャされたセルの数をカウントするには、ワイヤの両側を目視検査します。検査後、ワイヤーを1Xリン酸緩衝生理食塩水を入れた15ミリリットルのチューブに戻し、暗所に保管します。1ミリリットルの1Xリン酸緩衝生理食塩水に、4ミリグラムの放出緩衝液成分を溶解し、0.2マイクロメートルの滅菌フィルターで溶液をろ過して、すぐに使用できる緩衝液を得ます。次に、リリースバッファーを摂氏37度で5分間温めます。温めたら、1.6ミリリットルの放出バッファーを移して、1.5ミリリットルの反応チューブを完全に満たします。次に、ワイヤーの機能部分を37°Cのリリースバッファーに含み、ウォーターバスで20分間インキュベートします。インキュベーション後、ワイヤーを毎分500回転で15分間シェーカーに置きます。次に、ワイヤーを300gで10分間遠心分離します。遠心分離が終了したら、チューブからワイヤーをずらし、キャップを閉じて、チューブを再度300gで10分間遠心分離します。細胞懸濁液の量を減らすには、マイクロマニピュレーション用に100マイクロリットルの上清を除くすべての上清を廃棄するか、その後の細胞遠心分離およびレーザーマイクロダイセクション用に300マイクロリットルを廃棄します。その後、すぐにシングルセルサンプリングに進みます。マイクロマニピュレーションでは、100マイクロリットルの細胞懸濁液全体をスライドガラスに移します。次に、スライドガラスをマイクロマニピュレーターを備えた顕微鏡に置き、細胞を5分間沈殿させます。次に、0.2ミリリットルのPCRチューブで、2マイクロリットルの細胞溶解マスターミックスをピペットでピペットで移動させ、氷上に移します。マイクロマニピュレーターを使用して、1マイクロリットルの1Xリン酸緩衝生理食塩水に1つの細胞を採取します。次に、細胞を2マイクロリットルの細胞溶解マスターミックスに直接移します。デスクトップマイクロフュージを使用して、サンプルを2, 000 gで3秒間すばやくスピンダウンし、チューブの底に液体を収集します。その後、サンプルを氷上に移し、アダプターリンカーベースの全ゲノム増幅に進みます。最大で1マイクロリットルのバッファーを使用して、1つの細胞のみを吸引します。細胞を溶解液に移すときは、溶液から気泡が発生し、すべての吸引量が移されたことを確認してください。レーザーマイクロダイセクションの場合、300マイクロリットルの細胞懸濁液全体を300gのメンブレンコーティングスライドに5分間細胞遠心分離します。次に、メンブレンコーティングされたスライドをレーザー顕微鏡で解剖できる顕微鏡に置きます。次に、4.5マイクロリットルの細胞溶解マスターミックスを0.2ミリリットルPCRチューブのキャップにピペットで挿入します。サンプルの上にキャップを置き、レーザーマイクロダイセクションによって単一細胞を回収します。その後すぐに、PCRキャップに単離された細胞がないか確認し、レーザーマイクロダイセクション顕微鏡からPCRチューブを取り外し、チューブを閉じます。チューブの底にすべての液体を短いスピンで集めます。サンプルを氷上で移し、アダプターリンカーベースの全ゲノム増幅に進みます。レーザーマイクロダイセンテッドセルを必ず回復させてください。そのため、チューブキャップ全体を溶解液で覆うことが重要です。マイクロダイセクション後、チューブキャップに細胞が存在するかどうかを確認します。CFSEおよびHoechst 33342で染色された細胞を示すために、ワイヤーを充電する前、細胞をワイヤーに付着させている間、次にワイヤーから分離し、最後にスライド上で免疫蛍光イメージングを行いました。チャージ前の細胞の免疫蛍光画像は、青色で明るい核染色を示していますが、細胞の細胞質は、不均一な細胞間強度で緑色のCFSE染色を示しています。同様の染色パターンは、ワイヤーに付着し、その後ワイヤーから剥離した細胞にも観察されます。全ゲノム増幅産物の品質を確認するために、1%アガロースゲルを泳動しました。アガロースゲルは、全ゲノム増幅のPCR産物について、0.2から1キロベースを超える範囲のDNA塗抹標本を示します。シングルセルから得られた4plex品質管理PCR産物は、100、200、300、および400塩基対の産物をもたらします。バンドが 3 つ未満の製品は、以降の分析から除外されます。この手法を習得すると、適切に実行すれば、細胞懸濁液から単一細胞を4時間で単離することができます。この手順を試みるときは、特に細胞がワイヤーに取り付けられている間は、細胞を傷つけないように、細胞をバッファーに沈めておくことを忘れないでください。この手順に続いて、コピー数の変動と突然変異に基づいて単一細胞を特徴付けるために、領域比較ゲノムハイブリダイゼーション、次世代シーケンシング、標的特異的PCRなどの解析方法を実行できます。このビデオを見れば、官能基化ワイヤーを使用して細胞懸濁液から細胞を単離および回収する方法や、複数のダウンストリーム分子遺伝学的解析のために単一細胞をサンプリングする方法について十分に理解できるはずです。人間の血液を扱う作業は感染の可能性があるため、この手順を実行する際には手袋と白衣の着用が義務付けられていることを忘れないでください。

target-cell-pre-enrichment-whole-genome-amplification-for-single-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

この記事では、ラット初代ニューロン培養とaRNAの増幅を使用して、その後のトランスクリプトーム解析から単一細胞の収穫のための簡単​​な方法を説明します。このアプローチは、任意の細胞型への一般化です。...

単一細胞のトランスクリプトーム解析

このビデオでは、ターゲット細胞のプールから単一細胞を分離してダウンストリーム分析を行う手法について説明しています。この方法では、顕微鏡に取り付けたマイクロマニピュレーターを使用して、単一の標的細胞を高精度に分離します。...

マイクロマニピュレーションを用いたシングルセルサンプリング:がん細胞懸濁液からシングルセルを単離する技術

このビデオでは、レーザーキャプチャマイクロダイセクションを使用して、不均一な細胞集団から単一の細胞を取得する技術について説明しています。単離された単一の細胞は、さらなるゲノム研究や癌研究に使用できます。...

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用したシングルセルサンプリング:不均一な細胞集団から標的細胞を回収する技術

このプロトコルは、クローンレベルでの遺伝子の大規模な配列の発現を評価する方法について説明します。単一細胞RT-qPCRをサンプルと数百の遺伝子のための強力な感度を有する信頼性の高い結果が得られます。...

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

単一細胞配列決定は、高解像度でゲノムの変化に対処するため、ますます人気とアクセス可能なツールです。我々は、単一の細胞内のコピー数の変化を識別するために、単一細胞の配列決定を使用するプロトコルを提供します。...

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

機能的および表現型分析のために、抗原反応性B細胞を検出し、豊かに磁性ナノ粒子を使用するシンプルで効果的な方法が記載されています。...

表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically...

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

ここでは、効率的に細胞蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えをショウジョウバエ視覚系内低豊富で存在を隔離するための細胞解離プロトコルを提案する.

ショウジョウバエ視覚系における低豊富な細胞の浄化

ここでは、循環腫瘍細胞 (CTCs) を特徴付ける表現型および分子的特徴を同定するための統合ワークフローを紹介する。単一およびクラスタ化された CTCs...

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

本プロトコルは、再利用可能な単一細胞を用いた反復エピゲノム解析のための単一細胞法を記載する。再利用可能なシングルセルにより、同じシングルセル内の複数のエピジェネティックマークの分析と結果の統計的検証が可能になります。...

反復エピゲノム解析のための再利用可能な単一細胞

マイクロ流体ベースのハイスループット循環腫瘍細胞選別およびシングルセルシーケンシング技術

学ぶ単一細胞分離法による希少標的細胞の前濃縮と全ゲノム増幅技術。抗体ベースのワイヤー分離とマイクロマニピュレーションを用いて、循環腫瘍細胞の分子遺伝学的解析を可能にする革新的な液体バイオプシー手法です。

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

さらに動画を探す