プールされた shRNA MeCP2 再アクティブ化非アクティブ X 染色体上の画面

この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、マウス腱線維芽細胞の調製から開始します。最初に培地を吸引することにより、10センチメートルのプレートから細胞を回収します。次に、0.05%トリプシンEDTAを1ミリリットル加え、摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。

インキュベーション後、9ミリリットルのDMEM-10でトリプシンをクエンチし、再懸濁した細胞を15ミリリットルの円錐管に集めます。DMEM-10で細胞を希釈し、100マイクロリットルあたり1細胞の最終濃度にします。次に、懸濁液100マイクロリットルを各ウェルにピペッティングすることにより、細胞を96ウェルプレートに移します。

ウェルがコンフルエントになるまで、細胞を摂氏37度でインキュベートします(これには最大2〜3週間かかる場合があります)。メディアを新しいDMEM-10と3〜5日ごとに交換します。コンフルエントになったら、ウェルあたり20マイクロリットルの0.05%トリプシンEDTAで細胞を動員し、それらを96ウェルプレートの2つの重複セットに分割します。

1セットのプレートにおけるルシフェラーゼ活性のアッセイ。ルシフェラーゼアッセイキットに含まれているプロトコルに従って、培地の除去を必要としない均質なホタルルシフェラーゼアッセイを使用してください。アッセイ結果を使用して、残りのプレートセットから検出可能なルシフェラーゼ活性のないクローンを選択します。

これらのクローンを最初に24ウェルプレートに拡大し、次に6ウェルプレートに拡大します。ルシフェラーゼ活性が最も高いクローンに対しても同じことを行います。これは、検証の目的でポジティブコントロールとして使用されます。

6ウェルプレートで増殖させた後、ウェスタンブロットのために各ウェルのアリコートを回収します。200マイクロリットルの0.05%トリプシンEDTAで細胞を動員します。細胞を摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。

2ミリリットルのDMEM-10で細胞をクエンチし、細胞の半分を別の6ウェルプレートに移します。細胞がプレートの底に付着するまで待ちます。次に、ウェスタンブロットの溶解前に細胞をPBSで一度洗浄します。

6ウェルプレートにウェルあたり20万個の細胞でいくつかのネガティブクローンを播種します。細胞を10マイクロモルの5-アザシチジンで一度処理します。その後、培地を変更せずに72時間インキュベートしてから、以前と同様にルシフェラーゼ活性をアッセイします。

次に、5-アザシチジンでルシフェラーゼ活性を獲得したネガティブクローンを1つ選んでスクリーニングし、それを複数の10cmプレートに拡大し始めます。残りのネガティブクローンをバックアップとして液体窒素で凍結します。ポジティブクローンは、組織培養中に保持することも、さらに使用するまで凍結することもできます。

朝、100万個の不活性X細胞を10cmの組織培養プレートにプレートします。午後には、培地を、所定量のウイルス上清と1ミリリットルあたり5〜10マイクログラムのポリブレンを含む新鮮なDMEM-10に交換してプレートに感染させます。18〜24時間後、メディアを吸引し、各プレートに10ミリリットルの新鮮なDMEM-10を追加します。

培養プレートをさらに48時間。午前中は、プレートあたり1ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAを使用して細胞を動員し、プレートあたり9ミリリットルのDMEM-10で細胞をクエンチします。サスペンションを100ミクロンのメッシュフィルターに通します。

ろ過した懸濁液を一緒に引っ張り、プレートあたり100万個の細胞で2セットの10センチメートルプレートを播種します。午後には、1セットのプレートのメディアを1ミリリットルあたり15マイクログラムのハイグロマイシンを含むDMEM-10と交換 B.In、もう1セットはメディアを新しいDMEM-10のみと交換します。48時間後、0.05%トリプシンEDTAの1ミリリットルを使用して、Hygromycin B未処理プレートから細胞を動員します。.

摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。次に、9ミリリットルのDMEM-10で細胞を急冷します。個々のサンプルを採取し、すぐにDNAの抽出に進みます。

ハイグロマイシンB選択セットをさらに6日間培養し続け、選択培地にハイグロマイシンBを含む新鮮なDMEM-10を隔日で補充します。6日目に、選択メディアを新しいDMEM-10のみと交換します。回復に4日間待ち、その後、選択後のサンプルDNAを以前と同様に回収します。

選択後のサンプルで濃縮されたヘアピンの同定に進みます(テキストプロトコルに記載されているように)。ヒットを検証するには、まず、10 cm プレート上のプレートあたり 800 万個の 293 FT セルをシードします。翌日、切断の30分前に、プレートあたり9ミリリットルの抗生物質を含まないDMEM-10と培地を交換します。

次に、トランスフェクションミックス2の各アリコートに0.5ミリリットルのトランスフェクションミックス1を加え、ピペッティングで穏やかに混合します。次に、混合物を室温で20分間インキュベートします。混合物を各プレートに滴下するように塗布し、プレートを静かに回転させて混ぜます。

翌日、最初のトランスフェクションから10.48時間後に培地を5ミリリットルの新鮮なDMEM-と交換し、レンチウイルス上清を回収し、DMEM-10で予め湿らせた0.22ミクロンのフィルターに通して回収を最大化します。翌朝、ウェルあたり10万個の不活性X細胞を6つのウェルプレートにプレートします。午後には、培地をレンチウイルス上清を含む2ミリリットルの新鮮なDMEM-10とポリブレン1ミリリットルあたり5〜10マイクログラムで置き換えてプレートに感染させます。

空のレンチウイルスベクターから生成されたウイルス上清をコントロールウェルに感染させます。翌日、メディアをピューロマイシン1ミリリットルあたり1ミリグラムを含むDMEM-10の2ミリリットルと交換します。選択は4日間使用します。

4日後、メディアを2ミリリットルの新鮮なDMEM-10と交換し、回復するまで48〜72時間待ちます。150マイクロリットルの0.05%トリプシンEDTAで細胞を動員した後、摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。1.5ミリリットルのDMEM-10で細胞をクエンチングした後、コニカルチューブに移し、室温でGの500倍で10分間遠心分離します。

培地を取り出し、ルシフェラーゼアッセイキットに付属の100マイクロリットルの溶解緩衝液に細胞を再懸濁します。懸濁液を室温で5分間インキュベートします。5分後、懸濁液を白い96ウェルプレートに移します。

暗室で、キットに含まれているプロトコルに従ってアッセイを実施します。活性X細胞をポジティブコントロールとして使用し、空のレンチウイルスベクターに感染した陰性X細胞をネガティブコントロールとして使用します。不死化マウス腱線維芽細胞クローンは、活性X染色体または不活性X染色体上のレポーターの配置とそれぞれ一致する、正または陰性のホタルルシフェラーゼ活性を示します。

MeCP2発現は、ウェスタンブロットによって決定され、逆パターンを示します。ホタルルシフェラーゼ活性は、5-アザシチジンの投与によりネガティブクローンで誘導できることに注意してください。活性X染色体上に存在する場合、ハイグロマイシン耐性遺伝子は、不活性X染色体上に遺伝子を持つ細胞と比較した場合、ハイグロマイシン選択の下で生存上の優位性をもたらします。

このビデオを見れば、不活性なX染色体に選択的に挿入されたレポーターを使用して、X染色体不活性化の調節因子のスクリーニングを設計し、実施する方法を十分に理解できるはずです。私の研究室では、以前に酵母のクロマチン調節因子のベーススクリーニングを実施しており、このアプローチの成功により、哺乳類細胞のX染色体不活性化の制御因子のためのこのスクリーニングを設計することになりました。この手順に続いて、哺乳動物細胞におけるX染色体の不活性化に関する追加の質問に答えるために、小さな干渉RNA、CRISPR、小分子を使用するなどの他の方法を実行することができます。