Name: 血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶマウス血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング法。自由浮遊脳切片と免疫蛍光染色を用いて、脳血管内皮細胞内の細胞小器官を三次元再構成し、神経血管単位の構造と機能を定量的に解析する技術です。

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R. v. の仕事は、ロシュ社員 (2014-2017) によって支えられました。

<ol><li>Blanchette, M., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+the+BBB%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of the BBB.</a> Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).</li>
<li>Chow, B. W., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Constituents+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier.</a> Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).</li>
<li>Niewoehner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Brain+Penetration+and+Potency+of+a+Therapeutic+Antibody+Using+a+Monovalent+Molecular+Shuttle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle.</a> Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).</li>
<li>Yu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+bispecific+antibodies+cross+the+blood-brain+barrier+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates.</a> Sci Transl Med. 6 (261), 154(2014).</li>
<li>Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+of+macromolecules+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier.</a> Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+rather+unexplored+terrain-transcellular+transport+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier.</a> Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).</li>
<li>Bien-Ly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+receptor+%28TfR%29+trafficking+determines+brain+uptake+of+TfR+antibody+affinity+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants.</a> J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).</li>
<li>Sade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+blood-brain+barrier+transcytosis+assay+reveals+antibody+transcytosis+influenced+by+pH-dependent+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding.</a> PLoS One. 9 (4), 96340(2014).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP-1-mediated+intracellular+antibody+delivery+to+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System.</a> Sci Rep. 5, 11990(2015).</li>
<li>Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+binding%2C+uptake%2C+and+transport+of+ICAM-1-targeted+nanocarriers+across+endothelial+and+subendothelial+cell+components+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier.</a> Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).</li>
<li>Siupka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+apical-basal+traffic+of+the+cation-independent+mannose-6-phosphate+receptor+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
<li>Zlokovic, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+saturable+mechanism+for+transport+of+immunoglobulin+G+across+the+blood-brain+barrier+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig.</a> Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).</li>
<li>Deane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG-assisted+age-dependent+clearance+of+Alzheimer%27s+amyloid+beta+peptide+by+the+blood-brain+barrier+neonatal+Fc+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor.</a> J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).</li>
<li>Cabezon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+applied+to+study+the+trafficking+of+8D3-coated+gold+nanoparticles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier.</a> Histochem Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Collin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+uptake+of+tau%2FpS422+antibody+and+reduced+progression+of+tau+pathology+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+Endogenous+Immunoglobulins+by+Endothelial+Cells+at+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier.</a> Sci Rep. 6, 25658(2016).</li>
<li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+permeability+of+the+blood-brain+barrier+upon+pericyte+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li>
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<li>Foret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+theoretical+framework+to+infer+endosomal+network+dynamics+from+quantitative+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis.</a> Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).</li>
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<li>Bell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li>
<li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).</li>
<li>Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+vesicles+in+the+blood-brain+barrier%3A+are+they+related+to+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability.</a> Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).</li>
<li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing+-+multi-scale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).</li>
</ol>

著者は、ロシュ社によって支払済の雇用の下で。

上記で説明したプロトコルでは、BBB の高分解能顕微鏡の脳浮遊セクション、免疫蛍光染色、画像取得、解析パラメーターの準備について説明します。このメソッドは、最近抗体配信プラットフォーム3BBB の17日間で内因性の IgG の輸送、周皮細胞損失18時に BBB の不均一性のローカリゼーションを調査するために使用されています。プロトコルのさまざまなステップは、実験の特定の目標に合わせて変更できます。まず、厚い (100 μ m) セクションの使用は免疫染色、取り付けの手順の中で自分の取り扱いを容易します。キャピラリーおよび NVU 断面の世代、毛細血管、神経血管系ユニットの三次元再構成のためができます。ティッシュ セクション内にある抗体の普及率が異なる場合があり、いくつかの抗体の汚損、coverslip の近くに組織の浅層に制限することができます。プロトコルは透過のステップの間に洗剤の濃度や抗体、組織浸透を改善するために透過ステップの長さを増やすことによって変更できます。第二に、光散乱と屈折の不一致から収差のため組織 (表面の下の通常 20 に 30 μ m) の内でより深い画像を取得する際に画質が可能性します。この問題を克服するために、組織のイメージより大きいボリュームにこのプロトコルで新しい手法をクリア組織とアクティブな抗体浸透20を結合できます。第三に、デコンボリューション、イメージの軸の解像度を改善するために画像取得後実行されます。このプロトコルで使われるブラインド等化アルゴリズムの選択は、点広がり関数の事前計算する必要はありません、(i) その使いやすさに基づいていた (ii) イメージ品質21、および (iii) mIgG 展示品の不足を改善するため堅牢性実装後細胞内構造を。サンプルで可視化された細胞内構造、によって他のデコンボリューション アルゴリズムは高画質であります。以下参照21,22は、利点と追加画像デコンボリューション アルゴリズムの制限に関する広範な議論を提供します。最後に、画像解析ソフトウェア パッケージの使用は、3 つの次元で毛細血管と細胞内構造の分割を許可しました。明らかに画像解析はプロトコル、たとえば参照23で説明されている代替のパッケージに記載されているソフトウェアに制限されない、セグメント イメージに使用することができます。BBB で細胞内構造の分析のための別のソフトウェア プログラムの適合性は、画像の領域分割の精度を評価することによって経験的に確かめられる必要があります。
このメソッドは、固定サンプルに基づいている、BBB 全体ないトランスサイトーシスのダイナミクスについて直接的な情報をすることはそれ。ただし、ことができますと組み合わせることは経時実験24、たとえば静脈内投与の速度論を再構築した後異なる時点で Bec 内蓄積を測定興味の分子を注入して細胞内の輸送。このアプローチの利点は、18、現在生体のライブ イメージング技術にアクセスされるに示すように、脳深部領域の分析のためことができますです。プロトコル間の重要なステップはティッシュの固定を注意深く監視します。固定 4 %pfa が免疫原性細胞内オルガネラと内因性または末梢投与の免疫グロブリン17 (図 1 b) を大幅に削減します。このプロトコルの制限は、蛍光抗体法に適した高品質抗体 (すなわち、低い非特異染色、低交差) するという条件です。このような試薬が利用、興味のすべての蛋白質の細胞内局在を調べるメソッドを適用できます。たとえば、プロトコルは、脳血管内皮細胞17リソソームを識別するために使用されました。このプロトコルは、共焦点顕微鏡に基づいているので、横方向の解像度は回折による制限は、約 175 に 250 より小さい構造を解決することはできませんする必要があります注意も nm (図 2)。
以前の研究では、共焦点顕微鏡25,26を使用して単位の細胞構成の詳細な分析を実行しています。ただし、透過電子顕微鏡19,27,28の使用にほとんど依存 BBB の細胞内輸送を調査します。このメソッドでは、細胞内構造の最高の水平解像度を提供しています、電子顕微鏡低スループットと挑戦的な手法のままです。また、EM によって視覚化することができますを別の分子標的の数は非常に限られました。このプロトコルでは、BBB で細胞内の輸送を調査するアクセス可能な代替手段を提供しています。5 ~ 6 日で脳画像解析するコレクションからの完全な手順を実行できます。適切な抗体が利用可能な場合、蛍光は同じサンプル内で複数の細胞のタイプ/分子の同時検出を可能します。またこのプロトコルは29空間分解能の限界を克服する超解像顕微鏡技術を組み合わせることができます。全体的に、上記で説明したプロトコルは単位内の興味の蛋白質の細胞内局在変化の定量化を可能です。異なる遺伝的または薬理学的摂動の応用機能生体内でBBB の細胞内の構造とトランスポート機能を調査できるようになります。

血液脳関門 (BBB) は連続の細胞バリア アストロ サイト, ペリサイト, ニューロン, と内皮細胞によって形成される1血液循環から中枢神経系 (CNS) を分離します。BBB 輸送の規制は、脳のホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしているし、脳血管内皮細胞 (Bec) の特殊な性質により媒介されます。Bec と基底率が低いトランスサイトーシスとタイトな上皮の存在は、血液媒介分子、2それぞれの傍細胞と transcellular の輸送を制限します。最近では、脳の3,4への治療上の大きな分子の配信を強化する Bec のトランスサイトーシス経路が利用されています。ただし、BBB にトランスサイトーシスのメカニズムまだされていない完全に特徴づけられる5,6。
広範な作業は行われている体外Bec7,8,9,10,間での細胞内輸送を調節する細胞および分子メカニズムを解読する11が、複雑なアーキテクチャと単位 (NVU) の生理機能を要約するこのようなシステムが失敗します。その一方で、研究生体内で12,13 BBB で輸送料金の詳細な定量的情報を提供が輸送の細胞内メカニズムに洞察力を提供しています。したがって、NVU の細胞および細胞内のコンポーネントを調査生体内でおよび前のヴィヴォ非常に挑戦的な14のまま。技術の限られた数だけは、NVU の細胞内細胞レベル下の構造の分析に適しています。ほとんどの研究は、電子顕微鏡を使用してが、この手法が適切なティッシュの準備と検体の取扱いに必要な複雑なプロトコルによって制限されます。したがって、脳のサンプルの処理、分析、および、NVU の細胞内細胞内コンパートメントの定量化を促進する高分解能共焦点顕微鏡に基づく方法を設けています。
ここでは、BBB と NVU は細胞および細胞内レベルでの定量的イメージングを実行するマウス脳浮遊セクションを利用するプロトコルについて述べる。我々 はテストし、イメージを作成し、3 つの次元で NVU を再構築する抗体の数を検証します。さらに、このプロトコルでは、脳の毛細血管内の細胞小器官の最大光の回折限界の解像度で画像ができます。一緒に画像解析マウス神経変性疾患モデルでたとえば、異なる実験条件下で BBB に高分子の細胞内輸送を調査するこのプロトコルを使用することができます。

<table><tbody><tr><td>CD31/PECAM</td><td>Novus Biologicals MCA2388</td><td></td><td>Labels Brain Endothelial Cells 希釈 1:100 希釈 1:400</td></tr> ラット モノ<tr><td>クローナル抗体 Podocalyxin</td><td>R&Dシステム</td><td>MAB1556</td><td>ラベル 毛細血管のルーメン 希釈1:100 で使用し、ロバポリクローナル抗ラットIgG(H+L)と適切なAlexaFluor染料を組み合わせて検出し、希釈1:400で使用</td></tr><tr><td>コラーゲンIVに対するウサギポリクローナル抗体</td><td>バイオトレンド</td><td>BT21-5014-70</td><td>ラベル 毛細血管の基底膜 希釈1:100 で使用し、ロバポリクローナル抗ウサギIgG(H+L)と適切なAlexaFluor染料と組み合わせて検出し、 CD13 R& に対する 1:400</td></tr><tr><td>ヤギポリクローナル抗体</td>を希釈して使用<td>D Systems</td><td>AF2335</td><td>ラベル pericytes 希釈 1:100 ロバ ポリクローナル抗ヤギ IgG (H+L) と適切な AlexaFluor 染料で検出し、希釈 1:400</td></tr><tr><td>マウス モノクローナル抗体クローン G-A-5 GFAPに対して</td><td>Cy3 Abcam</td><td>ab49874</td><td>ラベル アストロサイト 希釈で使用 1:100</td></tr><tr><td>Iba-1 に対するウサギ ポリクローナル抗体</td><td>和光</td><td>019-19741</td><td>ラベル ミクログリア 希釈度1:100 で使用し、ロバポリクローナル抗ラットIgG(H+L)と適切なAlexaFluor色素を組み合わせて検出し、希釈1:400で使用</td></tr><tr><td>ラットモノクローナル抗体 ABL93ゲインストLAMP2</td><td>フィッツジェラルド</td><td>10R-CD107BBMSP</td><td>ラベル リソソーム 希釈1:100 で使用し、ロバポリクローナル抗ラットIgG(H + L)と適切なAlexaFluor染料と組み合わせて検出します。 希釈で使用 1:400</td></tr><tr><td>マウスIgG(H + L)に対するロバポリクローナル抗体 AlexaFluor594</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21203</td><td>希釈1:400で使用</td></tr><tr><td>マウスIgG(H + L)に対するロバポリクローナル抗体 AlexaFluor488</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21202</td><td>希釈1:400で使用</td></tr><tr><td>マウスIgG(H + L)に対するヤギポリクローナル抗体 AlexaFluor555</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21422</td><td>希釈1:400で使用</td></tr><tr><td>濾紙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10334347</td><td>Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Roth Carl</td><td>258.1</td><td>Roti Coll 1</td></tr><tr><td>蛍光封止剤</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Dako fluorescent Mounting medium</td></tr><tr><td>成体マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>000664</td><td>C57BL/6J 生後9ヶ月から19ヶ月までのマウス </td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>14047235612</td><td>ライカ VT100S 振動ブレード ミクロトーム</td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>ズ NA</td><td>ライカTCS SP8 X HyD検出器 および白色光レーザー搭載</td></tr><tr><td>画像処理ソフトウェア</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>ズ NA</td><td>ライカアプリケーションスイート AF バージョン3.1.0ビルド8587</td></tr><tr><td>画像分析ソフトウェア</td><td>、ビットプレーン科学ソフトウェア</td><td>NA</td>、<td>イマリスバージョン7.6.5ビルド31770、x64</td></tr><tr><td>蛍光スペクトルビューア</td><td>、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NA</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science / cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr></tbody></table>

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

血液脳関門 (BBB) は、循環と脳の分子の輸送を調節する動的な多細胞インターフェイスです。BBB のトランスサイトーシスは、ホルモン、代謝、および治療用抗体の脳実質への配信を調整します。ここでは、レーザ走査共焦点顕微鏡と BBB で内皮細胞内の細胞小器官を可視化する画像解析による浮遊セクションの蛍光抗体法を組み合わせたプロトコルを提案する.半自動抽出法と細孔容積の定量化と表面積、数、BBB で細胞内オルガネラの強度の 3 D 画像解析ソフトウェアでデータのセットを組み合わせることが可能します。細胞内小胞とその定量化、bbb 内マウス内在性免疫グロブリン (IgG) の検出は、メソッドを説明するために使用されます。このプロトコルは、異なる分子の生体内の BBB トランスサイトーシスを制御するメカニズムの調査に潜在的適用できます。

画像の代表的な例は、ここで説明されているプロトコルから取得、マウスの脳のセクションが基底膜、アストロ サイト、ペリサイト、NVU のさまざまなコンポーネントを認識する抗体で染色した、内皮細胞 (参照してください。使用される特定の抗体の材料表) (図 1 a D、およびE)。この解像度でアストロ サイトの個々 のプロセスと最後の足は毛細血管との直接接触は、区別することが可能です。
このプロトコル細胞内構造を検出するための適合性を強調するには、脳末梢人間の反タウ mAb86 抗体16注入される動物から染色蛍光標識抗ひと抗体 (図 1B)。mAb86 は、タウ16の病理学的形を表現する具体的ターゲット ニューロンに知られています。本記述されているプロトコルを使用して、mAb86 は、回折限界解像度ニューロン (図 1B C) 内の個々 の小胞構造内で検出されました。さらに、内因性マウス IgG はペリサイト (D E 図 1および図 2) ではなく細胞内構造を血管内皮細胞内で検出されました。
脳血管系の高分解能共焦点 z スタックによる毛細血管の BBB で細胞内小胞三次元のセグメンテーションが可能です。図 2では、細胞内のレンダリングと付けられて CollagenIV とマウス IgG 陽性キャピラリーをセグメント化のプロセスの例が示しています小胞。細孔容積あたりの小胞の数の測定によって例えば分割された画像の完全なデータセットを定量化することでさまざまな条件下での細胞内輸送プロセスの変化を研究することが可能です。図 3B C pdgf bret retマウス モデルで以前に報告されたとしての周皮細胞枯渇時にそれぞれ、脳実質の mIgG に対応する mIgG 小胞数と蛍光強度の違いを示しています。17です。 同じアプローチは異なる脳領域18間 bbb 細胞内輸送の変化を分析するも最近使用されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
図 1:複数の細胞のタイプと、血管の細胞レベル下の構造の表示ユニット単位 (AとD) とニューロン (B) に含まれている細胞内の小胞またはこのプロトコルで得られた内皮細胞 (E) の代表的なイメージ。A (上) で最大強度投影画像は、周囲の毛細血管 (緑) CollagenIV ラベル GFAP 陽性アストロ サイト (赤) の分布を示します。矢印は、アストロ サイトの個々 のプロセスをポイントします。スケール バー = 20 μ m。この解像度では、個々 のアストロ サイト プロセスと終わり足箱入り地域 (下) の拡大図のように、はっきりと見える。矢印は、アストロ サイトのエンド フィートをポイントします。スケール バー = 10 μ m。Bのイメージは、末梢注入抗体、海馬ニューロン内 (緑)、mAb86 の蓄積を示しています。矢印は、個々 の mAb86 肯定的な小胞をポイントします。スケール バー = 10 μ m。Cのグラフは単一の小胞の線プロファイル強度を示しています。小胞のサイズは強度曲線 (緑のラインとサークル) のガウス適合 (黒実線) の半値全幅から推定しました。Dの画像は、基底膜 (CollagenIV、グレー) 内 (赤) (緑)、周皮細胞に囲まれた内皮細胞の三次元再構成を示しています。下のパネルは、個々 の蛍光チャネルを表示します。スケール バー = 10 μ m。Eの画像ではなくペリサイト (正しいパネルで、グリーンの CD13) が、mIgG (赤) 細胞内小胞 (左右パネル、緑色で CD31) 血管内皮細胞内の局在化を示しています。すべてのイメージの核を染色 DAPI は青で示されます。スケール バー = 5 μ m パネル D と E を参照17から変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
図 2: 毛細血管の血液脳関門で細胞内小胞三次元レンダリングします。説明されたプロトコル、(緑) CollagenIV 肯定的な毛細血管のマウス IgG の細胞内小胞 (赤) が高分解能共焦点画像 (A) を取得しました。左側のパネルでは、断面を持つ単一光学セクションを示しています。矢印は、脳血管内皮細胞内の個々 の mIgG 肯定的な小胞をポイントします。フル z スタックを使用して右のショー 3 D 再構成に関するパネル画像処理ソフトウェア (材料の表を参照してください)。細孔容積 (B) および個々 の小胞 (C) 3 次元レンダリングされた、画像処理ソフトを用いて定量化 (材料の表を参照してください)。すべてのイメージの核を染色 DAPI は青で示されます。スケール バー = 5 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
図 3: MIgG BBB の細胞内局在性の定量化.代表的なイメージ (A) (collagenIV、緑で標識) 毛細血管の三次元再構成と mIgG の分布 (赤) c57bl/6 マウスとpdgf bret ret周皮細胞枯渇マウス19で記述されています。スケール バー = 10 μ m。Bの画像は、CollagenIV マスク内で細胞内小胞のセグメンテーションを示しています。Thb e グラフは、定量化と毛細血管の体積当たり mIgG 小胞数の比較を示しています。各ポイントは、個々 の毛細血管セグメントからの測定値を表します。実線は平均値と誤差範囲は、データの標準偏差を表します。Cショーの画像、 CollagenIV マスク外 mIgG 蛍光信号。同様に、 Cのグラフは、定量化と mIgG の蛍光強度の比較pdgf bret retと c57bl/6 マウスの脳実質周皮細胞枯渇マウスです。蛍光強度の単位は、すべて c57bl/6 マウスで測定した平均 mIgG 柔強度によって正規化されました。この図は、参照17から変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここで単位と血液脳関門脳浮遊セクションを使用して高解像度の画像とマウスの三次元再構成のための顕微鏡ベースのプロトコルを紹介します。このメソッドは、可視化、解析、および BBB で細胞内オルガネラの定量化のためことができます。

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

この方法の全体的な目標は、マウスの血液脳関門の高解像度イメージングと3次元再構成のための顕微鏡ベースのプロトコルを提供することです。これは、自由浮遊切片の免疫蛍光法と共焦点顕微鏡法を組み合わせて、脳内皮細胞内の細胞内小器官を分析します。この方法は、血液脳関門の高解像度顕微鏡検査のための脳の自由浮遊切片の準備、免疫蛍光染色、画像取得、および分析パラメータを学習します。この技術の主な利点は、神経血管ユニットの細胞内の細胞内小器官の定量化を可能にすることです。手順を実演するのはロベルト・ヴィラーセです

high-resolution-confocal-imaging-blood-brain-barrier-imaging-3d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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出典: Bagheri, M., et. al.アストロサイトの三次元共焦点形態計測解析のためのプロトコルJ. Vis.

共焦点顕微鏡を用いた免疫標識星状細胞の三次元イメージング

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神経疾患のモデル化と治療標的化のための血液脳関門の in vitro 再構築

学ぶマウス血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング法。自由浮遊脳切片と免疫蛍光染色を用いて、脳血管内皮細胞内の細胞小器官を三次元再構成し、神経血管単位の構造と機能を定量的に解析する技術です。

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

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