GLUT4 タンパク質デコンボリューション顕微鏡を用いたマウス一次視床下部ニューロンにおける人身売買のライブ映像

この実験の全体的な目標は、視床下部ニューロンのGLUT4などの初代ニューロン細胞におけるタンパク質輸送を最小限の損傷で観察することです。この方法は、2型糖尿病の場合など、インスリンシグナル伝達と代謝のニューロン制御に関連する重要な問題を説明できます。この技術の主な利点は、研究者が初代細胞培養物を分離し、薬物誘発性の影響をリアルタイムで観察できることです。

この技術の意味するところは、視床下部ニューロンのケモカインCCL5によってこのインスリン信号がどのように変化しているかがわかったため、2型糖尿病または脳関連のインスリン抵抗性の治療法を選択することです。この手順を開始するには、培養の1日前に培養皿にpoly-Dリジンをコーティングします。6ウェルディッシュの場合は、0.05 mg/mLのポリDリジン1.5 mLを各ウェルに加えます。

翌日、poly-Dリジンを除去し、2mLのddH2Oで皿を2回洗います。次に、10cmのシャーレに20mLの洗浄剤を入れ、氷の上に置きます。15 mLチューブに洗浄剤を入れ、氷の上に保ちます。

脳組織を分離するには、プラットフォーム、解剖顕微鏡、および手術器具を75%エタノールで滅菌して、汚染を防ぎます。その後、へその緒の周りを切って、子犬を傷つけずに隔離します。次に、各子犬の頭を取り外し、先端の細いまっすぐな鉗子を使用して所定の位置に固定します。

別の細い先端の湾曲した鉗子を使用して、両側から外側の皮膚と頭蓋骨を取り除き、前方から背側に向かって剥がします。次に、分離された脳を氷冷した洗浄媒体を入れた清潔なペトリ皿に入れます。脳を裏返し、腹側を上に保ちます。

続いて、先端の細い湾曲した鉗子で視床下部組織を分離します。鋭利な鉗子で嗅葉を押さえ、湾曲した鉗子で脳全体を囲む薄い髄膜を剥がします。皮質の下側に反転し、海馬を横に引っ張って皮質から海馬を分離します。

脳のすべての領域が分離されたら、これらの組織を氷冷洗浄培地を含む15mlチューブで切り刻みます。この手順では、組織を含むチューブを2〜3回反転させて組織をすすぎます。次に、組織が落ち着くようにチューブをまっすぐに保ちます。

真空システムに取り付けられたガラス製のパスツールピペットを使用して、上部培地を取り出します。組織を洗うには、15 mLの氷冷洗浄用メディウムを追加し、チューブを2〜3回反転させます。最終洗浄後、1mLピペットを使用して洗浄液を取り出します。

パパイン-トリプシン消化バッファーと組織を摂氏37度の水浴中で7〜14分間インキュベートします。その後、ウシ胎児血清を1巻加えて酵素活性を中和します。チューブをラックに置き、組織が落ち着くまで1〜2分待ちます。

その後、1mLピペットで上清を慎重に取り除きます。試験管に6mLのめっき培地を加え、5mLのピペットで組織を50回優しく上下にピペットします。チューブをラックに置き、分厚い未解離の組織が落ち着くまで1〜2分待ちます。

次に、解離した細胞を含む上相を新しいチューブに移し、プレーティング培地で希釈します。次に、2 mLの完全培地を6ウェル皿の各ウェルに加えます。細胞をライブイメージング用に準備するには、鉗子を使用してニューロンのカバースリップを慎重に取り外し、慎重にスライドガラス上に置きます。

次に、デリケートなタスクワイプで余分な媒体を2回折り、カバースリップを動かさずに慎重に置いて取り除きます。カバースリップの不要な動きを防ぐために、余分な量のメディウムを取り除くことが不可欠です。次に、選択した細胞サンプルをCCL5で10 ng/mL、またはインスリンを10 units/mLで1分間処理します。

その後、カバースリップの端に希釈したインスリン1.5mcLを追加します。.次に、倍率60倍、NA1.52の対物レンズに液浸油を添加します。その後、カバースリップを下に向けて適切に固定し、カバースリップをデコンボリューション顕微鏡ステージに置きます。

明視野照明または蛍光照明を使用して、標的細胞を同定します。その後、ターゲット細胞がはっきりと観察できるようになるまでピントを調整します。不必要な傷跡を避けるために、対物レンズをカバーの滑り部の外側に動かさないでください。

次に、GFPシグナルからGFP-GLUT4を同定します。次に、画像取得に必要なターゲット細胞を特定します。その後、各ターゲットセルに、ピクセル数、励起波長、透過率、露光時間、スタックの厚さ、時間間隔、合計イメージング時間など、適切な実験パラメータを設定します。

露出パラメータを約 2000 から 3000 カウントに調整して、ピクセル強度を最大にします。蛍光光の退色を最小限に抑えるには、露光時間を1秒未満に保ちながら、励起光の透過率をできるだけ下げてください。各ターゲットセルのZスタックの上限と下限を設定するには、ターゲットセルの上部と下部がわずかに焦点が合っていないまで顕微鏡ステージを動かします。

光画像に続くニューロン死における蛍光光の漂白を最小限に抑えることは非常に重要です。この図は、初代培養視床下部ニューロンがニューロンマーカーMAP2で標識されたことを示しています。視床下部ニューロンマーカーPOMCとそれらのCCR5の共発現。

共局在した画像は、CCL5がPOMC陽性の視床下部ニューロンで発現していることを示しています。これらの画像は、野生型視床下部ニューロンおよびCCR5ダブルネガティブ視床下部ニューロンにおけるGFP-GLUT4タンパク質の発現を示しています。ニューロンはインスリンまたはCCL5で刺激されました。

矢印はインスリンまたはCCL5刺激前後の神経炎におけるGFP-GLUT4点状を指し、アスタリスクはCCL5刺激前後の表面GLUT4-GFPを示しています。マスターすると、この初代細胞技術のラボ記録は、実験の要件と適切に行われるかどうかにもよりますが、1時間から4時間で行うことができます。この技術は、神経科学の分野の研究者が、初代細胞培養における即時の薬物誘発効果を特徴付ける可能性を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、視床下部の一次ニューロン、海馬ニューロン、皮質ニューロンを分離する方法を十分に理解できるはずです。ラボ以外にも、さまざまな刺激で連続分子のライブ録音を行う方法を知ることができます。白衣と手袋を着用し、動物からの細菌や真菌による汚染を避けるためにエタノールを頻繁に使用することを忘れないでください。

また、この手順全体を通してカバースリップやニューロンを扱う際には、細心の注意を払ってください。