マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリン シグナルを勉強

この実験の全体的な目標は、視床下部 C-C-L-5 シグナル伝達の役割を調査することです 末梢系のインスリン機能とグルコース代謝 C-C-L-5 シグナル伝達を操作することにより、アンタゴニスト Met-C-C-L-5 を投与します 脳間心室送達システム、微小浸透圧ポンプ。この薬は、脳内の体糖代謝とインスリン応答性の制御におけるケモカインC-C-L-5など、生化学生理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この措置の主な利点は、実験者が、げっ歯類で遺伝子操作を行うときに通常起こるような代償効果や障害の発症なしに、ここにあるC-C-L-5のような脳内の特定のシグナル伝達を一定期間簡単に操作できることです。

微小浸透圧ポンプの挿入と血中インスリンとグルコースレベルの正確な測定にはスキルと精度が必要なため、この手順を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。手術の1日前に、1ミリリットルの注射器と鈍い頭の針を使用して、ポンプに人工脳脊髄液、またはA-C-S-Fを充填することにより、脳微小浸透圧ポンプを準備します。次に、ポンプをACSFに浸し、シェーカーに置いて一晩穏やかに振とうします。

翌日、A-C-S-Fをポンプから取り外し、事前に調製した薬剤液をA-C-S-Fで希釈して、余分なものが漏れるまで完全に充填します。次に、手術用ハサミを使用して、カテーテルチューブを希望の長さに切断します。鈍い先端の脳注入針を使用して、チューブを脳注入キットに取り付けます。

次に、輸液キットのチューブに薬液を入れます。キットを組み立てたら、微小浸透圧ポンプに取り付けます。最後に、ポンプが乾燥するのを防ぐために、浸透圧ポンプの脳注入設定を滅菌された50ミリリットルのチューブ内にACSFに浸します。

手術を開始するには、麻酔をかけたマウスの頭部を定位装置に装着して固定します。手術用のハサミとペンチを使用して、頭蓋骨を覆っている外側の皮膚を切り開きます。次に、ヨウ素を使用して周囲の頭蓋骨を清掃します。

次に、首の領域の近くにある鈍い頭のハサミを使用して、浸透圧ポンプ脳融合セットの移植のために、皮膚の最外層を皮下皮膚から分離します。定位装置を使用して、脳マップを参照して注入ポイントをマークします。ネイルドリルを使用して、マウスの髄膜や血管を壊さないように注意しながら、頭蓋骨にマークされた領域の周りに穴を開けます。

次に、目的の薬物を含む微小浸透圧ポンプ脳融合セット、またはコントロールとしてのA-C-S-Fを、首の領域の後ろの皮膚の下に置きます。薬物を脳に注入するには、ドリルで開けた穴に脳注入針を挿入します。表面減感作ジェルを使用して針を頭蓋骨の所定の位置に固定し、接着剤が乾くまで待ちます。

針の上の突出部を切り取ります。耐糖能試験を開始する前に、3.75グラムのグルコースと15ミリリットルの蒸留水を溶解してグルコース溶液を調製します。各血液検査の間に適切な間隔を空けたタイムテーブルを設定して、実験中の測定値を記録します。

次に、絶食後の各マウスの体重を量り、注射に適したブドウ糖の量を計算します。次に、作業台で、タイマー、グルコースチップ、グルコメーター、インスリン注射器、かみそりの刃を準備します。血糖値を測定するには、まず新しいグルコースチップをグルコメーターに挿入し、スタートボタンを押してゼロを設定します。

次に、マウスの首の後ろをつまみ、尻尾を撫でて十分な血流を確保します。新しいカミソリの刃を使って尾の小片を切り取り、ブドウ糖チップに一滴の血液を絞り出します。胃内洗浄技術を使用して、マウスにグルコースを供給し、すぐにタイマーを開始します。

さまざまな時点でグルコースを測定します。インスリン負荷試験を開始するには、0.25単位のヒトインスリン溶液を準備します。次に、絶食後に各マウスの体重を量り、注射に適したインスリンの量を計算します。

次に、実験中の測定値を記録するためのタイムテーブルを設定します。最後に、インスリン注射後、以前に行ったように血糖値を測定します。グルコース代謝は、マウスにグルコースを経口投与した後、手術後の経口ブドウ糖負荷試験によって測定されました。

A-C-S-Fを注入したマウス、またはC-C-L-5アンタゴニストを注入したマウスの血糖値の変化を記録し、ここに示します。インスリン感受性試験も実施され、C-C-L-5拮抗薬を注入されたマウスの血糖値は対照マウスと比較してわずかに低下しただけであり、C-C-L-5で治療されたマウスの末梢グルコース代謝に対するインスリン機能の障害が示唆されました。インスリンシグナルの活性化を解析するために、視床下部でインスリン受容体基質タンパク質、またはI-R-S-1リン酸化を評価しました。

C-C-L-5アンタゴニストで治療したマウスでは、通常給餌した場合、I-R-S-1リン酸化は対照群と比較してアップレギュレーションされました。インスリンシグナルの活性化をさらに解析するために、インスリン下流のシグナル伝達分子であるリン酸化セリン4-7-3 Aktのレベルも評価しました。その後、インスリンチャレンジA-K-Tシグナルは、コントロールA-C-S-Fで治療したマウスでは増加したが、C-C-L-5拮抗薬で治療したマウスでは増加しなかった。

微小浸透圧ポンプの挿入をマスターすると、適切に行えば30分しかかかりません。この手順を試みるときは、マウスの頭がわずかに持ち上げられ、背骨が定位装置上でまっすぐになっていることを確認することが重要です。この手法は、研究者に内分泌学でげっ歯類の脳内の薬物、ケモカイン、またはタンパク質機能の影響を調査する方法を提供します。

この手順に続いて、ウイルスの脳内送達による遺伝子発現の操作、またはクリスパー9などの追加の手段を実行して、C-C-L-5および受容体C-C-L-5が食物の消化および代謝回路にどのように関与しているかなどの追加の質問に答えることができますか?