Name: マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリン シグナルを勉強 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶマイクロ浸透ポンプを用いたマウス脳内薬剤投与法と視床下部CCL5シグナル阻害による末梢インスリン感受性およびグルコース代謝への影響。この手法は代謝疾患治療の新たな標的探索に有用です。

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注: すべてのプロトコルおよび動物の科目で使用される方法によって承認されている機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 台北医科大学 (プロトコル番号: LAC-2014-0387)
1. マイクロ浸透圧ポンプ注入システムの準備
注: ポンプ、人工髄液 (アプライド) バッファー、および 0.2 μ m フィルターでフィルターのバッファーを用いた無菌条件下で薬物 (Met-CCL5/RANTES タンパク質溶液 (アプライドで 10 ng/mL)) を準備し、文化フードの下のすべての手順を行う手袋。手術の手順は、次のとおり実施します。
<ol>
	<li>マイクロ浸透圧ポンプ手術前日の準備: 1 mL 注射器と鈍頭針キットと一緒に提供される人工脳脊髄液 (アプライド) と脳微小浸透圧ポンプを入力します。アプライド マイクロ浸透圧ポンプを浸すとシェーカー上に配置し、一晩軽く振る。 注意: ポンプ、アプライドでいっぱいになる必要があります、内部ポンプ (図 1 a) 空気の泡を避ける必要があります。</li>
	<li>手術前に、組換え Met-CCL5/RANTES タンパク質溶液 (10 ng/mL、アプライドで希釈) 実験に使用されるを準備します。アプライドをポンプから外し、過剰が漏れるまでゆっくりと薬液をポンプを埋めます。 注: 15 mL アプライドまたはメトロポリタン-CCL5/RANTES ソリューション 5-8 ポンプ十分です。 注意: は、ポンプが完全に薬中での気泡なしでいっぱいすることを確認する手順を繰り返します。</li>
	<li>カテーテル チューブを必要な長さにカット、脳注入キットの鈍終り脳注入針を取り付けます。薬と注入キットやチューブを埋めます。</li>
	<li>最後に、組み立て、マイクロ浸透圧ポンプに脳注入キットを取り付けます。 注意: 泡が形成されるないチューブやポンプ (図 1 a)。</li>
	<li>ポンプが乾くを防ぐために滅菌の 50 mL チューブにアプライドで設定全体の浸透圧ポンプ脳融合を浸します。浸透圧ポンプ脳融合セットは、手術に使用する準備が整いました。 注: マイクロ浸透圧ポンプ システムは、長期的な薬物注入に使用できます。これにより薬剤投与マウスの脳内への安全で便利なモードです。</li>
</ol>
2. 脳内心室手術 – マイクロ浸透圧ポンプの注入
注意: 75% エタノール手術環境を消毒して研究に関わる人々 が滅菌手袋、きれいな白衣を着ているということを確認します。手術器具/楽器はオートクレーブと 75% のエタノールの間マウス手術その後滅菌使用前に乾燥する必要があります。
<ol>
	<li>マウスの重量を量るし、腹腔注入 (IP) を使用してケタミン ・ キシラジン麻酔 (ケタミン 50 mg/kg、キシラジン 10 mg/kg)。 注意: マウス体重 24 g よりも低い浸透圧ポンプ注入手術のため推奨されません。</li>
	<li>マウントし、定位装置 (図 1 b) の上にマウスの頭を修正します。</li>
	<li>頭蓋骨を覆っている外側の皮膚を切開するのに外科はさみとピンセットのペアを使用します。周辺の頭蓋骨をきれいにするのにヨウ素を使用します。</li>
	<li>浸透圧ポンプ脳融合セット注入 (図 1) の頸部近く鈍頭ペンチのペアの助けを借りて皮下皮膚から皮膚の最も外側の層を分離します。</li>
	<li>定位放射線装置を用いて脳地図 (図 1) についての注入ポイントをマークします。この実験では、針は 3rd心室領域に注入される必要がある (前: 腹側 5.7 mm、1.3 mm 後方に, 0.0 mm 横)。</li>
	<li>頭蓋骨 (図 1E) マーク周辺釘のドリルを使用して穴を開けます。 注意: マウス髄膜と脳の微小血管の中断を回避するため、血管を壊さないように気をつけてください。</li>
	<li>配置 (コントロール) としてアプライドや脳注入針 (マウスの脳内へ薬物を注入する穴に頸部に挿入の後ろの皮膚の下で薬物 (Met-CCL5/RANTES タンパク質溶液) を含むマイクロ浸透圧ポンプ脳融合セット図 1E)。針は髄膜に侵入し、心室に入る。頭蓋骨表面の脱感作のゲル (図 1 f) を使用して場所に針を修正し、接着剤が乾くまで 1-2 分を待ちます。次に、針 (図 1H) 上に突出部を切断します。</li>
	<li>組織接着剤を使用すると、操作が頭に傷を癒します。傷の上に接着剤の 50 μ L を適用、皮膚の両方の側面をまとめ、30 の押し続けます (図 1I) をシールするために皮膚を許可する s。 注意: は、手術や感染症を防ぐためにストレプトマイシンと 100 ul ペニシリン後傷をきれいにするのに 100% アルコール パッドを使用します。注: マウス皮膚に瘢痕組織を形成、手術用の接着剤の管理を次の数日で治癒します。接着剤の主な利点は、皮膚の炎症や炎症を引き起こす可能性のある手術での縫合の回避です。</li>
	<li>暖かいプレート上きれいなケージ内マウス保存場所 (37 ° C まで加熱)、マウスを麻酔の効果から回復するまで待ちます。 注意: 手術後生存のチャンスを高めるためにマウスの体温を維持するために重要です。</li>
	<li>1 週間の回復期間後マウスはインスリン耐性テスト (ITT) の経口グルコース耐性試験 (OGTT) など、更なる実験の準備になります。</li>
</ol>
3. 経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT)
メモ: は、アプライドのMetCCL5/RANTES (10 ng/mL、100 μ L) 注入後 7 日経口ブドウ糖負荷試験を行います。6 h OGTT の前に十分な水の供給とのマウスの高速を維持します。プロシージャの間にストレスを軽減する環境に順化することができるように、実験を実行する同じ作業台に、動物を飼います。
<ol>
	<li>ブドウ糖液調製法: 実験を行う前に準備グルコース溶液 3.75 g を溶解することによりグルコース 15 mL の蒸留水 H2o.</li>
	<li>(表 1) の実験の手順の中に測定値を記録するスケジュールを設定します。 注: 正確実験時の記録を許可する各血液検査の間に適切な間隔でタイム テーブルを設定することが重要です。</li>
	<li>断食後それぞれのマウスの重量を量るし、注入するブドウ糖の適切な量を計算します。</li></ol>たとえば、マウスの重さ 30 g、グルコース投与する溶液の量は 300 μ L をする必要があります。
	<li>作業台に次の楽器を準備します。<ol>
		<li>Glucometer (スタート ボタンを押してバッテリのステータスを確認してください、それがテストの前に機能しているかどうかを確認する)</li>
		<li>グルコース チップ</li>
		<li>インスリン注射器 (0.3 mL インスリン注射器)</li>
		<li>かみそりの刃</li>
		<li>タイマー</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ベンチの設定一度測定し、血糖値のレベルを次のように記録: きれいな入れ、新しい血糖値、glucometer にチップしそれをゼロにスタート ボタンを押します。</li>
	<li>首の後ろでマウスを拾うし、尾を数回ストローク尾地域に十分な血流を確保するため。</li>
	<li>尻尾の小さい部分を切断し、血の 1 つの小滴を絞り出す新しいかみそりの刃を使用して (約 10-20 μ L) グルコース チップに。血液は、正確に測定できるようにチップを記入ください。Glucometer すぐに血糖値のレベルが表示されます。マシンには「エラー」が表示されている場合は、新しいグルコース チップを手順を繰り返します。 注: グルコース チップには、血の一滴にすぎないが必要です。血液サンプルは複数回収集する必要があるとき、単に血を収集するためにチップの上に直接尾の端を押しながら数回ねずみのしっぽに沿ってあなたの指を実行することによって圧力を適用します。血液サンプルを収集するたびに末尾をカットする必要はありません。</li>
	<li>次に、マウスを供給グルコース (0.25 g/mL) 経口胃内強制経口投与法を用いた。管理されるブドウ糖の量は数式を使用して計算する必要があります: 10 X 重量 (BW) μ L グルコース溶液を体は、(たとえば、マウスの重さ 30 g、グルコース投与する溶液の量を 300 μ L となる) 場合。経口ブドウ糖を投与した直後にタイマーを開始します。</li>
	<li>15、30、60、90、120 分で血糖値の測定手順を繰り返します。</li>
	<li>すべてブドウ糖レベルの測定値が記録されると、かみそりの刃を破棄し、グルコース チップ バイオハザード容器に。食べ物をマウス ケージに戻すし、は動物の部屋に戻ります。</li>

4. インスリン負荷試験 (ITT)
注: 経口ブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験スケジュールしてください離れて、少なくとも 7 日間動物の断食の効果を減らすため。インスリン負荷試験 (ITT)、IP 注射を通してヒトインスリン (0.75 U/Kg) を投与します。
<ol>
	<li>0.25 U インスリン溶液の調製: 食塩の 1: 400 の比に 100U ヒトインスリンを希釈します。</li>
	<li>断食後それぞれのマウスの重量を量る、それに応じてインスリンの注射量を計算: する 0.25 U インスリンの量 (μ L) 注入 IP = 3 X BW (0.75 U インスリン/Kg 体重)。たとえば: 28.8 g 重さがあってマウスを挿入: 28.8 X 3 = 86.4 μ L (0.25 U 希釈インスリン) (表 2)。 注意: 同じ動物は別の日に断食 6 時間後別の体の重みがあります。したがって、右の前に、断食と OGTT と ITT 試験実施後に体重を測定する必要は。マウスの体重は、種、性別、および絶食の期間に応じて削除でした。インスリンの高用量インスリン ショックを引き起こす可能性があり、動物の死に 。</li>
	<li>実験手順中に測定値を記録する表 (表 2) を設定します。3.4 の手順を繰り返します。3.8。測定血糖値。</li>
</ol>

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</ol>

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慢性的な炎症と関連ケモカイン受容体-CCL5 などのメカニズム 2 型糖尿病の開発の CCR5 は不明のまま。慢性的な炎症により、脂肪組織へのマクロファージ浸潤とアディポカイン; の規制に影響を与える一方で、それはまた β 細胞を集めて、血糖値に応じてランゲルハンス島からのインスリン分泌を損ないます。脳の視床下部は食欲不振、末梢血ブドウ糖の新陳代謝およびインスリン反応の調節に全身の末梢組織からのインスリンおよびアデポカイン信号の調整のコントロール センターとしての重要な役割を果たしています。多くの研究はまた視床下部の炎症がエネルギー恒常性維持と同様に欠陥のある膵肝機能2,3,9,10欠陥規制につながることを示します。CCL5 脳内視床下部11,12; 食品摂取量と体の体温調節に貢献します。しかし、CCL5 の視床下部と全身のインスリン シグナルに相関関係は明確ではありません。CCL5 全身のノックアウト マウス (CCL5-/-) は、血8高いインスリン レベルと高血糖値とインスリン抵抗性の表現型を示していますこの問題に対処するため生成されています。しかし、2 型糖尿病の表現型を開発する長い時間を必要とする、役割と可能性のある長期的な代償的な影響による視床下部インシュリン信号 CCL5 のメカニズムを調査することは困難です。そのため、視床下部ニューロンの信号 CCL5 の直接操作が最適です。ただし、複数の種類の視床下部領域のニューロン、それはかなり高価なセル特定のノックアウト マウスを生成に時間がかかります。ICV を利用した輸液システム従って時間を節約でき可能な末梢炎症性反応をバイパスして直接脳内 CCL5 関数を操作するより具体的なアプローチを提供します。
浸透圧ポンプを利用した研究既に公開されている以前は、偉大な例および齧歯動物13の浸透圧ポンプの注入する方法のデモンストレーションを提供します。しかし、本研究ではこれらのプロトコルに従いながらいくつかの課題を直面しました。まず、プロトコルで使用される機器のいくつかは非常に高価、1) 描画、マウス脳、2) 3) の酸素-イソフルラン マウスの体の温度を維持するための熱システムに針を挿入する場所に到達する電気システムを含むマウスに麻酔を管理するためのシステムを提供します。第二に、他の記事で説明した方法のみが我々 の研究の特定の年齢、体重の小さな範囲内で動物を使用することができなために、レプリケートする困難であった。大きいマウスが手術と注入に適していることがあります。私たちの研究では、肥満とインスリンと血の血糖調節の加齢変化を避けるために小さく、若いマウスを使用していた: 2 ヶ月ごろが研究で選ばれたボディを持つ男性マウス重量 25 ± 2 g と年齢だけ。したがって、手術を行うし、マウスの頭の傷を縫合することは困難です。第三に、炎症の反応は炎症性サイトカインが本研究でターゲット行うので手術後最小化します。マウスやラットは、縫合を削除し、傷口の炎症とケモカイン反応を高める手術後簡単にできます。したがって、場所に到達、描画し、二次感染を回避マウス脳に針を挿入するための戦略が必要です。したがって、我々 はこの手法を作るコスト効果の高い、簡単、かつ、動物に有害である次の段落で説明したように上記プロトコルを変更しました。
まず、2.6 の手順の説明に従って手動で、頭蓋骨に記されているターゲット周辺穴をドリルダウンするのに爪ドリルを使用します。このメソッドは、費用対効果、マウス髄膜・血管の損傷を避けるために全体の手順を監視することができます。脳内出血などの急性期脳卒中後血糖値制御が損なわれます。急性高血糖や糖尿病のような症候群も脳卒中臨床14,15で観察されました。同様に、また分かった糖レベル、インスリン応答出血と膿を持つマウスで脳内。マニュアルに基づく手術のよりよい制御結果の一貫性を確保するため必要があると認識しております。第二に、術後、それ故に、ステッチを回避し、治癒率を加速マウスの頭の皮膚を密封する診療所、組織接着剤 (手順 2.8) でよく使用される新開発医療生体材料の利用をしました。これは簡単に手術の手順を実行して二次炎症の発生を抑えます。第三に、全体の外科的処置の実行に要する時間は比較的短く、マウスの生存の可能性が高くなり、腹腔内に注入される麻酔薬の投与量を下げます。高生存率 (95%) を観察し、この変更されたプロトコルに従うことによって比較的正確な結果が得られました。
この技法の制限は、ドラッグデリバリーの比較的短い時間枠です。ただし、浸透圧ポンプに全身末梢のインスリン シグナル伝達を調節する脳の炎症性ケモカイン効果に焦点を当てて脳、当社の調査だけを再び開くことがなく、マウスの体にまたテーブルを配置できます。末梢組織で追加手術はおそらく炎症性ケモカインの発現を増加し、結果に影響を与える周辺の組織の炎症反応を引き起こすことができます。第二に、薬の半減期はまた調査の期間を制限します。組換えタンパク質ケモカインなど通常短い期間の脳内伝達ブロック CCL5 の影響を検討することもできますが、時間をかけて、活性を失い短い半減期があります。私たちの以前の研究は、長期効果8モデルを提供する CCL5 ノックアウト マウスを生成する遺伝的変更方法も説明しています。
いくつかの新しい技術や脳に薬を提供する別の方法があります。ナノテクノロジーは、中枢神経に薬物を提供する使用ことができる強力な手法です。ただし、多くの医薬品は感温、ナノ粒子16にそれらをパッケージ化しようとしたときに破壊することができます。また、ナノ粒子は BBB を通過でき、siRNA や最も一般的な薬に適している細胞内へ取り込まれるがリガンド-受容体結合のための理想的な方法ではありません。CCL5 効果8を視床下部 ARC ニューロンで、CCR5 レセプターへのバインドが必要ですあり CCL5 拮抗薬MetCCL5 ナノ粒子によるニューロンに配信場合がありますバインドし、セルに CCR5 をブロックする能力の損失表面。
血糖値コントロール (アプライドで投与マウス) と比較して CCL5 拮抗薬MetCCL5 経口ブドウ糖負荷試験で投与したマウスで有意に高値だった。追加インスリン投与 (インスリン負荷試験) はまた下げる血糖値MetCCL5 で受信マウス (図 4 b)、内因性と外部の両方のインスリンが血糖値を減らすことができないことを示唆していることときに CCL5 の視床下部信号をブロックします。マウスは、インスリン抵抗性の視床下部における CCL5 活動がないなった。IRS 1 の増加 serine302 のリン酸化は、受信 Met CCL5 アプライド (図 5 a・ B) を受け取るコントロール マウスと比較されたマウスで発見されました。リン酸化セリン 302 IRS 1 インスリン抵抗6の主な原因は、インスリン受容体から IRS 1 の物理的な解離を誘導するために示されています。インスリンは PI3K Akt 経路など下流の信号をアクティブにすることができます。マウス視床下部組織でインスリンがアクティブではなかった下流シグナル分子である Akt (p AktS473) インスリン注入 Met CCL5、302 セリンのリン酸化が増加した代わりに前のヴィヴォインスリン刺激研究を確認しました。全体で、生理データ (OGTT と ITT) と分子研究、体系的なインスリン抵抗性およびグルコース代謝に寄与する視床下部のインスリン シグナル調節を仲介する視床下部 CCL5 シグナルを示しています。
糖尿病の肥満関連の CCL5 と CCR5 の機構と役割は不明のまま。北出らは、CCR5 の欠乏が肥満誘起性炎症、マクロファージの採用およびインスリン抵抗性17からマウスを保護することを報告しました。しかし、ケネディらによって他の研究は、CCR5 不足が脂肪細胞と筋肉のインスリン シグナル18と同様、全身のグルコース耐性を損なうことを示す反対の結果を発見します。両方の調査には、全身慢性炎症や代償的な応答につながる肥満を誘発する高脂肪の食事療法が適用されます。これらの研究は、インスリン シグナル伝達制御に CCL5 と CCR5 のクリーンでクリアなメカニズムを提供していません。その一方で、浸透圧ポンプ技術により、脳の特定輸液しその期間限定配信で代償的な応答を回避できます。
結論として、脳の輸液システムと浸透圧ポンプ「昔ながら」の手法であるように思われますが、それは安く、簡単に、そしてより少なく有害な薬物送達法を提供して役立ちますリガンド-受容体のシグナル伝達の機能を調査、脳。

インスリンは、脳を含む組織のさまざまなを影響します。インスリンは血液脳関門を通過する、中枢神経系 (CNS) に入るし、末梢インスリン応答、交感神経活性は、食品の摂取量を調節する視床下部におけるインスリン受容体 (IR) と結合します。タイプ 2 の糖尿病 (2 型糖尿病) に貢献する末梢の脂肪組織における慢性炎症が提案されているが、全身のインスリン反応とブドウ糖の不寛容を仲介する視床下部に信号をインスリンに影響を与えるこれらの炎症反応不明のまま。いくつかのケモカインが食欲調節と腫瘍壊死因子-アルファ (tnf α)、インターロイキン (IL)-6、il-1 β などの視床下部1で体温調節に参加単球走化性因子蛋白質 1 (MCP-1)、および CCL5 (C C モチーフ リガンド 5).さらに、視床下部の炎症は、インスリン抵抗性 2 型糖尿病2,3に します。
これらのケモカイン、CCL5 ケモカインの発現レベルの変化とその受容体の中で CCR5、脂肪組織に関連付けられている動物と同様、人間に 2 型糖尿病の動脈硬化症、グルコース不耐症。CCL5 視床下部における食品摂取量と体温の調節を含む神経内分泌機能があります。つまり、CCL5 が視床下部または末梢組織内でインスリン シグナル活性化に参加するかどうかを調査することが重要。
インスリン シグナルは、細胞内でしっかりと規制されています。インスリン、インスリン受容体 (IR) のバインディングは、インスリン受容体基質 (IRS) タンパク質、フォスファチジルイノシトール 3-キナーゼ (PI3K) とタンパク質キナーゼ B (PKB/AKT) 活性化と糖トランスポーター 4 (GLUT4) 膜輸送4 続いてをアクティブに.IRS の蛋白質がこのシグナル伝達経路の主要規制: 肯定的な応答でリン酸化されることができる複数チロシンおよびセリーンの残余があるまたは否定的なインシュリン信号5。たとえば、IRS - 1 302 セリンのリン酸化は、IR から IRS 1 の物理的な解離につながるし、インスリン抵抗6につながる、インスリン シグナル伝達をブロックできます。視床下部の IRS の蛋白質の活動障害マウス7での耐糖能およびインスリン抵抗性を誘導するために示されています。
特定の遺伝子の機能を研究する一般的な方法の 1 つは、全体の生物の全身配布ターゲット遺伝子の表現の操作です。ただし、これはいくつかの欠点があります: 1) それは時間をかけて異なるフィードバック規制や代償的な効果を生成可能性があります、2) このメソッドは特定の脳領域のターゲット蛋白質の役割を示すことには役立ちません。また、組織・細胞特異遺伝子ノックアウト動物が繁殖のために長い時間がかかる、高価。したがって、我々 は短期的な脳輸液浸透圧ポンプ システムは前述の問題を克服するために拮抗薬を使用して脳のターゲット蛋白質のシグナル伝達を妨害する比較的迅速かつ便利な方法 - を使用します。定位注射手術、複雑なスキルと実装および時間における大規模な投資を必要とするために使用します。このプロトコルでは、定位注射と血糖の濃度を検出し、視床下部のインスリン シグナル伝達制御における CCL5 の役割を調査する、以下の有害な迅速かつ瞬時メソッドを実行する簡単で安全な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>Vetbond組織接着剤3M</td><td></td> <td>#1049SB</td><td>マウスの頭の病変部位をシールするために使用される接着剤</td></tr><tr><td>LOCTITE 454インスタント接着剤</td><td>Durect Corporation</td><td>#8670</td>マウス<td>の頭蓋骨に針を固定するために使用される接着剤</td></tr><tr><td>Alzetマイクロ浸透ポンプ</td><td>Durect株式会社</td><td>#9922</td><td>0.11 &mu;1時間あたり、28日間</td></tr><tr><td>脳注入システム</td><td>Durect Corporation</td><td>#8851</td><td>1-3 mm、マウスの脳に薬を灌流するために使用される</td></tr><tr><td>Glucometer</td><td>Roche</td><td>#06870244001</td><td>血糖値を測定するために使用される</td></tr><tr><td>Glucose chip</td><td>Roche</td><td>#06454011020</td><td>血液サンプルをロードするために使用される</td></tr><tr><td>Evan's blue</td><td>Sigma</td> <td>#MKBK0523V</td><td>薬物注入を実演するエリア</td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>ベクトン、ディキンソン、カンパニー</td><td>#3232145 C</td><td>腹腔内インスリン投与に使用</td></tr><tr><td>MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill)</td><td>Mio System</td> <td>#E235-015</td><td>マウスの頭蓋骨に穴を開ける</td></tr><tr><td>CCL5/Met-RANTES Protein</td><td>R&D</td> <td>#ADB0111081</td><td>組換えヒト CCL5、大腸菌由来</td></tr><tr><td>aCSF 式</td><td>119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM グルコース</td><td></td><td>フィルターで滅菌します。0.22 以上 μ;m フィルター装置、および 4°C. で保存 aCSF は 3-4 週間安定です</td></tr><tr><td>Phospho-IRS-1 Serine302 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>#12879</td><td>1:1000 希釈</td></tr><tr><td>IRS-1 (D23G12) 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>#12879</td><td>1:1000 希釈</td></tr><tr><td>Phospho-Akt Serine 473 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>#9916</td><td>1:2000 希釈</td></tr><tr><td>Akt (pan) (C67E7) 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>#9916</td><td>1:1000希釈</td></tr><tr><td>動物:C57BL / 6</td><td>NAR Labs研究</td><td></td><td>で使用した野生型マウス株</td></tr></tbody></table>

マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリン シグナルを勉強

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

インスリンは、視床下部と末梢インスリン応答の体系的な代謝を調節します。末梢の脂肪組織における炎症反応は、2 型糖尿病 (2 型糖尿病) の開発と、視床下部の食欲調節に貢献します。ケモカイン CCL5 と C-C ケモカイン受容体タイプ 5 (CCR5) レベル 2 型糖尿病 (2 型糖尿病) の動脈硬化症、グルコース不耐症を仲介することが提案されています。さらに、CCL5 役割を果たしている神経内分泌視床下部の食品摂取量と体温、したがってを調節することによって視床下部のインスリン シグナルの機能と末梢グルコース代謝の調節を調査するよう求められます。
マイクロ浸透圧ポンプ脳注入システムは CCL5 関数を操作し、脳でその効果を研究の迅速かつ正確な方法。また、遺伝子ノックアウト動物を生成する便利な方法を提供します。このシステムで CCL5 信号は、マイクロ浸透圧ポンプを使用してその拮抗薬、 MetCCL5 (ICV) 脳室内注入によってブロックされました。末梢グルコース代謝とインスリンの応答性は、経口ブドウ糖耐性試験 (OGTT)、インスリン耐性テスト (ITT) によって検出されました。動物由来組織サンプルからタンパク質のしみによってインスリン シグナル伝達活動を分析しました。
MetCCL5 注入、糖代謝とインスリンの 7 〜 14 日後 OGTT と ITT の結果に見られるように、応答性はマウスで障害者。IRS 1 serine302 のリン酸化は増大し、Akt 活動マウス視床下部ニューロンの抑制 CCL5 で低下していた。完全に、私達のデータ提案するマウス脳における CCL5 をブロック IRS 1 S302 のリン酸化を増加し、割り込みの視床下部のインスリン シグナル、グルコースの障害と同様に、末梢組織でのインスリン機能の低下につながる代謝。

浸透圧輸液ポンプ、コントロールや CCL5 拮抗薬MetCCL5 (脳における CCL5 効果をブロック) のいずれかのアプライドを含む手術で実行した場合は、マウスで行われました。手術後 7 及び 14 日、末梢グルコース トレランスとマウスのインスリン応答性プロトコルで述べたように、(7 日) 後 OGTT と ITT (14 日後) を使用して行った。6 時間絶食後は経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とマウスのインスリン負荷試験 (ITT) を行った。マウス経口、彼らそれぞれの体重に基づいて量グルコースを投与しました。図 3に示すように、血糖値の変化を記録しました。マウスに腹腔内 (IP) インスリン注射によるインスリン感受性試験を行ったし、血糖値の変化をすぐに測定しました。図 4に示すように、インスリン刺激によるマウス別の点滴薬と血糖値の変化を記録しました。血糖値は、血糖管理 (図 3 b) とアプライド投与によるマウスと比較して CCL5 拮抗剤 (MetCCL5) 投与マウスにおけるインスリン注入 (図 4 b) 後少しだけ減った。MetCCL5 脳内投与でマウスの末梢グルコース代謝にインスリン機能の障害を示唆します。
次に、IRS 1 リン酸化と視床下部組織における Akt の活性化レベルを評価することによってインスリン シグナルの活性化を行った。IRS 1 の 302 のセリンのリン酸化 (MetCCL5) 拮抗薬を投与したマウスで亢進していた (図 5 b・ C) マウスが通常与えられたとき。マウス視床下部コントロール グループでアプライド投与やインスリン チャレンジは、下流のシグナル分子 Akt (リン酸化 Akt セリン 473) を活性化 (図 5F) IRS 1 serine302 活性化 (を増加させることがなく図 5-E)リン酸化 Akt serine473。対照的に、Akt シグナルMetCCL5 注入マウスで増加しなかったが、代わりに IRS 1 302 セリンのリン酸化の増加があった。一方、視床下部の障害末梢インスリン機能インスリン活性を中断マウス脳における CCL5 信号をブロックします。ITT は、OGTT、およびインスリン挑戦前のヴィヴォの結果など、全体的な調査結果から視床下部の CCL5 がインスリン シグナル活性化とインスリン刺激による末梢グルコース代謝に寄与するいると考えられました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig1.jpg"> 
図 1。マウスで浸透圧ポンプの準備と移植手術します。薬液を灌流脳注入 (A) キットおよびポンプの準備。赤い矢印は、液体で満たされたカテーテル チューブを示します。(B) 修正とマウント定位装置の上にマウスの頭。(C) 独立したマイクロ浸透圧ポンプ脳輸液セットの注入の皮下皮膚から皮膚の最も外側の層線分は、浸透圧ポンプ インプラントの位置を示します。(D) の矢印は、注入側を表します。(E) 頭蓋のマーク周辺穴を開けます。(F) 場所浸透圧ポンプ脳注入はマウスの背中に設定、脳注入針を穴 (ダッシュ丸) に挿入します。(G) は組織接着剤の接着剤を使用して頭蓋骨に針を修正し、(H) のように (G で先のとがったはさみ) 針の上部を切断します。(私) 傷を使用してシール組織接着剤接着剤。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig2.jpg"> 
図 2 。薬は浸透圧ポンプを用いた心室領域で投与した薬剤拡散領域の代表的なイメージ。エヴァンのブルーは (A) の心室の領域に浸透圧ポンプ薬剤注入図と側面および第 3 脳室 (B) に拡散で使用される代表的な薬剤です。スケール バー = 0.5 cm<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig3.jpg"> 
図 3.術後経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) を用いてマウスの糖代謝。血ブドウ糖のレベルの分布を変更次の WT マウスにおけるグルコースの経口投与はアプライド (A) とMCCL5 拮抗薬を注入 (B)。データは、平均 ± SE。 (図8から変更) として表示されます。* p &lt; 双方向分散分析により 0.05。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig4.jpg"> 
図 4 。マウスの血糖値・ インスリン負荷試験 (ITT) でインスリン機能。血ブドウ糖のレベルの分布変更アプライド (A) を流し込んで WT マウスのインスリン注射とMCCL5 拮抗薬を注入 (B)。平均 ± SE (図8から変更) として表示されるデータ。p &lt; 0.001 二元によって。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig5.jpg"> 
図 5。手術後マウスにおけるインスリン シグナル活性します。アプライドやMetCCL5 CCL5 拮抗薬と扱われるマウス視床下部組織で IRS-1 (インスリン応答基板 1、pIRS1S302) の抑制のセリン 302 のリン酸化のフォームの (A) 西部のしみ (MCCL5)輸液ポンプ。(B) 通常の供給とマウス視床下部に注入後蛍光体 IRS 1S302の関連レベル。(C) IRS 1 と Akt の活性化 (pAktS473りん Akt S473) アプライドやMETCCL5 注入後視床下部組織でインスリン刺激の有無の S302 リン酸化の西部のしみ。(D E)ピアース 1S302、pS6KT421、pAktS473の相対的なレベル。(各棒グラフの「2」の略: n = すべての数量の 2)。(5 D ホには、空白のバー左: インスリン; なし 5 D e ストリップ バー右: インスリン)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>マウスの ID</td>
			<td>体</td>
			<td>グルコース</td>
			<td>スタート</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>重量</td>
			<td>Μ L = 10xBW</td>
			<td>時間</td>
			<td>分</td>
			<td>分</td>
			<td>分</td>
			<td>分</td>
			<td>分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>25.8 g</td>
			<td>258</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:15</td>
			<td>9:30</td>
			<td>10:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25.3 g</td>
			<td>253</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:22</td>
			<td>9:37</td>
			<td>10:07</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1.経口ブドウ糖耐性試験 (OGTT) の記録のためのタイム テーブル
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>マウスの ID</td>
			<td>体</td>
			<td>インスリン 0.25 IU</td>
			<td>スタート</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>重量</td>
			<td>Μ L = 3xBW</td>
			<td>時間</td>
			<td>分</td>
			<td>分</td>
			<td>分</td>
			<td>分</td>
			<td>分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>28.8 g</td>
			<td>86.4</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:15</td>
			<td>9:30</td>
			<td>10:00</td>
			<td>10:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25.3 g</td>
			<td>75.9</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:22</td>
			<td>9:37</td>
			<td>10:07</td>
			<td>10:37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2.インスリン耐性テスト (ITT) 録音のためのタイム テーブル

このプロトコルは、マイクロ浸透圧ポンプ脳輸液システムを使用してマウスの脳に拮抗、 MetCCL5 を提供することによって視床下部におけるケモカイン (C C モチーフ) リガンド 5 (CCL5) の役割を研究します。CCL5 活動のこの一時的な抑制は、視床下部のインスリン シグナル伝達、周辺の全身のインスリン感受性と耐糖能異常につながる中断。

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

この実験の全体的な目標は、視床下部 C-C-L-5 シグナル伝達の役割を調査することです 末梢系のインスリン機能とグルコース代謝 C-C-L-5 シグナル伝達を操作することにより、アンタゴニスト Met-C-C-L-5 を投与します 脳間心室送達システム、微小浸透圧ポンプ。この薬は、脳内の体糖代謝とインスリン応答性の制御におけるケモカインC-C-L-5など、生化学生理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この措置の主な利点は、実験者が、げっ歯類で遺伝子操作を行うときに通常起こるような代償効果や障害の発症なしに、ここにあるC-C-L-5のような脳内の特定のシグナル伝達を一定期間簡単に操作できることです。微小浸透圧ポンプの挿入と血中インスリンとグルコースレベルの正確な測定にはスキルと精度が必要なため、この手順を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。手術の1日前に、1ミリリットルの注射器と鈍い頭の針を使用して、ポンプに人工脳脊髄液、またはA-C-S-Fを充填することにより、脳微小浸透圧ポンプを準備します。次に、ポンプをACSFに浸し、シェーカーに置いて一晩穏やかに振とうします。翌日、A-C-S-Fをポンプから取り外し、事前に調製した薬剤液をA-C-S-Fで希釈して、余分なものが漏れるまで完全に充填します。次に、手術用ハサミを使用して、カテーテルチューブを希望の長さに切断します。鈍い先端の脳注入針を使用して、チューブを脳注入キットに取り付けます。次に、輸液キットのチューブに薬液を入れます。キットを組み立てたら、微小浸透圧ポンプに取り付けます。最後に、ポンプが乾燥するのを防ぐために、浸透圧ポンプの脳注入設定を滅菌された50ミリリットルのチューブ内にACSFに浸します。手術を開始するには、麻酔をかけたマウスの頭部を定位装置に装着して固定します。手術用のハサミとペンチを使用して、頭蓋骨を覆っている外側の皮膚を切り開きます。次に、ヨウ素を使用して周囲の頭蓋骨を清掃します。次に、首の領域の近くにある鈍い頭のハサミを使用して、浸透圧ポンプ脳融合セットの移植のために、皮膚の最外層を皮下皮膚から分離します。定位装置を使用して、脳マップを参照して注入ポイントをマークします。ネイルドリルを使用して、マウスの髄膜や血管を壊さないように注意しながら、頭蓋骨にマークされた領域の周りに穴を開けます。次に、目的の薬物を含む微小浸透圧ポンプ脳融合セット、またはコントロールとしてのA-C-S-Fを、首の領域の後ろの皮膚の下に置きます。薬物を脳に注入するには、ドリルで開けた穴に脳注入針を挿入します。表面減感作ジェルを使用して針を頭蓋骨の所定の位置に固定し、接着剤が乾くまで待ちます。針の上の突出部を切り取ります。耐糖能試験を開始する前に、3.75グラムのグルコースと15ミリリットルの蒸留水を溶解してグルコース溶液を調製します。各血液検査の間に適切な間隔を空けたタイムテーブルを設定して、実験中の測定値を記録します。次に、絶食後の各マウスの体重を量り、注射に適したブドウ糖の量を計算します。次に、作業台で、タイマー、グルコースチップ、グルコメーター、インスリン注射器、かみそりの刃を準備します。血糖値を測定するには、まず新しいグルコースチップをグルコメーターに挿入し、スタートボタンを押してゼロを設定します。次に、マウスの首の後ろをつまみ、尻尾を撫でて十分な血流を確保します。新しいカミソリの刃を使って尾の小片を切り取り、ブドウ糖チップに一滴の血液を絞り出します。胃内洗浄技術を使用して、マウスにグルコースを供給し、すぐにタイマーを開始します。さまざまな時点でグルコースを測定します。インスリン負荷試験を開始するには、0.25単位のヒトインスリン溶液を準備します。次に、絶食後に各マウスの体重を量り、注射に適したインスリンの量を計算します。次に、実験中の測定値を記録するためのタイムテーブルを設定します。最後に、インスリン注射後、以前に行ったように血糖値を測定します。グルコース代謝は、マウスにグルコースを経口投与した後、手術後の経口ブドウ糖負荷試験によって測定されました。A-C-S-Fを注入したマウス、またはC-C-L-5アンタゴニストを注入したマウスの血糖値の変化を記録し、ここに示します。インスリン感受性試験も実施され、C-C-L-5拮抗薬を注入されたマウスの血糖値は対照マウスと比較してわずかに低下しただけであり、C-C-L-5で治療されたマウスの末梢グルコース代謝に対するインスリン機能の障害が示唆されました。インスリンシグナルの活性化を解析するために、視床下部でインスリン受容体基質タンパク質、またはI-R-S-1リン酸化を評価しました。C-C-L-5アンタゴニストで治療したマウスでは、通常給餌した場合、I-R-S-1リン酸化は対照群と比較してアップレギュレーションされました。インスリンシグナルの活性化をさらに解析するために、インスリン下流のシグナル伝達分子であるリン酸化セリン4-7-3 Aktのレベルも評価しました。その後、インスリンチャレンジA-K-Tシグナルは、コントロールA-C-S-Fで治療したマウスでは増加したが、C-C-L-5拮抗薬で治療したマウスでは増加しなかった。微小浸透圧ポンプの挿入をマスターすると、適切に行えば30分しかかかりません。この手順を試みるときは、マウスの頭がわずかに持ち上げられ、背骨が定位装置上でまっすぐになっていることを確認することが重要です。この手法は、研究者に内分泌学でげっ歯類の脳内の薬物、ケモカイン、またはタンパク質機能の影響を調査する方法を提供します。この手順に続いて、ウイルスの脳内送達による遺伝子発現の操作、またはクリスパー9などの追加の手段を実行して、C-C-L-5および受容体C-C-L-5が食物の消化および代謝回路にどのように関与しているかなどの追加の質問に答えることができますか?

studying-hypothalamic-insulin-signal-to-peripheral-glucose

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マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリンシグナルを勉強

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