キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

この手順の全体的な目標は、短時間の機械的摂動後の細胞内シグナル伝達ネットワークのさまざまなコンポーネントの活性を調べることです。この方法は、細胞がどのようにして機械的刺激を含む多様な環境手がかりを感知し、方向に移動するかなど、細胞移動の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、運動性または極性が応答に交絡して寄与することなく、機械的刺激に対する初期応答を調査できることです。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、わずかな攪拌で送達された化学誘引物質に対する接着細胞の応答をテストしたときに、ビヒクル制御で刺激された細胞の強力な応答に気づきました。まず、凍結ストックから少数の細胞を抗生物質なしでHL5培地に接種してクレブシエラエアロゲネスを調製し、培養物を一晩インキュベートします。Klebsiella aerogenes細菌の存在下でのDictyosteliumの増殖は、マクロピノソームの数を減らし、外部刺激に対する細胞の応答性を改善します。

バクテリアの準備ができたときに、Dictyosteliumが指数関数的に成長するように実験のタイミングを計ります。これらのDictyostelium細胞を採取し、血球計算盤を使用してカウントします。次に、100, 000個のDictyostelium細胞を含む細菌懸濁液の260マイクロリットルをSMプレートに広げます。

また、保険のために、Dictyostelium細胞の数が2倍と半分のプレートを準備します。室温で1日成長した後、プレートを反転させ、Dictyostelium細胞が細菌の芝生を片付け始めるが、まだ凝集し始めていないまでプレートの培養を続けます。次に、5ミリリットルのDBバッファーをプレートに加え、ガラススプレッダーを使用してDictyosteliumをこすり落とします。

細胞と溶液を50ミリリットルのポリプロピレンチューブに移し、次にプレートをさらに5ミリリットルのDBですすぎ、これを50ミリリットルのチューブに加えます。必要に応じて繰り返します。Dictyosteliumを洗浄するには、チューブにDBを最大50ミリリットルまで補充し、細胞をペレット化してから、上清を吸引して廃棄します。

上清が透明になるまで細胞を繰り返し洗浄します。最後に、DBバッファー中のDictyosteliumを1ミリリットルあたり約500万個の細胞に再懸濁します。まず、200万個の凝集能力を持つDictyosteliumを35mmの皿に2ミリリットルのDBを盛り付けます。各時点ごとに1つのプレートと非刺激制御を準備します。

室温で、細胞をプレートに10分間付着させます。次に、1ミリリットルのDBで2回のすすぎを使用して、付着していない細胞をプレートから洗い流します。プレートから未付着のDictyosteliumが除去されたら、プレートを乱さずに、付着した細胞をベーソレーションバッファーで30分間インキュベートします。細胞の早期刺激を防ぐために、30分間のインキュベーション中にプレートの動きを避けることが非常に重要です。

次に、制御された量の機械的刺激を加えるには、プレートを個別にオービタルシェーカーに移し、シェーカーを150rpmで5秒間運転します。次に、所望の時間が経過したら、バッファーを吸引し、すぐにプレートを氷の上に置きます。すぐにプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含む100マイクロリットルのサンプルバッファーを加え、細胞をこすり落とします。

ライセートを1.5ミリリットルのチューブに集め、すぐに摂氏95度で10分間加熱します。ライセートの分析を続行するか、摂氏マイナス20度に移して保存します。栄養細胞または凝集コンピテントセルの懸濁液を作成した後、約600マイクロリットルをマイクロ流体チャンバースライドにロードします。

インレットは完全に充填されている必要があるため、必要に応じてバッファーを補充します。セルを 10 分間アタッチします。デバイスの入力ラインを15ミリリットルのリザーバーを備えた電子ポンプに接続します。

ポンプのソフトウェア制御を使用して、バルブを閉じてから、リザーバーにDBを充填します。次に、圧力を50ミリバールに設定し、ポンプをオンにします。DBでラインを充填してすすぎ、バルブをクリックして開きます。約30秒間すすぎた後、圧力をゼロに戻し、バルブを閉じます。

次に、スライドの片側にある3つのインレットのいずれかにラインを接続します。気泡を閉じ込めず、接続が確立されたら、スライドのその側にある他の2つの入口を覆います。次に、ドレンからのラインをスライドの反対側にある単一の出口に接続してセットアップを完了します。

次に、蛍光顕微鏡の明視野照明または位相照明下で、20倍対物レンズでチャンネルを観察し、チャンネルをすすぎます。次に、圧力を約50ミリバールに設定し、バルブを開きます。ドレンから液体が出てきたら、外圧をゼロにし、約30秒待ってからバルブを閉じます。

次に、40Xオイル対物レンズに切り替え、チャネルの最も広い部分に焦点を合わせ、RFPまたはGFP照明で3秒ごとに画像を収集するようにソフトウェアを準備します。バルブを閉じた状態で、圧力を希望の値に設定します。次に、3秒間隔で5つの事前刺激画像を取得します。

次に、バルブを短く開いて刺激を与えます。次に、45 秒間で少なくとも 15 フレームのデータを収集します。テキストプロトコルで説明されているように、応答を定量化します。

まず、前のセクションで説明したように、マイクロ流体スライドにDictyosteliumをロードします。この実験では、2つの入力ラインを準備します。ラインを閉じるには、処理液を運ぶラインとソフトウェア制御のバルブに物理的なクランプを使用して、DB液を運ぶラインを車両で閉じます。

次に、2つのラインに適切な溶液、バッファーとビヒクルのみ、または阻害剤などの処理を施したバッファーを充填します。ラインをすすぎたら、スライドの側面にある2つのインレットにラインをチャネルで接続し、未使用のインレットにキャップをします。次に、ドレンラインを反対側のコンセントに接続します。

次に、前述のようにバッファープラスビヒクルを使用してスライドを洗浄します。次に、チャネルを治療で満たします。まず、流れをゼロミリバールに減らします。

次に、バルブを切り替え、約15秒間処理を流し、インキュベーションのタイミングを計ります。約10分ごとに、新鮮な処理溶液を細胞上に約15秒間流し、チャンバー内の酸素レベルを補充します。接着凝集コンピテントセルを、オービタルシェーカーを使用して5秒間のせん断流に曝露しました。

Dictyosteliumは、基礎活性を低下させるためにカフェインで前処理されました。その結果、PKBR1およびERK2の基礎活性は非常に低く、刺激によるこれらのキナーゼの主要残基のリン酸化の大幅な増加が見られました。さまざまな蛍光標識バイオセンサーを発現する凝集コンピテントセルでは、PIP3または新たに重合したアクチンによってリクルートされる2つのリーディングエッジマーカーであるPHcracとLimEの両方が、休止細胞で主に細胞質に局在することを示しました。

5秒間のせん断流の後、これらのバイオセンサーは急速に皮質に再局在し、サイトゾルに戻りました。アクチン解重合薬ラトランキュリンAの効果は、同様のせん断力実験を用いて試験された。この場合、栄養細胞は最初に制御条件に曝露され、次に所望の試験剤を含む緩衝液に切り替えられた。

ラトランクリンA処理は、前縁マーカーの皮質への再局在をブロックしました。興味深いことに、フローが2秒後に停止されず、実験期間中はオンのままであった場合でも、一時的なグローバル応答が観察されました。全体的な応答に続いて、栄養細胞は流れに逆らって移動しました。

これらのアッセイを成功させるには、細胞の適切な調製が非常に重要です。栄養細胞は、機械的刺激に対する応答性を確保するために、細菌と関連して増殖させる必要があります。凝集コンピテントセルの場合、発達が不十分または過剰に発達している細胞は、応答が不十分になる傾向があります。

生化学的アプローチと顕微鏡的アプローチは互いに補完し合うため、機械的刺激に対する応答について多数のシグナル伝達中間体を評価することができました。薬理学的摂動と遺伝的摂動を追加することで、機械的刺激がどのように知覚され、伝達されるかを学ぶことができます。これは、せん断流などの物理的刺激によって導かれる指向性細胞遊走を理解するために重要です。

機械的刺激は、化学誘引物質と同じシグナル伝達ネットワークの活性化を引き起こすため、細胞へのさまざまな刺激の統合を調べることができます。最終的に、これらの研究は、私たち自身の免疫細胞や転移性がん細胞などの移動する細胞が体内をどのように移動するかを理解するのに役立ちます。