Name: キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶ機械刺激応答評価法。キイロタマホコリカビを用いた細胞内シグナル伝達ネットワークの活性化を顕微鏡と生化学的手法で解析し、初期応答を運動性から分離して測定する革新的アプローチです。

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この作品は、国立衛生研究所健康付与 R35 GM118177 PND によって支えられました。

<ol><li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+chemotaxis%3A+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility%2C+directional+sensing%2C+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li>
<li>Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li>
<li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt%2FPKB+during+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li>
<li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell%27s+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li>
<li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li>
<li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li>
<li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li>
<li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves%2C+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li>
<li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li>
<li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+paradigm%3A+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li>
<li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li>
<li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+j%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li>
<li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li>
<li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li>
<li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li>
<li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li>
<li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24535823">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li>
<li>Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3381519/">Analysis of chemotaxis in Dictyostelium.</a> Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2%2F3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li>
<li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li>
<li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Akt%2FPKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li>
<li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li>
</ol>

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ここで説明する方法は、人口とせん断流れに対する個々 のセル動作の両方を評価するために便利な方法を提供しています。重要なは、以前の研究は、導くおよび移行中にエッジ マーカーをラギングの局在解析、現在のアプローチは鋭くせん断流を適用することによって即時の効果の調査をできます。このメソッドを使用して、実際には、せん断流れに細胞の初期応答必要がないこと細胞の移動を行った。代わりに、初期せん断流刺激に対する迅速かつ過渡応答せん断流れ、走化性因子のグラデーションを見て初期グローバル応答と同様に、長時間見られる方向の移行の前に。
各メソッドは異なる長所と短所を持っているにもかかわらず、生化学的およびミクロ的アプローチは補完的なデータを生成します。続いてセル換散、PKBs、KrsB、および、ERK のイムノブロット刺激はたとえば、菌の全人口を分析し、こうして個々 のセルの動作を検査するアッセイとは異なり、細胞間変動の平均値します。ただし、人口に基づく試金は個々 の細胞を分析することによって簡単に観察できる細胞行動の微妙な変化をマスクする傾向があります。さらに、ここで説明した生化学的アッセイのみ理由...

真核細胞の移行は水溶性または基質結合塩基のグラデーション、基板、電気フィールド、またはせん断流の可変剛性を含む環境の多様な化学と物理の合図によってバイアスされています。走化性を運転する分子機構の理解に多くの進歩をされているが、以下は指示移行と統合を生成する細胞レベルでこれらの多様な信号を統合する方法の他の種類について知られている渡り鳥応答。
監督、走化性因子の集積が進む方向への移動には行動の 3 つのコンポーネントが含まれます: 運動方向検出、極性1。運動は、仮足突起により細胞のランダムな動きを指します。方向性、走化性因子の原因を検出する細胞の能力は、センシングでも発生することができます細胞を固定化しました。極性は、リーディング エッジと運動の増加の永続につながる細胞の遅行エッジ間細胞内コンポーネントのより安定した非対称的な配分を指します。
4 つの概念上定義された制御ネットワークの活動に依存する、走化性因子への細胞応答: 受容体/極性1アクチン細胞骨格、シグナル伝達蛋白質 G。G タンパク質共役型受容体への走化性因子のバインドは、ヘテロ三量体 G タンパク質 α と βγ 方向信号を増幅する下流のシグナル伝達ネットワークを経由で信号を送信します。シグナル伝達ネットワーク内の複数経路並行行為し、アクチン細胞骨格ネットワーク バイアス アクチン重合とグラデーションの方向に、結果として仮足突起にフィードします。走化性の重要な規制当局の間では、しますグアニル酸シクラーゼ、ホスファターゼとは、テンシンの相同物 (PTEN) ホスホイノシチド 3-キナーゼ (PI3K) Ras GTPase、TorC2。シグナル伝達ネットワークの内で、およびシグナル伝達とアクチン細胞骨格のネットワークをさらにフィードバック機構は、応答を増幅します。最後に、定義が不十分な極性ネットワークはアクチン細胞骨格から入力を受け、さらにグラデーションの方向で永続的な移行を促進するシグナル伝達ネットワーク バイアスがかかります。
走化性のメカニズム理解の多くは、制御ネットワークのさまざまなコンポーネントのタグ付きの蛍光バイオ センサーの開発のために可能になった。多くの走化性規制規制分子自体またはその活動の非対称的な配分があります。たとえば、認識バイオ アクティブ バージョンの小さな低分子量 g 蛋白質 Ras や Rap1-Ras 結合ドメイン (称します RBD) Raf1 のモデル、それぞれ-chemotaxing 携帯2,3のリーディング エッジにローカライズします。同様に、PI3K およびその製品ホスファチジルイノシトール (3,4,5)-三リン酸 (PIP3)、プレクストリン相同性 (PH) ドメインで認識もセル4、5の前面にローカリゼーションを表示します。対照的に、3 ホスファターゼ PTEN 変換 PIP3 ホスファチジルイノシトール (4, 5) に戻る-ビスリン酸、ローカライズ セル6のラギングの端に。重要なは、これらのバイオ センサーは、走化性因子とグローバルの刺激への応答への局在を変更します。ゾル性細胞質または皮質局在と欠席しているエッジ マーカーの遅れをとっているに対し、皮質に戻して静止細胞の突起の先端にリーディング エッジ マーカー静止細胞の突起の先端からなる後ゾル性細胞質刺激。バイオ センサー、走化性因子とグローバルの刺激への応答分布の解析は、運動と極性、観測をしばしば混同の貢献を最小化します。走化性因子、細胞懸濁液のグローバルまたは一様刺激はしばしばタンパク質リン酸化7,8,9によって検出される蛋白質のアクティブ化人口全体の変更を評価するツールとして使用も.顕微鏡制御ネットワークのさまざまなコンポーネントの動作に関する時間的・空間的情報を収集するために使用に対し主、この生化学的な試金は時間情報を取得する使用されます。
シグナル伝達ネットワークには、興奮性システム10,11の機能が組み込まれています。スープラしきい値走化性刺激に対する応答は「全か無か」であり、不応期が表示されます。応答が確率的に発生しても、振動現象を示すことができます。シグナル伝達イベント波12,13,14,15として伝播する大脳皮質の領域に局在しています。前面、または背面、マーカー、募集または伝播する波のアクティブ ・ ゾーンから切り離します。末尾のアクティブなゾーン ・難治性地域のため逆方向の波を彼らを満たして全滅させます。伝搬波の信号伝達細胞移行10を仲介する細胞の突起の根底にあります。
同じような調節機構が好中球とその他哺乳類の細胞の種類16 に該当するも、走化性については前述の多くはキイロタマホコリカビ、社会的なアメーバの研究から来た.細胞性粘菌単一細胞の何千もを最終的に胞子を含む多細胞の子実体を形成集計センターへ移行と飢餓では、堅牢な走化性応答のある確立されたモデル有機体をあります。走化性は、この生物の細菌の食料源を検索するための単一細胞の成長段階も重要です。重要なは、単一の細胞性粘菌の移行は、哺乳類の好中球または非常に急速なアメーバ型移行を受けるすべての転移性癌細胞の移行に似ています。実際には、両方全体的な制御ネットワークのトポロジと同様、走化性に関与する個々 のシグナル伝達経路の多くは、細胞性粘菌と哺乳類白血球17の間保存されます。さらに、線維芽細胞など、他のセルは、Gpcr; 代わりに受容器のチロシンのキナーゼ (RTK) を使用します。ただし、RTKs は同じようなネットワークにフィード可能性があります。
走化性と対照をなして指示移行の他の各種のモードを駆動する信号メカニズムの理解が欠けています。同様に細胞走化性因子のグラデーションで移行するいくつか報告されている活性化および/または局在アクチン重合、PIP3 および/または細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) 1/2 を含む典型的なリーディング エッジ マーカーで、経るセルの前面は、作用するせん断流れまたは電界18,19,20,21の変更への応答で移行を指示しました。しかし、これらの研究の刺激に連続暴露も結果細胞遊走と疑問が残ったかどうか、具体的には、刺激に対する反応のリーディング エッジ マーカーのローカライズなど、または彼らは単にリーディング エッジにローカライズために移行するセルの前面に仮足数の増加。
人口レベルで両方のせん断流れと個々 のセル22として配信される急性の力学的摂動に対する細胞の反応を観察することができるアッセイを開発しました。走化性因子、急性 stimula グローバル刺激に似ていますせん断流のグローバリゼ-ションは、運動または極性から交絡の貢献をせず機械的刺激に対する細胞応答の研究をことができます。遺伝的または薬理学的摂動とこれらの生化学的および顕微鏡的アッセイを組み合わせることにより、私たちはどのように力学的刺激については、認識されて学ぶことして転送します。また、このアプローチはまた走化性因子、受容体/G からシグナル伝達とアクチン細胞骨格のネットワーク分離のない状態で走化性因子の受容体の下流のシステムへのタッピング法を提供しますタンパク質ネットワーク。
最近我々 は以下の方法を使用して、走化性シグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワーク22の複数のコンポーネントの活性化につながるその急性のせん断応力を示した。さまざまな間隔で急性の機械的刺激により、我々 は、同様にする走化性因子、力学的刺激に対する応答も展示下応答の全か無かの動作を含む、興奮性システムの機能実証飽和条件と不応期の存在。最後に、機械的、化学的刺激を組み合わせることによって示したシグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワーク、可能性があります複数バイアス細胞遊走刺激の統合を可能にする、2 つの刺激を共有します。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>フィッシャー</td><td>D16-1</td><td>HL-5培地とSMプレートの調製に使用(ステップ1.1、1.2)</td></tr><tr><td>プロテオースペプトン</td><td>フィ</td><td>ッシャーDF0120-17-6</td><td>HL-5培地の調製に使用(ステップ1.1)酵母</td></tr><tr><td>抽出</td><td>物フィ</td><td>ッシャー50-550-445</td><td>HL-5培地とSMプレートの調製に使用(ステップ1.1、1.2)</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>HL-5培地、および10Xリン酸緩衝液の調製に使用します(ステップ1.1、1.3)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>HL-5培地、SMプレート、および10Xリン酸緩衝液の調製に使用します(ステップ1.1-1.3)</td></tr><tr><td>ストレプトマイシン(硫酸ジヒドロストレプトマイシン)</td><td>フィッシャー</td><td>ICN10040525</td><td>HL-5培地の調製に使用します(ステップ1.1)</td></tr><tr><td>ペプトン(バクト)</td><td>フィッシャー</td><td>DF0118-17-0</td><td>SMプレートの調製に使用(ステップ1.2)</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>SMプレートの調製に使用(ステップ1.2)</td></tr><tr><td>寒天</td><td>フィッシャー</td><td>BP1423-500</td><td>SMプレートの調製に使用(ステップ1.2)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>DBバッファーの調製に使用(ステップ1.4)</td></tr><tr><td>CaCl2</sub</td><td>>Fisher</td><td>C79-500</td><td>DBバッファー(ステップ1.4)カフェ</td></tr><tr><td>イン</td><td>フィ</td><td>ッシャーO1728-500</td><td>カフェイン(ステップ1.5)</td></tr><tr><td>cAMP(EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3フィート、5フィート-環状一リン酸、ナトリウム塩)</td><td>フィ</td><td>ッシャー11-680-1100MG</td><td>cAMPの調製に使用(ステップ1.6)</td></tr><tr><td>葉酸</td><td>シグマ</td><td>F7876</td><td>葉酸の調製に使用酸 (ステップ 1.7)</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>3X サンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>3X サンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>3X サンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610610</td><td>3X サンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)</td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610404</td><td>3X サンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むサンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むサンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)</td></tr><tr><td>ピロリン酸ナトリウム十水和物</td>フィ<td>ッシャーS390-500</td><td>プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むサンプル緩衝液を調製するために使用します(ステップ1.8)</td><td></td></tr><tr><td>完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル(ロシュ)</td><td>シグマ</td><td>11873580001</td><td>プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むサンプル緩衝液を調製するために使用します(ステップ1.8)</td></tr><tr><td>ラトランクリンA</td><td>エンツォライフサイエンス</td><td>BML-T119-0100</td><td>ラトランクリンA(ステップ1.9)を調製するために使用します</td></tr><tr><td>4-15% Tris-HCl ポリアクリルアミドゲル</td><td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>イムノブロッティングに使用 (ステップ 3.3)</td></tr><tr><td>ポリフッ化ビニリデン</td>メンブレン <td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>イムノブロッティングに使用 (ステップ 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) ウサギ抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2060</td><td>イムノブロッティングに使用するための一次抗体 (ステップ 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>一次抗体 (ステップ 3.3)</td></tr><tr><td>Rabbit IgG HRP Linked Entire Ab (from Donkey)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>Secondary antibody for use in immunoblotting (ステップ 3.3)</td></tr><tr><td>Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate)</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>イムノブロッティング用 (ステップ 3.3)</td></tr><tr><td>ストリッピングバッファー(Restore Plusウェスタンブロットストリッピングバッファー)</td><td>ピアス</td><td>PI46430</td><td>イムノブロッティングに使用(ステップ3.3)</td></tr><tr><td>クマシーブリリアントブルー</td><td>フィッシャー</td><td>PI20278</td><td>イムノブロッティングに使用(ステップ3.3)</td></tr><tr><td>K.エアロゲネス株(非病原性)</td><td>ディクティストックセンター(dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>><材料および機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitalシェーカー(モデルG-33、または同等の代替品)</td><td>ニューブランズウィック州科学</td><td></td><td>的な使用K.aerogenesを成長させ(ステップ2.1.1)、およびD.discoideum細胞をbasalateおよび刺激する(ステップ3)。このシェーカーの旋回半径は9.5mmです。</td></tr><tr><td>10 cm ペトリ皿</td><td>フィッシャー</td><td>FB0875712</td><td>SM プレートの準備に使用 (ステップ 1.2)</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>フィッシャー</td><td>02-671-51B</td><td>D. discoideum 細胞のカウントに使用 (ステップ 2.1.2)</td></tr><tr><td>35 mm ディッシュ (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td><td>フィッシャー</td><td>08-772A</td> 機械刺激とそれ<td>に続く細胞溶解のためのプレートD. discoideum細胞に使用 (ステップ 3.1.1)</td></tr><tr><td>ポリスチレンカップ(5mL)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>走化性物質でD.ディスコイデウム細胞懸濁液を刺激するために使用します(ステップ3.2.2)</td></tr><tr><td>ポンプ付き流体ユニット(イビディポンプシステム)</td><td>イビディ</td><td>10902</td><td>チャネル内のD.ディスコイデウム細胞に機械的刺激を与えるために使用します(ステップ4.1、4.2、および5)</td></tr><tr><td>チャネル付きスライド(&mu;-Slide III 3in1 ibiTreat:#1.5ポリマーカバースリップ、組織培養処理、滅菌)</td><td>同上</td><td>80316</td>流体<td>デバイスによって供給される機械的刺激のためのプレートD.ディスコイデウム細胞に使用(ステップ4.1、4.2、および5)</td></tr><tr><td>50mLリザーバー(流体ユニット用同上リザーバーホルダー)</td><td>同上</td><td>10978</td><td>チャネル内のD. discoideum細胞に機械的刺激を送達するための流体デバイスのセットアップに使用します（ステップ4.1、4.2、および5)</td></tr><tr><td>流体ユニットのライン（灌流セットYELLOW-and-GREEN同</td><td>上</td><td>10964</td>チャネル<td>内のD.ディスコイデウム細胞に機械的刺激を送達するための流体デバイスのセットアップに使用します（ステップ4.1、 4.2、および5)。注:2本のラインは、1.6mmチューブ(カタログ番号10842)からもカットできます。</td></tr><tr><td>ドレン用ライン(内径1.6mmチューブ)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>チャネル内のD. discoideum細胞に機械的刺激を与えるための流体デバイスのセットアップに使用します(ステップ4.1、4.2、および5)。</td></tr><tr><td>40X/1.3オイル対物レンズと20X/0.3空気対物レンズ(または同等の代替品)を装備したZeiss Observer.Z1倒立顕微鏡</td><td></td> 位相<td>コントラストまたは蛍光照明(ステップ4および5)でD. discoideum細胞を画像化するために使用されます40</td>&times;/1.25&ndash;<td></td></tr><tr><td>0.75 オイル対物レンズ (または同等の代替品)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>D. discoideum 細胞の画像化に使用される代替品 (ステップ 4.1.4)</td></tr><tr><td>FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247、または同等の代替品) with Eppendorf InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021D and 5192000027</td><td>マイクロピペットでD. discoideum細胞に機械的刺激を与えるために使用します(ステップ4.3)。注:カタログ番号は、機器の最新バージョン(4i)のものです。</td></tr><tr><td>マイクロピペット(フェムトチップ; 1 &mu;m外径、0.5&mu;m 内径)</td><td>エッペンドルフ</td><td>930000035</td><td>マイクロピペットでD. discoideum細胞に機械的刺激を与えるために使用(ステップ4.3)</td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ(Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>マイクロピペット(femtotip)にバッファーを充填するために使用(ステップ4.3.1)</td></tr><tr><td>1ウェルチャンバー(Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td><td>フィッシャー</td><td>12-565-472</td><td>マイクロピペットによる機械的刺激のためのD. discoideum細胞のプレートに使用します(ステップ4.3.2)</td></tr><tr><td>8ウェルチャンバー(Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>バルクバッファー添加による機械的刺激のためのD. discoideum細胞のプレートに使用します(ステップ4.4.1)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis Software(フィジー)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>機械的刺激に対する反応を定量化するために使用(ステップ4.5)</td></tr><tr><td>移行解析ソフトウェア(Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td> <td>細胞の速度と持続性を定量化するために使用(ステップ5.4)</td></tr></tbody></table>

キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

走化性、または、走化性因子のグラデーションを移行は、指示移行の最高の理解できるモードです。社会的なアメーバを用いた研究キイロタマホコリカビは並列経路の複雑なシグナル伝達ネットワーク走化性因子への応答を増幅し、偏ったアクチンの重合との仮足の突起が生じることを明らかにした、グラデーションの方向。対照的に、作用するせん断流れまたは電界への暴露による指示の移行などの他の種類の運転機構は知られていません。走化性の多くのレギュレータはローカリゼーションまたはグローバル刺激、走化性因子の活性化に一時的な変更を表示し同様、リーディング エッジまたは遅れエッジ移行細胞の局在を示します。指示移行の他の種類の分子機構を理解するには、せん断流れに (2-5 s) の簡単な露出に基づく急性の機械的刺激に対する細胞応答の検討を可能にする方法を開発しました。この刺激は、個々 のセルの動作を調べるバイオ センサーの蛍光標識を発現する細胞をイメージしながら、チャネルで配信できます。さらに、溶解し, プレートとエスディーエス興味の蛋白質のアクティブなバージョンを認識する抗体を使用してセル人口を刺激できます。両測定法を組み合わせることによって 1 つは変化細胞内局在および/またはリン酸化によって活性化分子の広い配列を調べることができます。このメソッドを使用して急性の機械的刺激が走化性シグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワークの活性化を引き起こすことを求めました。急性の機械的刺激に対する細胞応答を調べる機能せん断流動誘起運動に必要な開始のイベントを理解するために重要です。このアプローチは、走化性因子受容体の交絡影響なし走化性シグナル伝達ネットワークを勉強するためのツールを提供します。

急性の機械的刺激に対する走化性の規制当局の時間応答
D. キイロタマホコリカビ細胞の機械的刺激に対する反応を評価するために付着凝集有能なセルはせん断流れの短いパルスにさらされました。集計主務+ キイロタマホコリカビ細胞分泌するキャンプは、隣接する細胞で感知することができます。細胞シグナリングの貢献を克服するために細胞は、カフェイン、 d. 菌のアデニル酸シクラーゼを抑制し、キャンプ分泌28を防止することと扱われました。確かに、セルと前処理をカフェイン PKBR1 および ERK2 の非常に低い基底活性を持っていた、これらのキナーゼ (図 1 a) せん断流 5 秒刺激の重要な残基のリン酸化の強力な増加を示した。応答一時的なされ、ピークの周り 10-15 s、PKBR1 と 30 前後、ERK2 の ...

ここで我々 は急性の機械的刺激に対する細胞応答を評価するための方法を説明します。顕微鏡ベースのアッセイでは、蛍光標識したバイオ センサー シアー流を含む簡単な刺激の局在を調べる。我々 はまた、生化学的急性の機械的刺激に対する応答の興味の様々 な蛋白質の活性化をテストします。

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

この手順の全体的な目標は、短時間の機械的摂動後の細胞内シグナル伝達ネットワークのさまざまなコンポーネントの活性を調べることです。この方法は、細胞がどのようにして機械的刺激を含む多様な環境手がかりを感知し、方向に移動するかなど、細胞移動の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、運動性または極性が応答に交絡して寄与することなく、機械的刺激に対する初期応答を調査できることです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、わずかな攪拌で送達された化学誘引物質に対する接着細胞の応答をテストしたときに、ビヒクル制御で刺激された細胞の強力な応答に気づきました。まず、凍結ストックから少数の細胞を抗生物質なしでHL5培地に接種してクレブシエラエアロゲネスを調製し、培養物を一晩インキュベートします。Klebsiella aerogenes細菌の存在下でのDictyosteliumの増殖は、マクロピノソームの数を減らし、外部刺激に対する細胞の応答性を改善します。バクテリアの準備ができたときに、Dictyosteliumが指数関数的に成長するように実験のタイミングを計ります。これらのDictyostelium細胞を採取し、血球計算盤を使用してカウントします。次に、100, 000個のDictyostelium細胞を含む細菌懸濁液の260マイクロリットルをSMプレートに広げます。また、保険のために、Dictyostelium細胞の数が2倍と半分のプレートを準備します。室温で1日成長した後、プレートを反転させ、Dictyostelium細胞が細菌の芝生を片付け始めるが、まだ凝集し始めていないまでプレートの培養を続けます。次に、5ミリリットルのDBバッファーをプレートに加え、ガラススプレッダーを使用してDictyosteliumをこすり落とします。細胞と溶液を50ミリリットルのポリプロピレンチューブに移し、次にプレートをさらに5ミリリットルのDBですすぎ、これを50ミリリットルのチューブに加えます。必要に応じて繰り返します。Dictyosteliumを洗浄するには、チューブにDBを最大50ミリリットルまで補充し、細胞をペレット化してから、上清を吸引して廃棄します。上清が透明になるまで細胞を繰り返し洗浄します。最後に、DBバッファー中のDictyosteliumを1ミリリットルあたり約500万個の細胞に再懸濁します。まず、200万個の凝集能力を持つDictyosteliumを35mmの皿に2ミリリットルのDBを盛り付けます。各時点ごとに1つのプレートと非刺激制御を準備します。室温で、細胞をプレートに10分間付着させます。次に、1ミリリットルのDBで2回のすすぎを使用して、付着していない細胞をプレートから洗い流します。プレートから未付着のDictyosteliumが除去されたら、プレートを乱さずに、付着した細胞をベーソレーションバッファーで30分間インキュベートします。細胞の早期刺激を防ぐために、30分間のインキュベーション中にプレートの動きを避けることが非常に重要です。次に、制御された量の機械的刺激を加えるには、プレートを個別にオービタルシェーカーに移し、シェーカーを150rpmで5秒間運転します。次に、所望の時間が経過したら、バッファーを吸引し、すぐにプレートを氷の上に置きます。すぐにプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含む100マイクロリットルのサンプルバッファーを加え、細胞をこすり落とします。ライセートを1.5ミリリットルのチューブに集め、すぐに摂氏95度で10分間加熱します。ライセートの分析を続行するか、摂氏マイナス20度に移して保存します。栄養細胞または凝集コンピテントセルの懸濁液を作成した後、約600マイクロリットルをマイクロ流体チャンバースライドにロードします。インレットは完全に充填されている必要があるため、必要に応じてバッファーを補充します。セルを 10 分間アタッチします。デバイスの入力ラインを15ミリリットルのリザーバーを備えた電子ポンプに接続します。ポンプのソフトウェア制御を使用して、バルブを閉じてから、リザーバーにDBを充填します。次に、圧力を50ミリバールに設定し、ポンプをオンにします。DBでラインを充填してすすぎ、バルブをクリックして開きます。約30秒間すすぎた後、圧力をゼロに戻し、バルブを閉じます。次に、スライドの片側にある3つのインレットのいずれかにラインを接続します。気泡を閉じ込めず、接続が確立されたら、スライドのその側にある他の2つの入口を覆います。次に、ドレンからのラインをスライドの反対側にある単一の出口に接続してセットアップを完了します。次に、蛍光顕微鏡の明視野照明または位相照明下で、20倍対物レンズでチャンネルを観察し、チャンネルをすすぎます。次に、圧力を約50ミリバールに設定し、バルブを開きます。ドレンから液体が出てきたら、外圧をゼロにし、約30秒待ってからバルブを閉じます。次に、40Xオイル対物レンズに切り替え、チャネルの最も広い部分に焦点を合わせ、RFPまたはGFP照明で3秒ごとに画像を収集するようにソフトウェアを準備します。バルブを閉じた状態で、圧力を希望の値に設定します。次に、3秒間隔で5つの事前刺激画像を取得します。次に、バルブを短く開いて刺激を与えます。次に、45 秒間で少なくとも 15 フレームのデータを収集します。テキストプロトコルで説明されているように、応答を定量化します。まず、前のセクションで説明したように、マイクロ流体スライドにDictyosteliumをロードします。この実験では、2つの入力ラインを準備します。ラインを閉じるには、処理液を運ぶラインとソフトウェア制御のバルブに物理的なクランプを使用して、DB液を運ぶラインを車両で閉じます。次に、2つのラインに適切な溶液、バッファーとビヒクルのみ、または阻害剤などの処理を施したバッファーを充填します。ラインをすすぎたら、スライドの側面にある2つのインレットにラインをチャネルで接続し、未使用のインレットにキャップをします。次に、ドレンラインを反対側のコンセントに接続します。次に、前述のようにバッファープラスビヒクルを使用してスライドを洗浄します。次に、チャネルを治療で満たします。まず、流れをゼロミリバールに減らします。次に、バルブを切り替え、約15秒間処理を流し、インキュベーションのタイミングを計ります。約10分ごとに、新鮮な処理溶液を細胞上に約15秒間流し、チャンバー内の酸素レベルを補充します。接着凝集コンピテントセルを、オービタルシェーカーを使用して5秒間のせん断流に曝露しました。Dictyosteliumは、基礎活性を低下させるためにカフェインで前処理されました。その結果、PKBR1およびERK2の基礎活性は非常に低く、刺激によるこれらのキナーゼの主要残基のリン酸化の大幅な増加が見られました。さまざまな蛍光標識バイオセンサーを発現する凝集コンピテントセルでは、PIP3または新たに重合したアクチンによってリクルートされる2つのリーディングエッジマーカーであるPHcracとLimEの両方が、休止細胞で主に細胞質に局在することを示しました。5秒間のせん断流の後、これらのバイオセンサーは急速に皮質に再局在し、サイトゾルに戻りました。アクチン解重合薬ラトランキュリンAの効果は、同様のせん断力実験を用いて試験された。この場合、栄養細胞は最初に制御条件に曝露され、次に所望の試験剤を含む緩衝液に切り替えられた。ラトランクリンA処理は、前縁マーカーの皮質への再局在をブロックしました。興味深いことに、フローが2秒後に停止されず、実験期間中はオンのままであった場合でも、一時的なグローバル応答が観察されました。全体的な応答に続いて、栄養細胞は流れに逆らって移動しました。これらのアッセイを成功させるには、細胞の適切な調製が非常に重要です。栄養細胞は、機械的刺激に対する応答性を確保するために、細菌と関連して増殖させる必要があります。凝集コンピテントセルの場合、発達が不十分または過剰に発達している細胞は、応答が不十分になる傾向があります。生化学的アプローチと顕微鏡的アプローチは互いに補完し合うため、機械的刺激に対する応答について多数のシグナル伝達中間体を評価することができました。薬理学的摂動と遺伝的摂動を追加することで、機械的刺激がどのように知覚され、伝達されるかを学ぶことができます。これは、せん断流などの物理的刺激によって導かれる指向性細胞遊走を理解するために重要です。機械的刺激は、化学誘引物質と同じシグナル伝達ネットワークの活性化を引き起こすため、細胞へのさまざまな刺激の統合を調べることができます。最終的に、これらの研究は、私たち自身の免疫細胞や転移性がん細胞などの移動する細胞が体内をどのように移動するかを理解するのに役立ちます。

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Biology

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キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

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