ひと心筋細胞外マトリックスの in VitroとIn Vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理

この手順の全体的な目標は、心臓の細胞外マトリックスをハイドロゲルに処理することであり、これにより、さまざまな細胞ベースのアッセイでマトリックスの効果を研究することができます。この方法は、細胞外マトリックスが細胞の挙動にどのように影響するかなど、心臓領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞外マトリックスを使用してin vitroまたはin vivoで大規模な実験を行うことを容易にすることです。

この技術の応用は、マトリックスが生存に不可欠な手がかりを提供できるため、心筋梗塞の治療に拡張できます。実験を開始するには、10枚刃の滅菌メスを使用して、以前に取得した左心室心筋から脂肪組織を除去します。メスを使用して、心筋を約1 x 1 x 1 cmの立方体に切ります。

次に、キューブを滅菌済みの50mLチューブに入れます。キューブの入ったチューブは摂氏80度で保管してください。準備したキューブの入ったチューブを冷凍庫から取り出し、氷上でクライオスタットに運びます。

クライオスタットの物体温度とチャンバー温度を摂氏15度に設定します。空の50mLチューブとスタンプをチャンバー内で冷やします。コールドスタンプにクライオ切片媒体の層を追加し、白く固まるまで凍結させます。

凍結切片培地の2番目の層を追加し、心筋チューブを2番目の層に配置します。凍結切片の培地と心筋が完全に凍結していることを確認してください。次に、凍結した心筋を入れたstampをホルダーに挿入し、すべてのネジを締めます。

均一な切片面が得られるまで、組織の表面をトリミングします。凍結した心筋を自動切片で切片化し、均一な切片を確保します。1つのキューブから約30〜40のセクションをスライスできます。

切片化後、各スライスを予冷した50mLチューブにゆるく入れます。充填されたチューブを閉じて、氷の上に置きます。すべての50 mLチューブの凍結切片を1つの滅菌ビーカーに移します。

心筋スライスを含む50 mLチューブあたり50 mLの溶解液を加えます。次に、滅菌ビーカーで心筋スライスを振ってください。粗いストレーナーを通してティッシュスライスで液体を濾します。

次に、鈍いピンセットで組織スライスを新しい滅菌ビーカーに移します。心筋スライスの最初の50 mLチューブあたり、PBS中の0.5%SDSを50 mL追加します。.ビーカーを室温で100〜150rpmで6時間連続して振ってください。

振とうした後、粗いストレーナーを通してティッシュスライスで液体を濾します。鈍いピンセットを使用して、組織のスライスを新しい滅菌ビーカーに移し、50mLのPBSでスライスを3回洗浄します。次に、スライスをPBSで一晩洗い、1%ペニシリンストレプトマイシンと1%ナイスタチンで洗います。

翌日、洗浄液を取り出し、摂氏37度で予熱した1%ペニシリンストレプトマイシンと1%ナイスタチンを含む25mLのFBSを、心筋スライスの最初の50mLチューブあたりの脱細胞化スライスに加えます。.スライスを摂氏37度で3時間インキュベートし、マトリックスから残っているDNAを除去します。次に、スライスを新しい滅菌ビーカーに移し、50mLのPBSで3回洗浄します。

ECMスライスを新しい滅菌6ウェルプレートにゆるく置きます。ECMを80°Cで凍結し、凍結乾燥物で2日間凍結乾燥します。ECMスライスの粉砕には、1.4mmのセラミックビーズを含むフライスチューブを使用します。

滅菌された鈍いピンセットを使用して、凍結乾燥されたECMでチューブを緩く満たします。チューブを液体窒素でスナップ凍結します。凍結したチューブをフライス盤に挿入し、ECMを粉砕します。

期間を30秒に設定し、最大速度を調整して、デバイスを起動します。粉砕後、チューブを取り出し、液体窒素で再度スナップ冷凍します。チューブ1本あたり1mLのddH20を添加してチューブから微粒子を洗い流し、振とうして完全に可溶化します。

次に、不均一な溶液を200マイクロメートルメッシュでろ過し、50 mLチューブに入れます。チューブを液体窒素で凍結します。チューブの標準蓋を0.22マイクロメートルフィルターに交換して、粉末がチューブから流出するのを防ぎます。

チューブを凍結乾燥機に挿入し、再度凍結乾燥して洗浄ステップから水分を取り除きます。以前に調製した凍結乾燥ヒトECM粉末をペプシン溶液に溶解し、最終濃度10 mg /mLにします。.溶液をチューブあたり1 mLの容量で2 mLチューブに移します。

溶液をピペットで動かして十分に混合します。次に、チューブをシェーカーに入れ、摂氏27度で1200rpmで48時間振とうします。チューブをシェーカーから取り出し、氷または予冷したチューブホルダーの上に置きます。

冷冷10X PBSのECM溶液の1/9の容量と、冷0.1モル水酸化ナトリウムのECM溶液の1/10の容量を予冷チューブ内で混合し、氷上に置いて消化されたECM溶液を中和し、ペプシンを不活性化します。最後に、ECM溶液を中和混合物に加え、ピペッティングまたはボルテックスで完全に混合します。個々のECM成分の定量アッセイでは、SDS単独による脱細胞化と比較して、より完全なDNA除去と総コラーゲン、エラスチン、およびグリコソミノグリカンの保存が良好であることが明らかになりました。

RT-PCRは、自然分化中のマウスESCの構造心筋タンパク質、初期および後期の心筋原性転写因子、および内皮細胞表面マーカー遺伝子の発現を定量するために使用されました。cECMとの接触は、多能性幹細胞を、好ましくは心筋細胞様表現型へと駆動します。位相差光学顕微鏡は、cECMの酵素的消化を48時間行うと、より均質化されたECM溶液が得られることを示しています。

cECMハイドロゲル上でのヒト心臓線維芽細胞の生死染色は、生存率の向上を示しています。cECM微粒子とcECMハイドロゲルはどちらも、標準的な培養細胞と比較して、虚血条件下での収縮性HL-1細胞の代謝活性を高めます。このテクニックを習得すると、適切に実行されれば、組織からヒドロゲルまで1週間以内に行うことができます。

開発後、この技術は、心臓再生の分野の研究者が、in vitroおよびin vivoのモデルシステムにおける心臓細胞外マトリックスの影響を調査する道を開きました。