Name: ひと心筋細胞外マトリックスの in VitroとIn Vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶ心筋細胞外マトリックスの脱細胞化とハイドロゲル作成法。ヒト心筋組織から細胞を除去し、マイクロ粒子と細胞保護性自己組織化ハイドロゲルを調製する技術です。心筋梗塞治療への応用可能性も示されています。

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研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言に記載されている倫理原則に準拠しています。患者組織の研究目的のための使用のためのインフォームド コンセントの提供し、組織を収集するプロセスは、制度検討委員会とシャリテ ・ ベルリン Universitätsmedizin (EA4/028/12) の倫理委員会によって承認されました。

研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言に記載されている倫理原則に適合し、シャリテ医科大学施設内審査委員会および倫理委員会で承認されました。提供されるすべての患者は、実験的研究のための中心のティッシュの使用のためのインフォームド・コンセント書かれて。
1. ひと心筋の区分のための準備
<ol><li>左室心筋を取得 (サイズは、手術の種類によって異なります) 手術室と冷 PBS 滅菌コンテナー輸送から直接。</li>
	<li>無菌条件下で第 10 刃で生殖不能のメスのすべての脂肪組織を削除します。</li>
	<li>約 1 × 1 × 1 cm のメスを使用してキューブに心筋をカットします。</li>
	<li>50 mL の滅菌チューブにキューブを配置します。 メモ: 一時停止、実行ステップ 1.5、それ以外の場合、2.2 の手順に進みます。蛋白質の分解と組織の品質の低下を防ぐために繰り返し凍結融解は避けてください。</li>
	<li>-80 ° C でキューブを含むチューブを格納します。組織は、数ヶ月間保存できます。</li>
</ol>2. 心筋キューブのスライスの断面
<ol><li>冷凍庫から準備されたキューブを含む尿管を取る。</li>
	<li>クリオスタットに氷の上を転送します。</li>
	<li>-15 ° C にオブジェクトとチャンバーの温度を設定します。 注: 適切な温度は完璧な区分を保証することが重要です。</li>
	<li>チル空 50 mL チューブ、商工会議所またはドライアイスのスタンプ。</li>
	<li>レイヤーを追加 (約 0.5 - 1.0 mL) コールド スタンプ、聞かせに cryosection 媒体のそれはそれが白と固体になるまで凍結します。</li>
	<li>Cryosection 中の 2 番目の層を追加し、この層に心筋キューブを配置します。</li>
	<li>Cryosection 培地を確認し、続行する前に、心筋が完全に冷凍します。 注: サンプルと cryosection 中もフリーズしていないとき、断面損なわれます。完全に凍結 cryosection 媒体は流体と透明から固体、白い、および非透明に変わります。心筋のキューブでは、1 h 1.4 の手順からの続き場合を完全に凍結するまで、少なくとも 30 分を必要があります。組織の冷凍ピンセットで触れた/処理するときは変形する必要があります。</li>
	<li>ホルダーに冷凍心筋とスタンプを挿入してすべてのネジを締めます。</li>
	<li>でも断面の表面が得られるまでは、組織の表面をトリミングします。</li>
	<li>300 μ m の厚さの切片を設定します。</li>
	<li>冷凍の心筋のセクション自動断面を。これは均一断面を保証します。約 30-40 のセクションは、1 つのキューブからスライスすることができます。</li>
	<li>50 mL の冷却管に緩くセクショニング後各スライスを配置します。 注: を押さないでください、スライスまたはパックしっかりと。約 40 のスライスは、1 つの管に合うことができます。</li>
	<li>満たされた管を閉じて、氷の上に配置します。 注: 2.14 のステップの移動を一時停止、それ以外の場合に 3.2 の手順に進みます。</li>
	<li>心筋スライス-80 ° C で保存します。スライスは、数ヶ月間保存できます。</li>
</ol>3. ひと心筋の decellularization スライスします。
<ol><li>-80 ° C のフリーザーと氷上輸送から心筋セクションを含む 50 mL チューブの必要な数を取る。</li>
	<li>ステップ 3.1 から 1 つの滅菌ビーカーにすべての 50 の mL の管の凍結切片を転送します。約 40 のスライスは、50 mL のチューブごとビーカーに追加されます。ビーカー 50 mL チューブ; 量の 3 倍をする必要があります。例えば、 1 つの 50 mL チューブの decellularization 150 mL ビーカーを使用します。</li>
	<li>心筋スライスを 50 mL チューブあたり 50 mL 溶解ソリューション (10 mM トリス、0.1 %w/v EDTA、pH 7.4 H2O) を追加します。</li>
	<li>室温で 2 時間の連続 100 150 rpm で滅菌ビーカーに心筋スライスを振る。</li>
	<li>粗いこし器を通って組織のスライスと液体をひずみ。鈍ピンセットを持つ組織スライスを新しい滅菌ビーカーに転送します。PBS で心筋スライス (例えば、使用 100 mL SDS ソリューション心筋のセクションの 2 つの 50 mL チューブを脱がされている場合) の最初の 50 mL チューブあたり 0.5 %sds の 50 mL を追加します。</li>
	<li>室温で 100-150 rpm で 6 時間継続的に横に振る。</li>
	<li>粗いこし器を通って組織のスライスと液体をひずみ。新しい滅菌ビーカーに鈍ピンセットを持つ組織スライスを転送し、150 rpm で揺れながら 10 分を 50 mL の PBS で 3 回洗います。次に、1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 1% で PBS で一晩洗ってナイスタチン (PBS-P/S ・ N) で 100-150 rpm と揺れながら 4 ° C。 注: 徹底的に洗浄、残留の SDS を完全に削除することが重要です。SDS の残りのトレースは、ECM が細胞との組み合わせで使用される有毒です。</li>
	<li>洗濯ソリューションを削除し、25 mL を追加 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 1 %fbs (37 ° C) を予熱した心筋のスライスの最初の 50 mL チューブあたり decellularized スライスにナイスタチンです。</li>
	<li>37 ° C で 3 時間インキュベートします。この手順ですべての残りの DNA は、FBS の固有の DNase 活性によるマトリックスから削除されます。</li>
	<li>新しい滅菌ビーカーにスライスを転送し、150 rpm で揺れながら 10 分を 50 mL の PBS で 3 回洗います。 注: ECM スライスに格納できる PBS P S N 4 ° C で数日間。しかし、すぐに続行することをお勧めします。</li>
</ol>4. 粉に Decellularized cECM の処理
<ol><li>新しい滅菌 6 ウェル プレートに緩く ECM のスライスを配置します。-80 ° C で ECM を凍結し、エアカーテンで 2 日間の凍結乾燥します。 注: 1 つ以上のスライスは、ウェルあたり配置できます。井戸の表面を完全にカバーするスライスを配置します。スライスを重複しても、その後粉砕の成功には影響しません。</li>
	<li>ECM スライスの粉砕に使用特定加工チューブ (参照材料表) 含む 1.4 mm セラミック ビーズです。滅菌鈍ピンセットを使用して凍結乾燥の ECM で緩く管を埋めます。最適な結果を得るには、10-20 mg の間 ECM の総重量をお勧めします。 注:、ECM は詰めすぎて加工管の場合粉砕プロセスは否定的影響します。</li>
	<li>スナップ-凍結チューブ液体窒素。 警告:液体窒素は超低温、適切な個人用保護具を着用します。</li>
	<li>
フライス盤に冷凍のチューブを挿入し、ECM を粉砕します。
	<ol>
<li>30 の期間設定 s、最大速度、デバイスを起動します。</li>
		<li>終えた後、チューブを取り出し、再度に凍結液体窒素で。</li>
		<li>5 回繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 mL ddH2O あたりチューブと手ふれや完全な可の渦を追加することによって、チューブから微粒子を洗います。50 mL のチューブに 200 μ m メッシュで異種のソリューションをフィルター処理します。</li>
	<li>-80 ° C または液体窒素でチューブを固定します。</li>
	<li>管の標準蓋を 0.22 μ m のフィルターに置き換えます。このフィルターのふたは粉がチューブから流れ出るを防ぐ水の蒸発の空気の循環をことができます。</li>
	<li>エアカーテンでチューブを挿入、ステップ (ステップ 4.5) から水を除去するもう一度凍乾 メモ: この手順で凍結乾燥は 3 日前までにかかります。</li>
	<li>さらに処理まで-80 ° c の粉を保存または 5.1 の手順に進みます。</li>
</ol>5. cECM 微粒子の酵素による均質化
<ol><li>1 Mg/ml の濃度を 0.01 M 塩酸 (pH 2.0) 豚ペプシンを溶解します。それを完全に溶解するまで室温でシェーカーに配置します。</li>
	<li>最終濃度 10 mg/mL にペプシン溶液中凍結乾燥人間 ECM 粉末 (ステップ 4.8) で溶解します。ピペッティングを徹底的にミックスします。総容積は必要な ECM ソリューションの量に依存します。たとえば、ECM 粉末 1 mL ペプシン溶液の 10 mg を溶解します。 注: 粒子の溶解は、穏やかなボルテックス (1,000-1,500 RPM) をサポートできます。残りの微粒子の塊すると、消化に悪影響を及ぼす可能性があります。</li>
	<li>チューブあたり 1 mL の量 2 mL チューブにソリューションを転送します。</li>
	<li>48 時間は、27 ° C、1,200 rpm 管シェーカーにチューブを置きます。</li>
	<li>チューブを取り出してシェーカーと氷や予冷チューブ ホルダーの上に配置。</li>
	<li>ミックス 1/9 寒い 10 x PBS (pH 7.4) 冷たい 0.1 M の ECM ソリューションの体積の 1/10 の ECM ソリューションの量の水酸化ナトリウム冷却管と氷の上の場所。この混合物は消化の ECM ソリューションを中和し、ペプシンを不可逆的に不活化します。</li>
	<li>ECM ソリューションを追加すると、中和の混合物、ピペッティングまたはボルテックスを徹底的にミックスします。</li>
	<li>ECM を 1x PBS (pH 7.4) と目的の濃度に設定します。解決の pH は、ph 試験紙でチェックできます。 注: 10 mL で計算の例は消化 ECM ソリューションです。 HCl (pH 2.0) 10 mL に 10 mg 豚ペプシンを追加します。 100 mg ECM 粉末をペプシン ソリューションに追加します。 注: 10 mL を中和するための計算例消化 ECM ソリューションと 8 mg/mL の濃度に設定。 巻最終開始c x Vol開始=/c最終10/mL x 10 mL/8 mg/mL を = = 12.5 mL 巻10xPBS集開始=/9 = 1/9 10 mL = 1.11 ミリリットル 10 x PBS から 巻NaOH集開始=/10 = 1/10 10 mL = 1 mL から 巻1xPBS集最終- 巻開始- 巻10xPBS - 集NaOHを = = 12.5 mL ・ 10 mL ・.11 mL-1 mL = 0.39 mL</li>
</ol>

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</ol>

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目標は次を達成するために、ヒトの心筋 ECM を準備するとき: 免疫細胞の関連資料、ECM の整合性と生理、不妊、最終製品、GMP プロセス互換性の非毒性の保全の除去と処理の面で特定のアプリケーションのための製品の適合性。微粒子や自己組織化ハイドロゲルにさらなる処理と私たち 3 段 decellularization プロトコルを組み合わせて、人間の心臓の ECM 材料が得られ、特定の生物学的作用を有している、簡単な操作で可能性を秘めていると複数アプリケーション体外と体内の、何がいくつかの動物種11,13,20,21から ECM 製品に示されているよう。
心筋組織の初期処理中に、化合物の濃度と治療期間が 300 μ m のスライスの滴定されているため断面と同一の厚さのスライスを心筋に重要です。...

細胞外マトリックス (ECM) だけでなく構造サポートが、生物の細胞にとっても重要ですし、組織機能1を提供します。中心部に線維化、炎症、血管新生、心筋収縮機能、生存率、および居住者の前駆細胞の運命などの病態生理学的応答の調節における ECM が参加しています。その主要なコンポーネント - 線維性糖タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン - に加えて分泌された成長因子、サイトカイン、および核酸, 蛋白質の2,の3を含む膜小胞のホストが含まれます。
最近、無細胞性 ECM 準備がだけ潜在的な治療上のセル ベースのアプリケーションにとっても、細胞マトリックスの相互作用を研究するため非常に貴重ではないこと明確ななっています。治療細胞製品、エンジニア リング組織に適切な環境を提供することの重要性が広く認められています。定義された biopolymeric ゲル4,5,6またはマウス肉腫細胞 (すなわちマトリゲル、Geltrex) から分泌されるタンパク質カクテル細胞懸濁液または活性化合物を結合する試みがなされました。7しますただし、元の生物活性を限られている、後者は GMP グレード プロセスで問題が発生、心臓 ECM (cECM)8,9,10,の組織固有活性の両方に欠ける。11,12,13。
心筋の decellularization は以前冠血管14,15を介して心臓全体の灌流によって行われています。これは動物の心で可能ですが、そのまま人間の心はほとんどあります。したがって、手術で得られた組織のサンプルを処理することができます浸漬プロセスが支持されました。私たちの「3 ステップ」プロトコルは、別の 3 を含んでいるインキュベーション手順すなわち溶解、可溶化、および DNA 除去。それは主に保存されタンパク質とグリコサミノグリカンの構成16,17ヒト心筋 ECM を得られます。これらの cECM スライス体外細胞マトリックスの相互作用の研究を可能にするが、悪い潜在的な人間のスケールの治療への応用に適しています。製造工程、凍結乾燥 cECM 微粒子または cECM ハイドロゲル18生成に延長されました。
このプロトコルは、心筋細胞外マトリックス (ECM) とその生物学的活性の主要なコンポーネントを維持、手術標本から得られるひと心筋の decellularization を使用できます。保存された組織固有の生物活性を持つヒトの心臓 ECM が細胞マトリックスの相互作用に関する実験的研究に必要な場合、または細胞を用いた心筋再生のアプローチに適した環境が必要な場合は、このプロトコルをお勧めします。原則として、処理された cECM の使用は、実現可能な将来の治療への応用をする必要がありますにも GMP グレードの条件このプロトコルに適応する可能です。

<table><tbody><tr><td>Balance</td><td>DR Precisa, Dietikon, Switzerland</td><td>Precisa XR 205SM</td><td></td></tr><tr><td>Blades Nr.10 Skalpell Nr.3</td><td>InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany</td><td>SK-10-004</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plates (6-well)</td><td>Greiner, Frickenhausen, Germany</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat CM</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>3050S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth, Karlsruhe,ドイツ</td><td>8043.3</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ反応チューブ (1.5 または 2 ml)</td><td>Greiner, Frickenhausen, Germany</td><td>616201, 623201</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15ml, 50ml</td><td>Greiner, Frickenhausen, Germany</td><td>188271, 227270</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biochrome, Berlin, Germany</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>Freeze Dry System</td><td>Labconco, Kansas City, USA</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>冷凍庫 (-80°C;C)</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Forma 900 Series</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>281.1</td><td></td></tr><tr><td>Microtome Blades Type 819</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>Minilys Homogeniser</td><td>PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany</td><td>91-PCSM</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>K021.1</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td><td>P06-07800</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>P6887-1G</td><td></td></tr><tr><td>Precellys Keramik-Kit 1.4 mm</td><td>Peqlab Biotechnolgie,エアランゲン、ドイツ</td><td>91-PCS-CK14</td><td></td></tr><tr><td>Rotamax 120 プレートシェーカー</td><td>ハイドルフ、シュヴァーバッハ、ドイツ</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>カール・ロート、カールスルーエ、ドイツ</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ、ヴェッツラー、ドイツ</td><td>M125</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP、0,22 & マイクロ;m</td><td>メルクミリポア、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>スチュアートアナログロッカー&ローラーミキサー</td><td>シグマアルドリッチ、タウフキルヒェン、ドイツ</td><td>Z675113-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.Tコンパウンド</td><td>ハルテンシュタイン、ヴュルツブルク、ドイツ</td><td>TTEK</td><td></td></tr><tr><td>輸血セット200&micro;m</td><td>Sarstedt, N&uuml;mbrecht, Germany</td><td>798.200.500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>5429.3</td><td></td></tr><tr><td>vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm</td><td>Medical Highlights, Rohrdorf, Germany</td><td>CV102-003</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie2</td><td>Scientific Industry, New York, USA</td><td>SI-0256</td><td></td></tr></tbody></table>

ひと心筋細胞外マトリックスの in vitroとin vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

無細胞性細胞外マトリックス製剤は細胞マトリックスの相互作用を研究するために役立ち、再生細胞療法の適用を容易にします。ゲルまたは膜として商業細胞外マトリックスのいくつかの製品がありますが、これらは組織固有の生物学的活性を持っていません。灌流 decellularization は通常は人間の心臓組織で可能でないために、浸漬 3 段 decellularization プロセスを開発しました。手術中に調達した人間の心筋スライスは最初イオン洗剤、ドデシル硫酸と孵化によって続いて洗剤無料高浸透圧換散バッファーと扱われ、固有の DNase 活性を利用することで完了です。ウシ胎児血清。この手法による心臓の細胞外マトリックスの細胞シートで残されて線維組織のアーキテクチャと生体高分子の組成を示した心臓細胞と多能性幹に特定の環境手がかりを提供するにはセルです。心臓の細胞外マトリックス シート、さらにさらに化学修飾することがなく微粒子粉末に加工したり、短期のペプシン消化経由で自己組織化心臓細胞外マトリックス ハイドロゲルに保存生体活性。

ひと心筋の decellularization の 3 ステップのプロトコルは、ECM のキーコンポーネントと ECM の高次構造を維持しながら細胞材料のほぼ完全な除去の結果を掲載します。Decellularization 後、組織からの細胞の総除去 (図 1 a) の色の変化によって明白であります。H &amp; E とマッソン Trichrome 汚れと組織学的分析では、そのまま残留細胞 (図 1 b) の完全な欠如を明らかにしました。ECM の個々 のコンポーネントの定量的アッセイ SDS だけで (図 2 a) によって decellularization と比較してより完全な DNA 除去と総コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカンのより良い保全を明らかにしました。機能性 cECM の生物学的活性に関するエビデンスは図 2 b</stron...

このプロトコルでは、その細胞外マトリックス成分を維持しながらひと心筋の完全な decellularization について説明します。さらに微粒子と胃酸の自己組織化ハイドロゲルの生産における細胞外マトリックスの結果の処理。

ひと心筋細胞外マトリックスの in VitroとIn Vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

この手順の全体的な目標は、心臓の細胞外マトリックスをハイドロゲルに処理することであり、これにより、さまざまな細胞ベースのアッセイでマトリックスの効果を研究することができます。この方法は、細胞外マトリックスが細胞の挙動にどのように影響するかなど、心臓領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞外マトリックスを使用してin vitroまたはin vivoで大規模な実験を行うことを容易にすることです。この技術の応用は、マトリックスが生存に不可欠な手がかりを提供できるため、心筋梗塞の治療に拡張できます。実験を開始するには、10枚刃の滅菌メスを使用して、以前に取得した左心室心筋から脂肪組織を除去します。メスを使用して、心筋を約1 x 1 x 1 cmの立方体に切ります。次に、キューブを滅菌済みの50mLチューブに入れます。キューブの入ったチューブは摂氏80度で保管してください。準備したキューブの入ったチューブを冷凍庫から取り出し、氷上でクライオスタットに運びます。クライオスタットの物体温度とチャンバー温度を摂氏15度に設定します。空の50mLチューブとスタンプをチャンバー内で冷やします。コールドスタンプにクライオ切片媒体の層を追加し、白く固まるまで凍結させます。凍結切片培地の2番目の層を追加し、心筋チューブを2番目の層に配置します。凍結切片の培地と心筋が完全に凍結していることを確認してください。次に、凍結した心筋を入れたstampをホルダーに挿入し、すべてのネジを締めます。均一な切片面が得られるまで、組織の表面をトリミングします。凍結した心筋を自動切片で切片化し、均一な切片を確保します。1つのキューブから約30〜40のセクションをスライスできます。切片化後、各スライスを予冷した50mLチューブにゆるく入れます。充填されたチューブを閉じて、氷の上に置きます。すべての50 mLチューブの凍結切片を1つの滅菌ビーカーに移します。心筋スライスを含む50 mLチューブあたり50 mLの溶解液を加えます。次に、滅菌ビーカーで心筋スライスを振ってください。粗いストレーナーを通してティッシュスライスで液体を濾します。次に、鈍いピンセットで組織スライスを新しい滅菌ビーカーに移します。心筋スライスの最初の50 mLチューブあたり、PBS中の0.5%SDSを50 mL追加します。.ビーカーを室温で100〜150rpmで6時間連続して振ってください。振とうした後、粗いストレーナーを通してティッシュスライスで液体を濾します。鈍いピンセットを使用して、組織のスライスを新しい滅菌ビーカーに移し、50mLのPBSでスライスを3回洗浄します。次に、スライスをPBSで一晩洗い、1%ペニシリンストレプトマイシンと1%ナイスタチンで洗います。翌日、洗浄液を取り出し、摂氏37度で予熱した1%ペニシリンストレプトマイシンと1%ナイスタチンを含む25mLのFBSを、心筋スライスの最初の50mLチューブあたりの脱細胞化スライスに加えます。.スライスを摂氏37度で3時間インキュベートし、マトリックスから残っているDNAを除去します。次に、スライスを新しい滅菌ビーカーに移し、50mLのPBSで3回洗浄します。ECMスライスを新しい滅菌6ウェルプレートにゆるく置きます。ECMを80°Cで凍結し、凍結乾燥物で2日間凍結乾燥します。ECMスライスの粉砕には、1.4mmのセラミックビーズを含むフライスチューブを使用します。滅菌された鈍いピンセットを使用して、凍結乾燥されたECMでチューブを緩く満たします。チューブを液体窒素でスナップ凍結します。凍結したチューブをフライス盤に挿入し、ECMを粉砕します。期間を30秒に設定し、最大速度を調整して、デバイスを起動します。粉砕後、チューブを取り出し、液体窒素で再度スナップ冷凍します。チューブ1本あたり1mLのddH20を添加してチューブから微粒子を洗い流し、振とうして完全に可溶化します。次に、不均一な溶液を200マイクロメートルメッシュでろ過し、50 mLチューブに入れます。チューブを液体窒素で凍結します。チューブの標準蓋を0.22マイクロメートルフィルターに交換して、粉末がチューブから流出するのを防ぎます。チューブを凍結乾燥機に挿入し、再度凍結乾燥して洗浄ステップから水分を取り除きます。以前に調製した凍結乾燥ヒトECM粉末をペプシン溶液に溶解し、最終濃度10 mg /mLにします。.溶液をチューブあたり1 mLの容量で2 mLチューブに移します。溶液をピペットで動かして十分に混合します。次に、チューブをシェーカーに入れ、摂氏27度で1200rpmで48時間振とうします。チューブをシェーカーから取り出し、氷または予冷したチューブホルダーの上に置きます。冷冷10X PBSのECM溶液の1/9の容量と、冷0.1モル水酸化ナトリウムのECM溶液の1/10の容量を予冷チューブ内で混合し、氷上に置いて消化されたECM溶液を中和し、ペプシンを不活性化します。最後に、ECM溶液を中和混合物に加え、ピペッティングまたはボルテックスで完全に混合します。個々のECM成分の定量アッセイでは、SDS単独による脱細胞化と比較して、より完全なDNA除去と総コラーゲン、エラスチン、およびグリコソミノグリカンの保存が良好であることが明らかになりました。RT-PCRは、自然分化中のマウスESCの構造心筋タンパク質、初期および後期の心筋原性転写因子、および内皮細胞表面マーカー遺伝子の発現を定量するために使用されました。cECMとの接触は、多能性幹細胞を、好ましくは心筋細胞様表現型へと駆動します。位相差光学顕微鏡は、cECMの酵素的消化を48時間行うと、より均質化されたECM溶液が得られることを示しています。cECMハイドロゲル上でのヒト心臓線維芽細胞の生死染色は、生存率の向上を示しています。cECM微粒子とcECMハイドロゲルはどちらも、標準的な培養細胞と比較して、虚血条件下での収縮性HL-1細胞の代謝活性を高めます。このテクニックを習得すると、適切に実行されれば、組織からヒドロゲルまで1週間以内に行うことができます。開発後、この技術は、心臓再生の分野の研究者が、in vitroおよびin vivoのモデルシステムにおける心臓細胞外マトリックスの影響を調査する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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逆方向に加圧ポーチ内全体の人間の心の decellularization

本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞由来の心血管細胞を含むメッシュ状の人工心臓組織を生成し、心臓病の細胞移植療法の調査を可能にする。...

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マウスモデルにおける心筋梗塞後のMSC負荷注入性ヒドロゲルの筋内移植

このプロトコルの目的は、生体整血、コラーゲンベースのヒドロゲル、心臓組織工学、薬物スクリーニング、および疾患モデリングにおける応用のために、心臓線維芽細胞(CF)と共培養された幹細胞由来心筋細胞で構成される、高度に整列したヒト心臓組織の三次元(3D)微小流体モデルの開発を説明し、実証することである。...

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

ここでは、ハイスループットの多次元フォーマットで培養されたヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの心臓スフェロイド(CS)の生成と凍結保存のための一連のプロトコルを紹介します。この3次元モデルは、疾患モデリング、ハイスループットスクリーニングのための堅牢なプラットフォームとして機能し、凍結保存後もその機能を維持します。...

ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

成人のヒト心臓から単離された線維芽細胞をゼラチンでコーティングした皿の上でコンフルエントに培養し、心筋特異的な細胞外マトリックスを作製した。脱細胞化後、この基質は他の心臓細胞や細胞-マトリックス相互作用の培養や研究に使用できます。...

培養ディッシュコーティングのための成体ヒト線維芽細胞からの心臓細胞外マトリックスの作製

メルトエレクトロスピニングライティング(MEW)、ポリカプロラクトン(PCL)スキャフォールド、フィブリンハイドロゲルをhiPSC由来の心筋細胞および線維芽細胞と組み合わせた3D心筋組織を作製するための再現性の高い方法を紹介します。この手法は、スキャフォールドアーキテクチャを正確に制御し、前臨床薬物試験や心疾患モデリングに適用できます。...

ポリカプロラクトン足場およびhiPSC由来心細胞の溶融エレクトロスピニングライティングを用いたヒト心筋組織作製

学ぶ心筋細胞外マトリックスの脱細胞化とハイドロゲル作成法。ヒト心筋組織から細胞を除去し、マイクロ粒子と細胞保護性自己組織化ハイドロゲルを調製する技術です。心筋梗塞治療への応用可能性も示されています。

ひと心筋細胞外マトリックスの in VitroとIn Vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理

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