ひと線維芽細胞の増殖静止ゲノムワイドな転写減衰率を決定します。
2018年1月2日
転写減衰率を監視および差動腐食の遺伝子を識別する生成する増殖の静止プライマリひと真皮線維芽細胞、プロトコルについて述べる。
この手順の全体的な目標は、増殖性および静止期の線維芽細胞における転写産物の崩壊速度を監視することです。この方法は、遺伝子発現の変化が転写産物の崩壊速度の変化に起因するかどうかなど、分子生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、転写産物の存在量だけでなく、転写産物の崩壊速度に関する情報を提供することです。
プロトコールを開始するには、線維芽細胞の増殖性および静止性の培養を確立します。増殖する線維芽細胞は定期的にトリプシンする必要があります。.静止培養は、プレートが定期的な培地交換で合流点に達するようにすることで確立できます。
すべての生物学的複製細胞培養プレートについて、予熱した培地10ミリリットルにActD 150マイクロリットルを添加します。媒体1ミリリットルあたり15マイクログラムの濃度でActDを添加します。溶液をよく混ぜます。
古い培地を吸引し、ActDを含む培地を細胞に加えます。ゼロ点サンプルを採取するには、ActD培地から5〜10ミリリットルの予熱PBSを100ミリメートルプレート、100ミリメートルプレートの場合は5ミリリットルの溶液、6ウェルプレートのウェルの場合は2ミリリットル、12ウェルプレートのウェルの場合は1ミリリットルを、ActD培地から静かに吸引し、ピペットで分注します。PBSをやさしく吸引します。
次に、フェノールグアニジンイソチオシアネート溶液を組織培養プレートに直接加えます。フェノールグアニジンイソチオシアネート溶液細胞混合物を数回上下にピペットで動かし、均質な混合物を作ります。各時点は、前述の方法を使用して、適切な時間が経過した後に収集します。
サンプルを室温で5分間インキュベートし、RNAタンパク質複合体が完全に溶解することを確認します。次に、使用した方法論で検出できるスパイクイン制御転写産物を導入します。これらのコントロールを既知の量と濃度で各サンプルに導入します。
ピペットを使用して、フェニルグアニジンイソチオシアネート溶液混合物を2.0ミリリットルの微量遠心チューブに移します。次に、使用するフェニルグアニジンイソチオシアネート溶液1ミリリットルごとに、フェニルグアニジンイソチオシアネート溶液混合物に0.2ミリリットルのクロロホルムを追加します。微量遠心チューブを15秒間激しく振とうし、次にクロロホルムフェニルグアニジンイソチオシアネートをインキュベー
トします。インキュベーション後、サンプルを12, 000倍gで摂氏4度で20分間回転させます。サンプルは3つの層に分離する必要があります。マイクロピペットを使用して水層を新しい2.0ミリリットルの微量遠心チューブに移し、このプロセス中に間相を乱さないように注意してください。
間相画分と有機画分を破棄します。次に、等量の2-プロパノールを水性画分に加え、チューブを10回反転させます。特に収率が低いと予想される場合は、サンプル20マイクロリットルあたり20ミリグラム/ミリグラムの水性グリコーゲンを1マイクロリットルまで追加します。
サンプルを室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを回転させます。スピンの終わりに、RNAが沈殿してチューブの底にしばらくの間ペレットを形成していることを確認します。
ピペットで、白いRNAペレットを乱さないように特別な注意を払いながら、上清を取り出して捨てます。ペレットを洗浄するために、フェニルグアニジンイソチオシアネート溶液試薬1ミリリットルあたり75%エタノール1ミリリットルを加えます。サンプルを 12, 000 倍 g で 10 分間回転させます。
上清の大部分を取り除いた後、ピペットを使用してできるだけ多くのエタノールを除去しますが、ペレットを乱さないでください。サンプルを回転させて、余分なエタノールをすべてペレット化します。このステップでは、RNAペレットはコンパクトではなく、移動する傾向があります。
スピン後、ペレットを乱さずにチューブから余分なエタノールをすべて取り除きます。RNAペレットを5分間風乾させます。RNAペレットに50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加え、ペレットをヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。
1マイクロリットルのDeanaseのサンプルを処理してDNAを除去し、次にDeanaseと陽イオンを不活性化します。RNAサンプルは、マイナス80°Cの2.0ミリリットルの微量遠心チューブに保管します。RNAを定量し、分光光度計を使用してRNAの純度を確認します。
純度を確認した後、1%アガロースゲルでRNAを分析し、分解の広がりを視覚化します。18Sと28SのrRNAを表す2つの明確なバンドがはっきりと見えるはずです。これらのバンドが見えない場合、RNAが分解されている可能性があります。
次に、Real-Time qPCR を使用して、スパイクインされた内部標準と比較して、RNA の収集アリコート中の転写産物の存在量をモニターします。マイクロアレイ、RNAシーケンシング、またはノーザンブロットも使用できます。経時的な蛍光強度は、遺伝子発現に対応します。
線維芽細胞は接触阻害されますが、創傷治癒中に沈着した細胞外マトリックスを作成するための非常に重要な遺伝子である転写産物をコードするコラーゲン3A1は、より安定し、急速に崩壊しません。フェノールの取り扱いは非常に危険であり、肌に触れないようにすることが重要であることを忘れないでください。このビデオを見れば、増殖性線維芽細胞と静止性線維芽細胞の転写産物の崩壊速度をモニタリングする方法を十分に理解できるはずです。
転写産物の崩壊速度の変化は、遺伝子の三角測量の重要なメカニズムであり得る。
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概要
この記事では、増殖および静止期の初代ヒト真皮線維芽細胞を生成するためのプロトコルを説明します。転写物減少率のモニタリングと、減少率が異なる遺伝子の同定に焦点を当て、遺伝子発現のダイナミクスについての洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 分子生物学
- 細胞生物学
- 遺伝子発現
背景
- 転写物減少率の理解は遺伝子発現制御の解明に不可欠です。
- 線維芽細胞はヒト組織における細胞プロセスのモデルとして機能します。
- 線維芽細胞の増殖状態と静止状態は遺伝子発現の結果に影響を与える可能性があります。
- このプロトコルは転写物の減少による影響と単なる転写物の存在量による影響を区別することを目的としています。
研究の目的
- 線維芽細胞培養の異なる状態における転写物減少率をモニタリングすること。
- 遺伝子発現の変化が転写物減少率とどのように関連しているかを調査すること。
- 線維芽細胞における遺伝子発現のダイナミクスを研究するための信頼性の高い方法を提供すること。
使用された方法
- 増殖および静止期の線維芽細胞培養の確立。
- 増殖している線維芽細胞の定期的なトリプシン処理。
- 中間液の変更による接合率ベースの静止期培養の確立。
- 実験プロトコルを通じた転写物減少率のモニタリング。
主な結果
- 増殖状態と静止状態の間で減少率が異なる遺伝子の同定。
- 転写物減少と遺伝子発現の変化の関係についての洞察。
- 転写物減少率を測定することの利点の実証。
- 分子生物学における将来の研究のための詳細なプロトコルの提供。
結論
- このプロトコルは転写物の存在量と減少率を効果的に区別します。
- 結果は遺伝子発現制御のより深い理解に貢献します。
- この方法は分子生物学および細胞生物学のさまざまな研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Genome-wide measurement of transcript decay rates in proliferating and quiescent human fibroblasts enables biopharma teams to distinguish regulatory mechanisms driving gene expression changes beyond transcriptional control. This approach supports mechanistic de-risking and enhances predictive confidence in target validation by clarifying whether observed gene expression differences are due to altered mRNA stability or transcriptional activity. Integrating transcript decay profiling at early discovery inflection points informs portfolio triage and prioritization of disease-relevant targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression regulation by separating transcriptional and post-transcriptional effects.
- Supports functional target validation by identifying genes with altered mRNA stability in disease-relevant states.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the contribution of transcript decay to phenotype.
- Improves predictive confidence for advancing targets with robust regulatory profiles.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological systems for downstream transcriptomic and functional assays.
- Provides quantitative decay rate measurements for assay standardization and reproducibility.
- Enables screening of compounds or genetic perturbations affecting mRNA stability.
- Supports platform reuse for comparative studies across cell states or conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcript decay signatures with disease-relevant cellular states for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by tracking regulatory mechanisms.
- De-risks advancement decisions by confirming mechanistic relevance of candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, providing a reusable capability for transcriptomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating transcript decay as a regulatory variable.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative decay rate outputs for assay development.
- Analytics: Enables statistical comparison of decay rates between proliferating and quiescent states.
- Translational Research: Connects decay rate changes to disease-relevant cellular phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized workflow adaptable to diverse cell models and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Provides standardized, reproducible, and scalable transcript decay measurements.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying regulatory mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated regulatory profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, RNA extraction, and quantitative transcript analysis.
- Needs access to instrumentation for qPCR, microarray, or RNA sequencing.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample handling and time-point collection.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for different biological systems.
- Limited by Actinomycin D toxicity, restricting the time course for decay measurement.
