ひと線維芽細胞の増殖静止ゲノムワイドな転写減衰率を決定します。
2018年1月2日
転写減衰率を監視および差動腐食の遺伝子を識別する生成する増殖の静止プライマリひと真皮線維芽細胞、プロトコルについて述べる。
この手順の全体的な目標は、増殖性および静止期の線維芽細胞における転写産物の崩壊速度を監視することです。この方法は、遺伝子発現の変化が転写産物の崩壊速度の変化に起因するかどうかなど、分子生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、転写産物の存在量だけでなく、転写産物の崩壊速度に関する情報を提供することです。
プロトコールを開始するには、線維芽細胞の増殖性および静止性の培養を確立します。増殖する線維芽細胞は定期的にトリプシンする必要があります。.静止培養は、プレートが定期的な培地交換で合流点に達するようにすることで確立できます。
すべての生物学的複製細胞培養プレートについて、予熱した培地10ミリリットルにActD 150マイクロリットルを添加します。媒体1ミリリットルあたり15マイクログラムの濃度でActDを添加します。溶液をよく混ぜます。
古い培地を吸引し、ActDを含む培地を細胞に加えます。ゼロ点サンプルを採取するには、ActD培地から5〜10ミリリットルの予熱PBSを100ミリメートルプレート、100ミリメートルプレートの場合は5ミリリットルの溶液、6ウェルプレートのウェルの場合は2ミリリットル、12ウェルプレートのウェルの場合は1ミリリットルを、ActD培地から静かに吸引し、ピペットで分注します。PBSをやさしく吸引します。
次に、フェノールグアニジンイソチオシアネート溶液を組織培養プレートに直接加えます。フェノールグアニジンイソチオシアネート溶液細胞混合物を数回上下にピペットで動かし、均質な混合物を作ります。各時点は、前述の方法を使用して、適切な時間が経過した後に収集します。
サンプルを室温で5分間インキュベートし、RNAタンパク質複合体が完全に溶解することを確認します。次に、使用した方法論で検出できるスパイクイン制御転写産物を導入します。これらのコントロールを既知の量と濃度で各サンプルに導入します。
ピペットを使用して、フェニルグアニジンイソチオシアネート溶液混合物を2.0ミリリットルの微量遠心チューブに移します。次に、使用するフェニルグアニジンイソチオシアネート溶液1ミリリットルごとに、フェニルグアニジンイソチオシアネート溶液混合物に0.2ミリリットルのクロロホルムを追加します。微量遠心チューブを15秒間激しく振とうし、次にクロロホルムフェニルグアニジンイソチオシアネートをインキュベー
トします。インキュベーション後、サンプルを12, 000倍gで摂氏4度で20分間回転させます。サンプルは3つの層に分離する必要があります。マイクロピペットを使用して水層を新しい2.0ミリリットルの微量遠心チューブに移し、このプロセス中に間相を乱さないように注意してください。
間相画分と有機画分を破棄します。次に、等量の2-プロパノールを水性画分に加え、チューブを10回反転させます。特に収率が低いと予想される場合は、サンプル20マイクロリットルあたり20ミリグラム/ミリグラムの水性グリコーゲンを1マイクロリットルまで追加します。
サンプルを室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを回転させます。スピンの終わりに、RNAが沈殿してチューブの底にしばらくの間ペレットを形成していることを確認します。
ピペットで、白いRNAペレットを乱さないように特別な注意を払いながら、上清を取り出して捨てます。ペレットを洗浄するために、フェニルグアニジンイソチオシアネート溶液試薬1ミリリットルあたり75%エタノール1ミリリットルを加えます。サンプルを 12, 000 倍 g で 10 分間回転させます。
上清の大部分を取り除いた後、ピペットを使用してできるだけ多くのエタノールを除去しますが、ペレットを乱さないでください。サンプルを回転させて、余分なエタノールをすべてペレット化します。このステップでは、RNAペレットはコンパクトではなく、移動する傾向があります。
スピン後、ペレットを乱さずにチューブから余分なエタノールをすべて取り除きます。RNAペレットを5分間風乾させます。RNAペレットに50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加え、ペレットをヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。
1マイクロリットルのDeanaseのサンプルを処理してDNAを除去し、次にDeanaseと陽イオンを不活性化します。RNAサンプルは、マイナス80°Cの2.0ミリリットルの微量遠心チューブに保管します。RNAを定量し、分光光度計を使用してRNAの純度を確認します。
純度を確認した後、1%アガロースゲルでRNAを分析し、分解の広がりを視覚化します。18Sと28SのrRNAを表す2つの明確なバンドがはっきりと見えるはずです。これらのバンドが見えない場合、RNAが分解されている可能性があります。
次に、Real-Time qPCR を使用して、スパイクインされた内部標準と比較して、RNA の収集アリコート中の転写産物の存在量をモニターします。マイクロアレイ、RNAシーケンシング、またはノーザンブロットも使用できます。経時的な蛍光強度は、遺伝子発現に対応します。
線維芽細胞は接触阻害されますが、創傷治癒中に沈着した細胞外マトリックスを作成するための非常に重要な遺伝子である転写産物をコードするコラーゲン3A1は、より安定し、急速に崩壊しません。フェノールの取り扱いは非常に危険であり、肌に触れないようにすることが重要であることを忘れないでください。このビデオを見れば、増殖性線維芽細胞と静止性線維芽細胞の転写産物の崩壊速度をモニタリングする方法を十分に理解できるはずです。
転写産物の崩壊速度の変化は、遺伝子の三角測量の重要なメカニズムであり得る。
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概要
本記事では、増殖期および静止期のヒト一次真皮線維芽細胞の両方を調製するためのプロトコルについて解説します。転写物の分解速度のモニタリングと、分解速度が異なる遺伝子の同定に焦点を当て、遺伝子発現ダイナミクスに関する知見を提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 分子生物学
- 細胞生物学
- 遺伝子発現
背景
- 転写産物の分解速度を理解することは、遺伝子発現調節を解明する上で極めて重要である。
- 線維芽細胞は、ヒト組織における細胞プロセスを研究するためのモデルとして利用される。
- 線維芽細胞の増殖状態および静止状態は、遺伝子発現の結果に影響を及ぼす可能性がある。
- 本プロトコルの目的は、単なる転写産物の量的な多寡と、転写産物の分解による影響を区別することである。
研究目的
- 線維芽細胞培養の異なる状態における転写物の分解速度をモニタリングする。
- 遺伝子発現の変化が転写物の分解速度とどのように関連しているかを調査する。
- 線維芽細胞における遺伝子発現ダイナミクスを研究するための信頼性の高い手法を提供する。
使用した手法
- 増殖期および静止期の線維芽細胞培養の確立。
- 増殖期線維芽細胞の定期的なトリプシン処理。
- 培地交換を伴う、コンフルエンスに基づいた静止期培養の確立。
- 実験プロトコルによる転写物の分解速度のモニタリング。
主な結果
- 増殖状態と静止状態の間で分解速度が異なる遺伝子の特定。
- 転写物の分解と遺伝子発現の変化との関係についての知見。
- 転写物分解速度を測定することによる利点の提示。
- 分子生物学における今後の研究に向けた詳細なプロトコルの提供。
結論
- このプロトコルは、転写物の量と分解速度を効果的に区別します。
- 得られた知見は、遺伝子発現制御のより深い理解に寄与します。
- この手法は、分子生物学および細胞生物学におけるさまざまな研究に適用可能です。
よくある質問
産業界への実用的意義
増殖期および静止期のヒト線維芽細胞における転写産物分解速度のゲノムワイドな測定により、バイオファーマチームは転写制御を超えて遺伝子発現変化を駆動する調節機構を区別することが可能になります。このアプローチは、観察された遺伝子発現の差がmRNA安定性の変化によるものか、あるいは転写活性によるものかを明確にすることで、メカニズム的なリスク低減をサポートし、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させます。初期探索の転換点において転写産物分解プロファイリングを統合することで、ポートフォリオの選別や疾患関連ターゲットの優先順位付けに有用な知見が得られます。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 転写効果と転写後効果を分離することで、遺伝子発現調節の解析を可能にする。
- 疾患関連の状態においてmRNA安定性が変化している遺伝子を特定し、機能的なターゲットバリデーションを支援する。
- 転写物の分解が表現型に寄与する度合いを明確にすることで、メカニズムにおけるリスク低減を促進する。
- 強固な調節プロファイルを持つターゲットを推進させるための予測信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームのトランスクリプトーム解析および機能的アッセイに利用可能な、検証済みの生物学的システムを構築します。
- アッセイの標準化と再現性のために、定量的な分解速度の測定値を提供します。
- mRNAの安定性に影響を与える化合物や遺伝的摂動のスクリーニングを可能にします。
- 細胞の状態や条件をまたぐ比較研究において、プラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 転写産物の分解シグネチャーを疾患に関連する細胞状態と整合させ、翻訳的バイオマーカーの探索を可能にします。
- 調節メカニズムを追跡することで、探索から前臨床検証までの連続性を確保します。
- 候補ターゲットのメカニズム的な妥当性を確認することで、開発推進における意思決定のリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期の仮説検証からリード化合物の同定、そして前臨床検証に至るまでの創薬の連続的なプロセスに組み込まれ、トランスクリプトーム解析のための再利用可能な能力を提供します。
- 探索生物学：転写産物の分解を調節変数として単離することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：アッセイ開発において、再現性のある定量的な分解速度の出力を提供します。
- 分析：増殖状態と静止状態の間で分解速度の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：分解速度の変化を疾患に関連する細胞表現型に結びつけます。
- エンタープライズ再利用：多様な細胞モデルや条件に適応可能な標準化されたワークフローを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：遺伝子調節研究における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用上の価値：標準化され、再現性および拡張性のある転写物分解測定を提供します。
- 戦略的価値：調節メカニズムを明確にすることで、意思決定（go/no-go）に根拠を与え、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：調節プロファイルが検証された標的の、リスク調整後の優先順位付けおよび推進を支援します。
実施上の検討事項
- 細胞培養、RNA抽出、および定量的転写産物解析の専門知識が必要です。
- qPCR、マイクロアレイ、またはRNAシーケンシング用の機器へのアクセスが必要です。
- サンプルの取り扱いおよび採取時点について、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- さまざまな細胞型に適応可能ですが、生物学的システムに応じて最適化が必要な場合があります。
- Actinomycin Dの毒性によって制限があるため、分解測定の時間経過に制約があります。
