マンナン ペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

この実験の全体的な目標は、植物細胞壁の多糖類を特徴づけることです。この方法は、グルコマンナンの構造や量など、植物細胞壁生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、専門的なトレーニングや高価な機器を必要としないことです。

一般に、この方法に不慣れな人はゲルの解釈に苦労するため、記載されているすべてのコントロールを含めて理解することが重要です。アルコールおよび可溶性残留物、またはAIRは、テキストプロトコルに記載されているように、収穫された植物材料から予め調製されます。15ミリリットルの遠心分離管に6ミリグラムの空気を量り、水を加えて最終濃度を1ミリリットルあたり2ミリグラムにします。

渦巻きで均一なサスペンションを実現。500マイクログラムをマイクロチューブに分注します。アリコートを真空遠心分離機を使用して摂氏30度で一晩乾燥させます。

非酵素AIRコントロール用のアリコートを含むAIRを、1モルの水酸化ナトリウムで室温で1時間前処理します。1時間後、200マイクロリットルの水と20マイクロリットルの1モル塩酸を各チューブに追加して、水酸化ナトリウムを中和します。pHが約6〜7であることをテストするには、1マイクロリットルを取り出し、紙のpHインジケーターストリップにスポットします。

pH 6.0の1モル酢酸アンモニウム緩衝液を50マイクロリットル加え、各チューブに合計500マイクロリットルの水を加えます。この手順を開始するには、AIRアリコートとバッファーに所定の量のマンナナーゼを追加します。適切なネガティブコントロールとポジティブコントロールを含めます。

ボルテックスしてから短時間回転し、反応混合物をチューブの底に集めます。摂氏37度で、穏やかに攪拌しながら一晩インキュベートします。翌日、摂氏95度で20分間インキュベートして反応を停止します。

最高速度で10分間遠心分離します。上清を保存し、各ペレットを250マイクロリットルの水に再懸濁します。再度遠心分離し、上清を保持します。

両方の上清を混ぜ合わせ、摂氏30度の真空遠心分離機で約3時間乾燥させます。誘導体化手順の前に、テキストプロトコルに記載されているように必要な試薬を調製してください。0.2モルのANTSの原液を60°Cに温め、固形物を完全に溶解させます。

各サンプルに、5マイクロリットルのANTSと5マイクロリットルの2-ピコリン-ボラン、および10マイクロリットルの誘導体化バッファーを追加します。短時間回転させてチューブの底に集まり、十分に渦巻いてから、再び短時間回転します。サンプルを37°Cで一晩インキュベートし、光から保護します。

翌日、サンプルを30°Cの真空遠心分離機で約2時間乾燥させます。各サンプルをオリゴ糖標準試料と100マイクロリットルの3モル尿素に再懸濁します。マイナス20°Cで保管し、必要になるまで光から保護してください。

ゲルキャスティング装置の組み立ては、ブランドによって異なります。このデモンストレーションで使用した機器の場合、1 つのゲルは 50 ミリリットルに相当します。50ミリリットルの遠心分離管に、20.2ミリリットルの水、5ミリリットルの10x PACEバッファー、24.6ミリリットルの40%アクリルアミド/ビスアクリルアミド、200マイクロリットルのAPS、20マイクロリットルのTEMEDを混合します。

気泡が入らないように注意しながら、穏やかに反転させて混ぜます。血清学的または他の大容量ピペットを使用して、ガラスプレートの上部から約4cm下に分離ゲルを注ぎます。ゲルをイソプロピルアルコールで慎重に重ねます。

ゲルを20〜30分間重合させます。最上層を注ぎます。余分な液体を吸い取り紙で乾かします。

次に、スタッキングジェルを作ります。15ミリリットルの遠心分離管に、6.8ミリリットルの水、1ミリリットルの10x PACEバッファー、2.8ミリリットルのアクリルアミド/ビスアクリルアミド、80マイクロリットルのAPS、8マイクロリットルのTEMEDを混合します。反転させて混合し、重合した分離ゲルの上に重ねます。

コームの歯の下に気泡が閉じ込められないように、コームをそっと挿入します。ゲルが重合したら、湿ったティッシュで包み、次にラップで包み、必要になるまで摂氏4度で保存します。ローディング順序を追跡し、コームを取り外した後にウェルがどこにあるかを特定するために、油性マーカーを使用してガラス上のウェル位置にラベルを付けます。

コームを取り外します。ウェルにone-X PACEバッファーを充填します。10マイクロリットルのマイクロシリンジを使用して、2マイクロリットルの標準試料とサンプルをウェルにロードします。

サンプルの実行が不十分になりがちで、サンプル間に空のレーンを残す傾向がある最も外側のレーンの使用は避けてください。ゲルランニング装置の上部チャンバーを組み立て、one-X PACEバッファーを含む冷却されたランニングタンクにゲルを置きます。上部チャンバーにone-X PACEバッファーを充填します。

電源を入れ、ゲルを200ボルトで30分間運転します。30分後、電圧を1, 000ボルトに1時間40分増やします。ゲルを光から保護します。

まず、ゲルイメージングシステムを湿った糸くずの出ないティッシュで拭き取り、ほこりが付着していないことを確認します。PACEタンクからゲルを取り出し、ゲルがまだガラスプレートにある間に短時間観察して、色素の前面がまだゲル上にあるかどうかを確認します。ウェッジツールを使用してゲルを開き、ゲルがまだ1つのガラスプレート上にある間に、ピザカッターを使用して、染色剤の前面がまだゲル上にある場合は、スタッキングジェルとゲルの底の両方を取り除きます。

トランスイルミネーターの表面に約5ミリリットルの水を分注し、次にゲルを直接トランスイルミネーターに移します。ソフトウェアを使用して、フィルターをUV 605に設定し、長波UVトランスイルミネーターをオンにします。さまざまな露光時間で複数の画像を撮影し、蛍光の劣化を避けるために、画像と画像の間にUVライトをオフにするようにしてください。

少なくとも 2 つの画像に飽和したバンドがないことを確認します。ファイルを高解像度のTIFF画像として保存します。細胞壁マンナン含有量の標準PACEアッセイの代表的なゲルが示されています。

レーン 1、2、3 は、それぞれ 5、10、50 ピコモル濃度の市販のオリゴ糖のはしごを示しています。レーン4は、酵素と緩衝塩の存在下での酵素消化と誘導体化反応の両方に対して陽性制御として機能するこんにゃくグルコマンナンのマンナナーゼ消化を示しています。レーン5は、野生型のシロイヌナズナの茎のPACEフィンガープリントを示しています。

レーン6は、主要なステムであるマンナンシンターゼを欠くシロイヌナズナ植物の茎のPACEフィンガープリントを示しています。野生型と比較して、マンナンは少量しか存在せず、すべてのマンナナーゼ由来オリゴ糖のバンド強度が減少していることからも明らかです。レーン10は、ガラクトグルコマンナンを含み、シロイヌナズナとは明らかに異なる放出オリゴ糖のパターンを持つマツノギのPACEフィンガープリントを示しています。

レーン 7、8、9、および 11 は、分析から除外する必要があるアスタリスクでマークされた非特異的バンドを明らかにするさまざまなネガティブ コントロールです。このビデオを見た後、PACEを使用してマンナンの構造を分析する方法について非常によく理解できるはずです。この手法を習得すると、さまざまなグリコシル加水分解酵素を使用して、他の多糖類に適用できます。

この技術は、シロイヌナズナだけでなく、酵母マンナンなどの他の非植物種だけでなく、他の多くの植物種にも適用することに成功しています。