Name: マンナン ペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学ぶ マンナンPACE法による植物細胞壁多糖の構造解析。ゲル電気泳動を用いてグルコマンナンの構造と量を解析し、植物生物学研究の理解を深める効果的な手法です。

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ペース法が開発され、長年にわたってデュプリー グループ (ケンブリッジ、イギリス) の様々 なメンバーによって最適化され、我々 はすべての彼らの貢献を感謝します。支えられて米国エネルギー省、科学局、オフィスの生物学的、環境調査、契約・ デ ・ AC02 05CH11231 ローレンスの間を通して DOE の共同バイオ研究所 (http://www.jbei.org) の一部として資金が供給されたこの作品バークレー国立研究所と米国エネルギー省。我々 もありがとうテア ピックと Vy Ngo csla9サンプルの準備のヘルプ。

1 です。 植物材料の収穫 <ol><li>新鮮な植物材料 (~ 20 mg) を収穫しすぐに 96% (v/v) エタノールで水没と 70 の ° C で 30 分間インキュベート; 任意の細胞壁分解酵素の存在を非アクティブ化します。乾燥した材料、手順 2 で開始します 。
	注意: エタノールは可燃性 。
	注: 単一の幹またはロゼット葉は分析のための十分な材料を提供します。ただし、エラーの少ない発生組織の大きい量をプールし、これは重量を量りやすく処理を分析する場合</li>。
	<li>は慎重に組織型を記録し、両方によって異なります多糖類の構造と発達段階。たとえば、シロイヌナズナ (ここで使用されて) とステージ ボイズ ら の方法に従って組織 15 注: このプロトコル使用している花房内の茎の下半分、最初の silique は完全に細長い黄変しないが、</li></ol>。
 2 準備のアルコール不溶性残渣 (空気) <ol><li>モーティマー ら の方法に従って、空気の準備。 9 またはデンプンおよびショ糖などの糖を欠けている粉を作り出すために、別の同じような方法です</li>。
</ol> 3。早かったと空気前処理 注: 正確な各サンプルは、(a) (b) によりキチンオリゴ糖の平均サイズと材料に関心の多糖類の豊かさに依存するために必要な空気量GH。オリゴ糖の数は実験の感度を決定しますので、メソッドは単一蛍光分子をそれぞれオリゴ糖の還元末端に追加します。ガイドラインとしてシロイヌナズナ幹 GH5 ・ GH26 (前述)、消化でグルコマンナン 500 μ g お勧め 11 GH11 と消化されるシロイヌナズナ幹のキシラン、100 μ g モーティマーのように勧めに対し &#39; s 研究 3。 <ol><li>15 mL 遠心チューブに空気 (10-15 mg) の重量を量ると H 2 O 最終濃度 2 mg/mL のを追加します。渦もサスペンションを達成するために。これが問題になる場合は、このプロセスを支援するためにガラスのホモジナイザーを使用して。</li>。
	<li>および microfuge に分注 500 μ g チューブ。真空遠心分離機を使用して因数を乾燥 (材料の表 を参照してください) 一晩 30 ° C</li>
	<li>1 M NaOH で前治療空気 (20 μ L) 部屋の温度で 1 時間これは多糖類を脱アセチルし、うねりセルロースミクロフィブリル、バイオマス構造を崩すことや GH アクセス 。
	注: この手順は、精製された多糖類をスキップできます。注意 &#8211; 強い酸/塩基。
	<ol><li>No 酵素航空管制の因数が含まれます (手順 4.1 を除く、すべてのサンプルと同じ扱われますは除外)。</li>。
	</ol></li> <li>追加 200 μ H 2 O と 20 μ L 1 M 塩酸を中和します。テストの pH は 6 ~ 7 を 1 μ L を採取して pH インジケーター短冊にスポッティングします</li>。
	<li>追加 50 μ L 1 M アンモニウム酢酸緩衝液、pH 6.0 (またはいずれかの pH は GHs における使用のために適切) と H 2 O 500 μ L の総ボリュームを与えるにします 。
	注: 乾燥時にのこしたこと、およびサンプルを追加塩を加えないので、酢酸アンモニウムが使用されます。塩の過剰はペースのゲルの悪いバンド形と解像度につながることができます</li>。
</ol> 4。糖加水分解酵素 (GHs) が付いている空気の加水分解 注: の説明で述べたように、GHs の純度が重要です。のみを使用してクローンを表明、アフィニ ティー精製酵素です。メーカーから各ロットの受領、一晩 GH の量を増やすことによる基板 (例えば 500 μ g 空気) の定義の因数分解 (例えば 0.5、1、2、5、10、15、20 μ L) (3 単位/μ L)。GH の過剰がある、ペース指紋が同一になります。酵素の過剰は、それは加水分解反応の終点が近づいていることを特定する必要がありますので、再現性のある結果を提供する必要です。
<ol><li>追加ステップ 3.5 からバッファーに空気採取するマンナナーゼ (GH26 GH5 11) として正の前もって決定された量 (上で見なさい) コントロール (こんにゃくグルコマンナンの 30 μ g)、および no AIR 負コントロール (酵素ミックス、空管)。渦と簡単に管の下で反応混合物を収集するために、スピンします</li>。
	<li>穏やかな撹拌 (~ 100 rpm) で 37 ° C (または選択の GH の適切な温度) で一晩インキュベートします</li>。
	<li>は、95 ° C で 20 分間のインキュベーションで反応を停止 
	注: キャップの閉鎖は、フリップ トップ microfuge の管を密封する使用できます。
	<ol><li>最大速度でベンチ トップおよび microfuge を使用して、10 分間遠心し、上清を保持します</li>。
	</ol></li> <li>250 μ L H 2 O は、上記のように、遠心分離機でペレットを再懸濁します、上澄みを保持します</li>。
	<li>両方の培養上清を組み合わせるし、真空遠心分離で乾燥 (材料表 参照) 30 ° c (~ 3 h または加熱しなくても一晩).</li>
</ol> 5。オリゴ糖基準の作成 H 2 O mannopentaose (男 5)、mannotetraose (4) mannotriose (3) mannobiose (2) マンノース (男) の <ol><li>準備 1 mM 在庫ソリューション、mannohexaose (男 6)、すべて β、1-4 リンクします。因数と-20 ° c まで必要なストア</li>。
	<li>1 μ L (標準的な S1)、2 μ L (S2) を組み合わせることにより男の濃度の異なる 3 1 6 混合物を準備またはすべての六つの 5 μ L (S3).</li>
	<li>真空遠心分離で乾燥 (材料表 参照) 30 ° c (~ 1 h).</li>
</ol> 6。オリゴ糖 Derivitization <ol><li>H 2 O で 0.2 M アリ (8-Aminonaphthalene-1,3,6-トリスルホン酸) の貯蔵液の準備: 酢酸 17:3。60 ° C を完全に固体を溶解する温かみのある在庫があります。-20 ° c、2-3 か月の光から保護されたストア</li>。
	<li>は、DMSO 中 2-ピコリン ボラン (2 PB) の 0.2 M ストック溶液を調製します。吸湿性がきわめて高い、だからすぐに DMSO で受信時にすべての粉体を再懸濁します。因数と 1-2 年の-20 ° C でストア。必要 (2 週間とし、破棄のための 4 ° C でストア) として因数を解凍</li>。
	<li>H 2 O の誘導体化バッファーを準備: 酢酸酸: DMSO 17:3:20 します</li>。
	それぞれのサンプル、アリ、誘導体化バッファーの 2 PB、10 μ L の 5 μ L の 5 μ L を追加するには、<li>。チューブの底に収集するために簡単にスピン渦徹底的にして再度簡潔に回転し。反応の説明の 図 1 を参照してください</li>。
	<li>37 ° C、光から保護で一晩加温サンプル</li>。
	<li>真空遠心分離で乾燥 (材料表 参照) 30 ° c (~ 2 h).</li>
	再懸濁します <li>サンプルと 100 μ L の 3 M の尿素の標準。-20 ° c、必要になるまでの光から保護されたストア</li>。
</ol> 7。ペースの作製ゲル 注: ゲル鋳造装置のアセンブリはブランドによって異なります。ここでは、私たち use 垂直電気泳動システム スペーサー 18 × 24 cm ガラス板と 1.5 mm 装備 (材料の表 を参照してください).
<ol><li>、メーカーごとのゲル鋳造装置を組み立てる &#39; s 指示します</li>。
	次のように <li>を 10 倍ペース バッファー (1 M トリス-ホウ酸、pH 8.2): H 2 O と解散するミックスの ~ 400 mL にトリス ベースの 121.14 g を追加。固体ホウ素酸 (約 60 g) の添加により 8.2 に pH を調整し、最大 1 ボリューム ・ l ・</li>
	<li>H 2 o. 因数で 10% (w/v) アンモニウムの過硫酸 (APS) 株式を作ると-20 ° C 雪解け因数で一度保存、4 ° C で保存し、2 週間後破棄します</li>。
	<li>を作るし、解決のゲルを注ぎなさい。上記の機器を 50 mL 1 ゲルを同一視します。50 mL の遠心管 H 2 O (20.2 mL) 5 mL 10 倍ペース バッファー 24.6 mL 40% アクリルアミド/ビス-アクリルアミド (29:1 acrylamide:Bis) をミックスします。(注意: 有毒).
	<ol><li>は APS の 200 μ L と N, N, N, N´-テトラメチル-エチレンジアミン (TEMED) の 20 μ L を追加。(気泡を導入することを避けるため) にミックスを軽く反転します。血清学的を使用してゲルまたは他大量ピペット、〜 4 cm ガラス板の上端を注ぐ。気泡ゲルの中に閉じ込め取得の可能性に注意を払います。かどうか彼らは、注いで、停止、チルト/タップそれらを解放するゲル</li>。
	</ol></li> <li>イソプロパノール (注意 : 可燃性) や、慎重に、H 2 O を許可する (20-30 分) を重合し、最上位のレイヤーを離れて注ぎゲル ゲルをオーバーレイします。あぶらとり紙を使用して余分な液体洗浄 H 2 o ・ ドライで 2 倍、イソプロパノールを使用した場合です</li>。
	<li>を作るし、スタッキングのゲルを注ぎなさい。ミックス 6.8 mL H 2 O、1 mL 10 倍ペース バッファー、2.8 mL アクリルアミド/ビス-アクリルアミド (注意: 毒性)、80 μ L の AP と 15 mL 遠心管中の TEMED 8 μ L。ミックスする反転し、重合解決のゲルの上にオーバーレイします。櫛歯の下でトラップ空気の泡を避け、櫛をそっと挿入します</li>。
	(20-30 分) を重合する <li>許可するゲルは湿った組織で、プラスチック製のラップをラップし、必要になるまで 4 ° C で保存します。場所に櫛を使用してストア 。
	注: ゲル ペースに対して格納できる最大 2 週間 (1 週間以内が理想的です) が、湿った、保管される場合</li>。
</ol> 8。ペースを実行しているゲル <ol><li>永久的なマーカーを使用して、読み込み順序を追跡するのに役立つ、ガラスによく位置にラベルを付けるし、識別するのに井戸が櫛を取り外したら</li>。
	<li>は、櫛を削除します。1 x ペース バッファーで井戸を埋める</li>。
	<li>では、10 μ L, マイクロシリンジを使用して井戸に 2 μ L の標準およびサンプルを読み込みます。一番外側のレーンは、不十分なサンプルを実行する傾向があるを使用しないでください</li>。
	<li>ゲル実行装置の上部チャンバーを組み立てるし、冷却 (~ 10 ° C) 実行中戦車 (10 ° C) でジェル 1 x ペース バッファーを含みます。1 x ペース バッファーと上部チャンバーします</li>。
	<li>および有効に電源と 200 V でゲルの実行 (定数 V) 30 分、その後、増加電圧 1000 V を 1 時間 40 分。(例えば、 黒いゴミ袋のタンクをラップすること) の光からゲルを保護します 。
	注: 電圧をオンとし、別の 5 分後に 1000 V に電圧を増加した後ゲル 〜 5 分を確認します。場合は、パワーパックはバッファー リークがある可能性が高い電圧を維持することができます。タンクからゲルを削除します。慎重にすべてのガスケットの配置をチェック上部の部屋を再度連結します。ガラス板の上部の端に大規模なチップは、ガスケットに良好なシールを形成する板を防ぐことができます。これ通常一時的に解決できる上部チャンバーを追加する前に、ガラスの欠けの部分に 5% (w/v) 溶融 agarose のドロップを追加しています</li>。
</ol> 9。ペース ゲルを視覚化する 注: 長波長紫外線電球、transilluminator、蛍光体、ここ 530 nm に適しているカメラの発光フィルターを搭載したシステムをイメージング ゲルを使用します。また、レーザー スキャナーも使用できます、Goubet 2 で説明した。
<ol><li>イメージング システム ゲル湿った糸くず組織とそれを拭くことによってフリー塵であるを確認します</li>。
	<li>ペース タンクからゲルを削除し、ながらゲルはまだガラス板を簡単に表示 (&#60; 80 ms) 染料フロントがゲルでまだ判断する</li>。
	<li>ウェッジ ツールを使用してゲルを開きながら、ゲルがまだ 1 つのガラス プレート上にスタッキングのゲルの両方を削除するピザ カッターを使用し、ゲル、ゲルの底上色素の前面にある場合</li>。
	<li>は、transilluminator の表面に 〜 5 mL H 2 O を入れ、transilluminator に直接ゲルを転送します。UV 605 にフィルターを設定し、長波長 UV transilluminator をオンに (材料の表 を参照してください) ソフトウェアを使用しています 。
	注: ここで使用されるアリ fluorophore は 353/520 の励起・発光 nm</li>。
	<li>は様々 な露光時間でいくつかの画像を取る (例えば、 100 ms を 10 s)。紫外線は蛍光性の低下を避けるため (オフに) する UV ライト] ボタンをクリックして画像のオフになってことを確認します。画像の少なくとも 2 には飽和のバンド (ゲルのイメージング ソフトウェアはこれを示している) がないようにします</li>。
	<li>高 resolution.tif 画像としてファイルを保存します 。
	注: 画像は、イメージング システム、ゲルまたは ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) など、自由に利用できる画像分析ソフトウェアを使用して、付属のソフトウェアを使用して分析できます。定量の議論の 結果 を参照してください</li>。
</ol>

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</ol>

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ペースは、多糖類の構造を特徴付けるための簡単な方法です。それは適用することができます任意の多糖類を特徴づけられる活動の GHs と既知が、文献1,6,9,11の多数の例を参照してください。Tt は、新規 GHs12,13,18と糖転移酵素の9、特性評価に適用されている定義された多糖基質と受容体の使用することによって。
再現性、解釈の結果は、3 つの主要手順に依存しています。最初に、使用される GHs は活動を汚染から無料する必要があります。これはベストのみ発現クローンを使用して達成、アフィニ ティー精製酵素。第二に、ほとんどの実験では、基質の酵素加水分解が完了であることが重要です。これは、同じバイオマス同じ GH と加水分解では、すべての実験の同じ指紋が保証されます。最後に、誘導体化反応における蛍光体の過剰があるはずです。これにより、利用可能な還元終了は 100% 近くでラベルが。これは、結果としては定量的データの高再現性になります。
ゲルと試薬の品質、再現性のあるデータを確保するために重要です。質の悪いバッファー、特に不適切な pH のゲルで気泡があり塩の過剰でサンプルできるオリゴ糖のすべてに影響を与える解像度と保持要因。ただし、プロトコルおよび結果のセクションで説明した推奨のコントロールを含めることがトラブルシューティングを有効にします。
ペースは、オリゴ糖を識別する能力によって制限されます。いくつかの実験のため単純な指紋は必要なことです。ただし、本当に空気のサンプルのグルコマンナンの量を量的、たとえば、リリースされたすべてのオリゴ糖のアイデンティティが必要、時間のかかるプロセスであります。これは複雑な多糖類キシラン3など以下のより簡単です。市販オリゴ糖に少数の標準がある、のでそれが常にできないやすべてのバンドを識別することが望ましい。この場合、ペースは、質量分析法 (すなわち、 MALDI CID9または ESI MS7、及び NMR6) に非常に無料のデータを提供できます。これらのメソッドでは、大規模な準備を行う、サイズ排除クロマトグラフィーによって分離し、MS や NMR の前に両方のペースで各分画を分析する便利です。バンドの摘出や MALDI CID によって識別されることができることが報告されている、しながら実際に我々 を発見した (おそらく原因で紫外線にさらされたとき、アクリルアミドゲル標識オリゴ糖の相互作用) の成功率が低い、これがあります。
ペースの他の主要な制限は、スループットです。良質を適切なコントロールと解釈ゲル ゲルのみ 〜 10 実験サンプルを持つし、一日 〜 4 ペースのゲルを実行する研究者が期待できます。最近では、キャピラリー電気泳動 (CE) を使用してペースのバージョンは、開発19、96 ウェル プレートで試料の調製を可能にするをされています。それが実証されて酵素酵素活性と多糖類の構造6,19を特徴付けるため購入・維持する高価なことができる CE マシンへのアクセスが必要ですが。

ゲル電気泳動 (ペース) による多糖類の分析は、多糖類1,2,3の詳細な特性評価のための方法です。植物細胞壁多糖は、分析が困難であり、高価な機器、熟練オペレーターと大量浄化された材料のほとんどのメソッドが必要があります。ここで、簡単な説明を得るためのメソッドの詳細な多糖類の構造については、構造異性体の解像度を含みます。
理解植物細胞壁多糖の構造は、植物の細胞壁の生合成や植物発生における植物細胞壁の役割を調べる研究者に必要です。しかし、植物細胞壁組成近年注目されているバイオ燃料と生化学4を生産する原料として植物バイオマス (本質的に細胞壁) を使用してに焦点を当てるのための研究者のより広いグループに興味深い。例として、この材料の効率的な糖化が必要です多糖構造の詳細な理解できるように最適化された酵素カクテル選択した5。
ペースには、複雑な糖鎖構造の迅速な解析に最適にする代替の方法をいくつかの利点があります。まず、問題の解決策の状態の核磁気共鳴 (NMR)6必要な多糖類の精製は必要ありません。第二に、ペースは、質量分析法とは異なり、構造異性体を解決できます (MS、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI) とエレクトロ スプレー イオン化 (ESI))、これも液体クロマトグラフィー (LC)による実行が難しくなります7. 第三に、ペースは非常に敏感で、薄層クロマトグラフィー (TLC) やペーパークロマトグラフィーとは異なり、低ピコモル レベルの解像度を持つ。最後に、LC、NMR、MS という場合に、高価な機器や専門知識を必要ありません。
ペース ・ メソッドは、多糖類の混合物中の特定のグルコースポリマーを対象とする糖加水分解酵素 (GH) 酵素の特異性に依存します。GH 酵素多糖鎖の機能を果たす、ことができますする化学的誘導体、この場合蛍光ラベルとする還元末端が明らかに。サンプルの unhydrolyzed の部分は、したがってこのメソッドによって検出不可能なレンダリングされます。ラベル付きのオリゴ糖は、電気泳動による大判アクリルアミドゲル中で区切られます。これは非常によく似た分子の優れた解像度を与える、たとえば、Glc の男と Glc-男-Glc 三糖類は、異なる Rfが。
ペースは、シロイヌナズナ6,9,10,11 の新規糖転移酵素を識別する植物種の8日間で異なるキシランの構造を特徴付けるため広く使用されています酵素試金9を実行する、および新規 GH 活動12,13を特徴付けます。我々 はまた、最近酵母細胞壁マンナン (Mahboubi と準備でモーティマー) を特徴付けるためそれを使いました。ここで以前レポート11,14に基づいて、植物細胞壁グルコマンナン構造の特性評価法について述べる。

<table><tbody><tr><td>オリゴサッカハライド規格</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マンノース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>CAS 3458-28-4</td><td></td></tr>マン<tr><td>ノビオース</td><td>メガザイム</td><td>CAS:14417-51-7</td><td></td></tr>マン<tr><td>ノトリオー</td>ス<td>メガザイム</td><td>CAS:28173-52-6</td><td></td></tr>マン<tr><td>ノテトラオース</td><td>メガザイム</td><td>CAS:51327-76-5</td><td></td></tr><tr><td>マンノペンタオース</td><td>メガザイム</td><td>CAS : 70281-35-5</td><td></td></tr><tr><td>マンヘキサオース</td><td>メガザイム</td><td>CAS : 70281-36-6</td><td></td></tr><tr><td>グルコマンナン (こんにゃく;低粘度)</td><td>メガザイム</td><td>P-GLCML</td><td></td></tr><tr><td>名称</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>その他の特殊化学品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-アミノナフタレン-1,3,6-トリスルホン酸</td><td>(分子プローブ) Thermo</td><td>A350</td><td></td></tr><tr><td>2-ピコリンボラン</td><td>TCI</td><td>B3018</td><td></td></tr><tr><td>40 % アクリルアミド/ビスアクリルアミド (29:1 アクリルアミド:ビス)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社情報</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong</td></tr><tr><td><>strong>Specialty Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲルキャスティングキット</td><td>Hoefer</td><td>SE660キット</td><td>18x24 cmガラスプレート、0.75 mmスペーサー</td></tr><tr><td>冷却再循環水浴&nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>RCB20-plus 115v</td> 温度を <td>~10 C に維持できる必要があります</td></tr><tr><td>G:Box Chemi XRQ イメージング システム</td><td>Syngene</td><td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td><td>蛍光色素に適したフィルターとトランスイルミネーターの注文には、長波 UV 電球を取り付ける必要があります</td></tr><tr><td>高電圧パワーパック</td><td>サーモ</td><td>EC1000XL</td><td>1000V&nbsp;</td></tr><tr><td>真空遠心分離機(Speedvac)</td><td>Savant</td><td>SPD131</td><td></td></tr><tr><td>垂直ゲル電気泳動システム</td><td>Hoefer</td><td>SE660</td><td></td></tr><tr><td>Glycosyl hydrolases</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>これらは、Megazyme(https://www.megazyme.com/)やProzomix(http://www.prozomix.com/)などの企業から入手するか、関連する研究からプラスミドを要求することにより社内で発現することができます群。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Labサプライ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15ml遠心チューブ(ファルコン遠心チューブ、ポリプロピレン、滅菌、コーニング)</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>50 ml遠心分離管(ファルコン遠心分離管、ポリプロピレン、滅菌、コーニング)</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelイメージングソフトウェア（ジェネシス)</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マンナン ペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

植物細胞壁多糖は、分析が困難であり、高価な機器、熟練オペレーターと大量浄化された材料のほとんどのメソッドが必要があります。ここで、簡単な説明を得るためのメソッドの詳細な多糖類の構造については、構造異性体の解像度を含みます。ゲル電気泳動 (ペース) による多糖類の分析の糖加水分解酵素 (例えばマンナンのマンナナーゼ) の関心の多糖類に固有の植物の細胞壁の材料を加水分解します。大判ポリアクリルアミドのゲルは、蛍光標識されているリリースされたオリゴ糖を分離する使用されます。イメージング システム変更されたゲルのゲルを視覚化できる (材料の表を参照してください)。結果として得られるオリゴ糖指紋か比較できます質的または、レプリケーションでは、定量的。リンケージや分岐情報を追加糖加水分解酵素 (例えば、 mannosidases およびガラクトシダーゼ) を使用して確立できます。このプロトコルでは、グルコマンナン構造解析法について説明します、間、特徴付けられる糖加水分解酵素が存在する任意の多糖類に適用できます。また、定義された多糖類基板を用いた新規糖加水分解酵素の特性評価に使用することができます。

ここでは、データの解釈およびトラブルシューティングを支援するための説明と共に、プロトコルごとを実行例ペース ゲルを紹介し、ゲル解釈13,16ペース成功への一般的なガイドが続きます。代表的なゲル標準ペースの細胞壁マンナン コンテンツの試金は図 2に示すし、は記述されている車線に車線。
基準 レーン 1、2 と 3 は、商業的に購入したオリゴ糖 (男1-6) 5 (S1)、10 (S2)、50 (S3) pmol 濃度でのはしごを表示します。市販のオリゴ糖の新しいロットを受信するとき、ゲルの純度を確認する重要です。多くのオリゴ糖、特に tetrasacccharides 男6のとおり、長く他 (DPs)、重合度のオリゴ糖との重大な汚染を持つことができます (付いている *)。ゲルを量的に表わす、標準曲線を計算するために必要なのだから、基準の少なくとも 3 の濃度を持っていることが重要です。標準曲線の計算は、完了時誘導体化反応が本質的にあることを確認のために有用することができます。既知濃度の標準ゲル間の比較を許可と分離品質と品質の誘導体化の便利なコントロールです。
肯定的な制御 レーン 4 こんにゃくグルコマンナンの mannanase 消化を示しています。こんにゃくグルコマンナンが、商業利用と間と同じ構造を持っていないことなど、シロイヌナズナは、それ 2 つの目的します。まず、酵素の消化力のための重要なコントロールです。研究者は、選択の彼らの GHs と消化される商業基板のとき消化完了 (すなわちGH の広大な過剰反応に追加) するように見えるものを確立しなければなりません。将来的に実験、パターンを変更する場合いずれかの活動の損失や GH 株式の汚染を可能性します。第二に、それは酵素とバッファーの塩の存在下で誘導体化反応のコントロールとして機能します。基準はよく見る肯定的な制御が悪い場合は、加水分解反応のコンポーネントが、誘導体化に抑制的であるこれを示している可能性があります。
野生型 (WT) シロイヌナズナ幹空気 + mannanase カクテル (GH5 + GH26) レーン 5 WT シロイヌナズナ幹 (参照11,14との比較) のペース指紋を示しています。
csla9シロイヌナズナの茎の航空券 + mannanase カクテル (GH5 + GH26) ショー、シロイヌナズナ由来のペースの指紋は、欠けている主要な植物茎マンナン シンターゼ11レーン 6 を示しています。WT 及び陰性対照と比較して指紋。マンナンの大半が欠席しながらこれを追加マンナン合成酵素 (CSLA2, 3) による総合すべて mannanase 由来オリゴ糖の減らされたバンド強度によって証明されるよう、少量のまま当工場では11。
否定的な制御 - 酵素のみ レーン 8 はゲルのバンドを示しています特定のカクテル、mannanase 中の汚染物質から派生し、解析から除外する必要があります (付いている *)。
否定的な制御 - WT 空気のみ レーン 9 固有ではない、分析から除外するゲルのバンドを示しています (付いている *)。
否定的な制御-csla9空気のみ 車線 10 固有ではない、分析から除外するゲルのバンドを示しています (付いている *)。
松の木の空気 + mannanase カクテル (GH5 + GH26) 車線 7 galactoglucomannan を含む松の木材のペース指紋を示しています。これは明らかに構造が異なるため、シロイヌナズナにリリースされたオリゴ糖の別のパターンがあります。
否定的な制御 - 松空気のみ レーン 11 固有ではない、分析から除外するゲルのバンドを示しています (付いている *)。
ペース ゲルの解釈は比較的簡単ですが、以下の点の意識が必要です。堅牢なデータ、遂行する少なくとも 3 独立して成長して生物学的にペースをレプリケートして、各生物の複製で少なくとも 2 技術的なレプリケートを実行するお勧めをお勧めします。説明されているコントロールは、無指定バンドは除外する必要があると解釈のため重要です。また、transilluminator による不均一な照明に起因する効果を除外する複製のゲルの別の順序のサンプルの読み込みをお勧めします。正確な解釈には、飽和していないバンドの分析が必要です。いくつかのオリゴ糖の指紋が両方非常に高、低の豊富な多糖類を含む可能性がありますので、同じゲルの複数のエクスポー ジャーの分析をお勧めします。基準を使用して、異なる画像間を正規化できます。
実験の種類によっては、空気の準備における多糖の量を定量化することが望ましい場合があります。ながらペースのゲルから定量化することは、GHs が発表した各オリゴ糖の分子の正確な id の知識が必要ですし、ペースのゲルのどこにあります。これ現在ない完全に知られているマンナンが他多糖類などキシランの3と判断されました。基準は、定量が実行されていない場合でも、任意の定性・半定量分析に役立ちますので、ジェルとの間の正規化の方法を提供を行います。
個々 のオリゴ糖の構造の識別はカクテルを使用して達成することができます GHs シーケンシャルの GHs さらに添加できる連携およびリリースされたオリゴ糖 (例えば、添加 β - 1, 4 - の置換の詳細についてを明らかにします。。グルコシダーゼ非還元末端に作用を明らかにするどのオリゴ糖混合物中にその機能が含まれている)。利用可能な酵素は、ガラクトシダーゼ、glucuronidases、グルコシダーゼ (詳細については CAZy データベース16参照)。ホッグ、D.らを参照してください。例として17 。
不明な GHs の活動の特性を上記のプロトコルを使用できます。この場合、不明な GHs13を画面に定義されたバイオマスは、シロイヌナズナの茎やこんにゃくのグルコマンナンなど使わなければなりません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
図 1: これはアリとオリゴ糖の蛍光誘導体化法を示しています。Goubet2から変更します。<a href="//ecsource.jov%20href="></a>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"ターゲット ="_blank"&gt; この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
図 2:シロイヌナズナ、松、シロイヌナズナ変異体からマンナン指紋を示す代表的なペースのゲル (csla9) マンナン生合成障害者いる。AlR はカクテル、mannanase、加水分解し、リリースされたオリゴ糖が、蛍光の誘導体します。オリゴ糖は、サイズ、形状、および電荷に基づいてゲルの電気泳動によって分離しました。満濃糖 (Man1-6) の梯子はリリースされたオリゴ糖の相対移動度を識別するを支援するためその精製マンナン (こんにゃく由来) の加水分解はポジティブ コントロールとして表示されます。* = 無指定バンド。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ゲル電気泳動 (ペース)、たとえば、マンナンを使用して多糖類の構造解析のプロトコルを説明します。

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

この実験の全体的な目標は、植物細胞壁の多糖類を特徴づけることです。この方法は、グルコマンナンの構造や量など、植物細胞壁生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、専門的なトレーニングや高価な機器を必要としないことです。一般に、この方法に不慣れな人はゲルの解釈に苦労するため、記載されているすべてのコントロールを含めて理解することが重要です。アルコールおよび可溶性残留物、またはAIRは、テキストプロトコルに記載されているように、収穫された植物材料から予め調製されます。15ミリリットルの遠心分離管に6ミリグラムの空気を量り、水を加えて最終濃度を1ミリリットルあたり2ミリグラムにします。渦巻きで均一なサスペンションを実現。500マイクログラムをマイクロチューブに分注します。アリコートを真空遠心分離機を使用して摂氏30度で一晩乾燥させます。非酵素AIRコントロール用のアリコートを含むAIRを、1モルの水酸化ナトリウムで室温で1時間前処理します。1時間後、200マイクロリットルの水と20マイクロリットルの1モル塩酸を各チューブに追加して、水酸化ナトリウムを中和します。pHが約6〜7であることをテストするには、1マイクロリットルを取り出し、紙のpHインジケーターストリップにスポットします。pH 6.0の1モル酢酸アンモニウム緩衝液を50マイクロリットル加え、各チューブに合計500マイクロリットルの水を加えます。この手順を開始するには、AIRアリコートとバッファーに所定の量のマンナナーゼを追加します。適切なネガティブコントロールとポジティブコントロールを含めます。ボルテックスしてから短時間回転し、反応混合物をチューブの底に集めます。摂氏37度で、穏やかに攪拌しながら一晩インキュベートします。翌日、摂氏95度で20分間インキュベートして反応を停止します。最高速度で10分間遠心分離します。上清を保存し、各ペレットを250マイクロリットルの水に再懸濁します。再度遠心分離し、上清を保持します。両方の上清を混ぜ合わせ、摂氏30度の真空遠心分離機で約3時間乾燥させます。誘導体化手順の前に、テキストプロトコルに記載されているように必要な試薬を調製してください。0.2モルのANTSの原液を60°Cに温め、固形物を完全に溶解させます。各サンプルに、5マイクロリットルのANTSと5マイクロリットルの2-ピコリン-ボラン、および10マイクロリットルの誘導体化バッファーを追加します。短時間回転させてチューブの底に集まり、十分に渦巻いてから、再び短時間回転します。サンプルを37°Cで一晩インキュベートし、光から保護します。翌日、サンプルを30°Cの真空遠心分離機で約2時間乾燥させます。各サンプルをオリゴ糖標準試料と100マイクロリットルの3モル尿素に再懸濁します。マイナス20°Cで保管し、必要になるまで光から保護してください。ゲルキャスティング装置の組み立ては、ブランドによって異なります。このデモンストレーションで使用した機器の場合、1 つのゲルは 50 ミリリットルに相当します。50ミリリットルの遠心分離管に、20.2ミリリットルの水、5ミリリットルの10x PACEバッファー、24.6ミリリットルの40%アクリルアミド/ビスアクリルアミド、200マイクロリットルのAPS、20マイクロリットルのTEMEDを混合します。気泡が入らないように注意しながら、穏やかに反転させて混ぜます。血清学的または他の大容量ピペットを使用して、ガラスプレートの上部から約4cm下に分離ゲルを注ぎます。ゲルをイソプロピルアルコールで慎重に重ねます。ゲルを20〜30分間重合させます。最上層を注ぎます。余分な液体を吸い取り紙で乾かします。次に、スタッキングジェルを作ります。15ミリリットルの遠心分離管に、6.8ミリリットルの水、1ミリリットルの10x PACEバッファー、2.8ミリリットルのアクリルアミド/ビスアクリルアミド、80マイクロリットルのAPS、8マイクロリットルのTEMEDを混合します。反転させて混合し、重合した分離ゲルの上に重ねます。コームの歯の下に気泡が閉じ込められないように、コームをそっと挿入します。ゲルが重合したら、湿ったティッシュで包み、次にラップで包み、必要になるまで摂氏4度で保存します。ローディング順序を追跡し、コームを取り外した後にウェルがどこにあるかを特定するために、油性マーカーを使用してガラス上のウェル位置にラベルを付けます。コームを取り外します。ウェルにone-X PACEバッファーを充填します。10マイクロリットルのマイクロシリンジを使用して、2マイクロリットルの標準試料とサンプルをウェルにロードします。サンプルの実行が不十分になりがちで、サンプル間に空のレーンを残す傾向がある最も外側のレーンの使用は避けてください。ゲルランニング装置の上部チャンバーを組み立て、one-X PACEバッファーを含む冷却されたランニングタンクにゲルを置きます。上部チャンバーにone-X PACEバッファーを充填します。電源を入れ、ゲルを200ボルトで30分間運転します。30分後、電圧を1, 000ボルトに1時間40分増やします。ゲルを光から保護します。まず、ゲルイメージングシステムを湿った糸くずの出ないティッシュで拭き取り、ほこりが付着していないことを確認します。PACEタンクからゲルを取り出し、ゲルがまだガラスプレートにある間に短時間観察して、色素の前面がまだゲル上にあるかどうかを確認します。ウェッジツールを使用してゲルを開き、ゲルがまだ1つのガラスプレート上にある間に、ピザカッターを使用して、染色剤の前面がまだゲル上にある場合は、スタッキングジェルとゲルの底の両方を取り除きます。トランスイルミネーターの表面に約5ミリリットルの水を分注し、次にゲルを直接トランスイルミネーターに移します。ソフトウェアを使用して、フィルターをUV 605に設定し、長波UVトランスイルミネーターをオンにします。さまざまな露光時間で複数の画像を撮影し、蛍光の劣化を避けるために、画像と画像の間にUVライトをオフにするようにしてください。少なくとも 2 つの画像に飽和したバンドがないことを確認します。ファイルを高解像度のTIFF画像として保存します。細胞壁マンナン含有量の標準PACEアッセイの代表的なゲルが示されています。レーン 1、2、3 は、それぞれ 5、10、50 ピコモル濃度の市販のオリゴ糖のはしごを示しています。レーン4は、酵素と緩衝塩の存在下での酵素消化と誘導体化反応の両方に対して陽性制御として機能するこんにゃくグルコマンナンのマンナナーゼ消化を示しています。レーン5は、野生型のシロイヌナズナの茎のPACEフィンガープリントを示しています。レーン6は、主要なステムであるマンナンシンターゼを欠くシロイヌナズナ植物の茎のPACEフィンガープリントを示しています。野生型と比較して、マンナンは少量しか存在せず、すべてのマンナナーゼ由来オリゴ糖のバンド強度が減少していることからも明らかです。レーン10は、ガラクトグルコマンナンを含み、シロイヌナズナとは明らかに異なる放出オリゴ糖のパターンを持つマツノギのPACEフィンガープリントを示しています。レーン 7、8、9、および 11 は、分析から除外する必要があるアスタリスクでマークされた非特異的バンドを明らかにするさまざまなネガティブ コントロールです。このビデオを見た後、PACEを使用してマンナンの構造を分析する方法について非常によく理解できるはずです。この手法を習得すると、さまざまなグリコシル加水分解酵素を使用して、他の多糖類に適用できます。この技術は、シロイヌナズナだけでなく、酵母マンナンなどの他の非植物種だけでなく、他の多くの植物種にも適用することに成功しています。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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