成長および線虫の繁殖に対する薬剤の効果を測定

この手順の全体的な目標は、トポイソメラーゼ阻害剤であるエトポシドなどの化学物質がモデル動物 Caenorhabditis elegans の成長と繁殖に及ぼす影響を測定することです。この方法は、医薬品開発のための毒物学的評価や環境毒物のリスク評価など、毒物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、さまざまな化学物質の毒性を非哺乳類システムでチェックできるため、この手法は便利で費用対効果が高いことです。

その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるSo Young Leeさんです。まず、1本のボトルに0.6グラムの塩化ナトリウム、0.5グラムのペプトン、3.4グラムの寒天、195ミリリットルの蒸留水、およびマグネチックスターラーを追加して、200ミリリットルのきれいなガラス瓶を準備します。次に、もう一方の空のボトルにマグネチックスターラーを追加します。

ボトルを摂氏121度で15分間オートクレーブし、次にボトルを摂氏55度の水浴で30分間冷却します。次に、充填されたボトルに、0.2ミリリットルの1モル塩化カルシウム、0.2ミリリットルの5ミリグラム/ミリグラムのコレステロール、0.2ミリリットルの1モルの硫酸マグネシウム、および5ミリリットルの1モルのリン酸カリウムを追加します。次に、55°Cのホットプレート上で磁気攪拌して溶液を混合します。

混合したNGM培地の半分を空の200ミリリットルボトルに注ぎます。次に、1つのボトルに1ミリリットルのDMSOを加え、磁気攪拌を使用して再度混合します。もう一方のボトルは摂氏55度の水浴に保管します。

次に、DMSO含有培地から35 x 10ミリメートルのペトリ皿を3ミリリットル分注します。もう一方のボトルをウォーターバスから取り出し、磁気攪拌を使用して混合します。次に、1ミリリットルの75ミリモルエトポシドを追加します。

そして、再度混合した後、分注手順を繰り返します。薬品含有NGMプレートは室温で約3時間冷却し、使用まで4°Cで保存してください。化学試験では、各NGMプレートに100マイクロリットルの熱不活化大腸菌OP50を広げます。

プレートをC.elegansインキュベーターで摂氏20度で一晩乾燥させます。年齢同期したC.elegansの卵子を、1%DMSOまたは750マイクロモルのエトポシドを添加したNGMプレートに移します。C.elegansを摂氏20度のインキュベーターに4日間置きます。

C.elegansの顕微鏡画像を毎日実体顕微鏡で観察し、撮影しています。また、ワームサイズのキャリブレーションのために、顕微鏡ステージマイクロメーターの顕微鏡画像を撮影します。DMSOまたはエトポシドで処理したC.elegansの体長を各時点で測定するには、ImageJで顕微鏡ステージマイクロメータ画像を開きます。

次に、直線ツールを使用して、画像上に1, 000マイクロメートルの線をドラッグします。[分析] をクリックし、[スケールの設定] をクリックし、1, 000 とマイクロメートルを [既知の距離] ボックスと [長さの単位] ボックスにそれぞれ入力します。次に、[グローバル]をオンにして[OK]をクリックします。[ファイル] を使用してワーム イメージを開き、[開く] をクリックします。

次に、フリーハンド ライン ツールを使用して、各ワームの特徴に沿って線を引きます。体長データを取得するには、[解析] をクリックし、[測定] をクリックします。50 個のワームに対してこれらの手順を繰り返します。

DMSOまたはエトポシドを含むNGMプレート上で、年齢同期卵を20°Cで若年成人期まで64時間インキュベートします。5匹の成虫を化学薬品を含まない新しいNGMプレート、または同じ化学前処理を含む新しいNGMプレートに移し、24時間インキュベートします。先ほど示したように、成虫を新しいNGMプレートに移し、毎日卵の数を数えます。

さらに、這いずり落ちた、死んだ、または内部で孵化したワームを数えます。テキストプロトコルに従って計算を実行します。ここに示すように、24〜96時間でのエトポシドの処理は、C.elegansの増殖を有意に遅らせました。

96時間のインキュベーション後、エトポシド処理された線虫は体長0.86ミリメートルに成長し、ビヒクル処理された線虫は1.04ミリメートルに成長しました。成長遅延は、エトポシド処理された線虫のこれらの画像に見られるように、対照処理された線虫と比較して、実体顕微鏡観察下でも観察されました。72時間のインキュベーション後、ビヒクル処理されたワームからの卵が観察されました。

対照的に、エトポシド処理の96時間後に卵子が観察され、エトポシド処理がC.Elegansの最初の出産を遅らせた可能性が提起されました。これらのグラフに示されているように、エトポシド処理による総卵数の減少は、連続的なエトポシド処理の存在下または非存在下で、若年成虫を培養したときに観察されました。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1週間で習得できます。

このビデオを見れば、モデル線虫であるC.elegansの化学的毒性を評価する方法についてよく理解できるはずです。