4.5: Transwell 移行アッセイ

トランズウェル遊走アッセイは、科学者が細胞の動きを定量化できる古典的な手法です。移行とは、セルが個別に、またはクラスター内を移動する能力を指します。細胞の動きは、細胞骨格の正確な再構築によって可能になり、移動は通常、手がかりとして機能する刺激に応答して発生します。

本日は、シンプルなチャンバーセットアップを利用して、引き寄せ手がかりに応答した移動を評価するトランズウェルマイグレーションアッセイについて説明します。

まず、トランズウェルチャンバーに関する背景情報を提供します。

この装置は、1961年にスティーブン・ボイデン博士によって最初に設計され、白血球の移動を研究するために使用されました。したがって、この方法はボイデンチャンバーアッセイとしても知られています。

シンプルなボイデンチャンバーでは、外壁は96ウェルプレートのものと同様に、ウェルのものです。各ウェルの内部には、円筒形のインサートであるトランズウェルが配置されています。インサートには、定義された細孔サイズのポリカーボネート膜があります。ウェルに入れると、チャンバーを2つのコンパートメントに分割します。上部のコンパートメントは、移動行動を研究する細胞が播種される場所であり、下部のリザーバーは、化学誘引剤の溶液が置かれる場所です。定義上、走化性物質とは、「細胞を引き付ける」ことによって細胞の運動性を促進する能力を持つ分子です。

これらの引力により、上部コンパートメントの細胞は細孔を通って下部のリザーバーに移動します。一部の黒色腫細胞のように、細胞が接着特性を持っている場合、移動後、細胞は膜の下側に「くっつき」ます。この場合、メンブレンを固定し、染色し、顕微鏡下で細胞をカウントすることができます。一方、精子のような非接着性細胞は、底のリザーバーに移動します。この場合、リザーバー溶液中の細胞は、血球計算盤の助けを借りてカウントすることができる。

このアッセイのセットアップは簡単ですが、実験の前に考慮すべき点がいくつかあります。それらのいくつかを確認しましょう。

シーディングソリューションから始めて、細胞の移動を観察するために密度が最適化されていることを確認する必要があります。細胞が少なすぎると、検出できない移動が発生する可能性があり、密度が高いとメンブレンが過剰に増殖し、移動を列挙するのが困難になります。2番目の考慮事項は、インサートの細孔サイズです。細胞の種類に応じて慎重に選択する必要があります。細孔径が小さすぎると、細胞が通過できなくなります。

あるいは、細孔サイズが大きすぎると、細胞はただ抜け落ちるだけで、これは移動ではありません。最後に、走化性物質の濃度と移動に許容されるインキュベーション時間には、相互依存性があるため、注意する必要があります。コンパートメント間で濃度勾配が維持される適切なインキュベーション時間で最適な濃度を確保すると、ケモドラッグによる細胞移動が誘導されます。逆に、長時間のインキュベーションでは、チャンバー全体での化学誘引剤の平衡化が伴い、化学勾配が失われる可能性があり、得られた結果の分析が混乱する可能性があります。

これらの考慮事項を念頭に置いて、接着細胞の遊走を測定するために使用されるプロトコルについて説明しましょう。

アッセイする細胞は、プロテアーゼが重要な膜受容体を変性させ、最終的に遊走に影響を与える可能性があるため、プロテアーゼフリーの培地で調製されます。細胞を調製した後、懸濁液を最適な播種密度に希釈する必要があります。チャンバーを調製するために、トランズウェルをマルチウェルプレート上のウェルに配置します。細胞懸濁液は、メンブレンに触れたり気泡を導入したりすることなく、トランズウェルにピペットで入れる必要があります。

化学誘引剤溶液は、溶液がインサートのメンブレンに接触することを確認しながら、下部リザーバーにピペットで移されます。移行のインキュベーション時間は、実験的な考慮事項によって異なります。インキュベーション後、インサートを70%エタノールに浸すことにより、メンブレンは固定されます。インサートを乾燥させた後、細胞染色液を添加します。

次に、細胞を室温で約30分間インキュベートします。インキュベーション後、インサートを洗浄緩衝液の助けを借りて洗浄する。最後に、メンブレンを切除し、顕微鏡スライド上に置くことができます。メンブレンの下側にある細胞は、化学誘引物質の存在下と非存在下で移動した細胞の数を表しています。

プロトコルの感触がつかめたところで、研究者がこの方法を探索にどのように使用しているかを簡単に見てみましょう。

このアッセイの最も一般的な用途の1つは、未知の化合物の化学誘引性特性を評価することです。ここで、科学者たちは、両生類の卵から分泌される物質であるアルリンの存在下でカエルの精子の遊泳経路を調べることに興味を持っていました。これを行うために、彼らは最初に活動的なカエルの精子をトランズウェルインサートの上部にピペットで移しました。底にアルリンを加えました。細胞を移動させた後、顕微鏡下でリザーバー溶液中の精子をカウントしました。この手法を用いて、彼らは精子の移動に対するアルリン濃度の影響を示す濃度-反応曲線を生成することができた。

細胞が病原体に攻撃されると、細胞は化学誘引物質を送り出して免疫細胞を動員し、免疫細胞が移動し、付着し、その後感染を解消します。この現象を検証するために、これらの科学者たちはインサートの下側で上皮細胞を培養しました。その後、彼らはこれらの細胞にさまざまな細菌株を感染させました。最後に、免疫細胞を上部チャンバーに導入しました。感染した細胞は、免疫細胞の遊走を誘導するいくつかの化学誘引物質を産生することが知られています。この実験の結果は、さまざまな種類の細菌感染に応答して、好中球の移動の程度が異なることを示しました。

最後に、がん細胞の細胞浸潤と細胞外マトリックスを介した転移は、常に細胞生物学者の興味をそそられてきました。ここで、科学者たちは、特定の化学誘引物質が3Dマトリックスを介してそのような移動にどのように貢献できるかを特定したいと考えていました。彼らは、緑色の蛍光を発現するタンパク質と赤色の蛍光タンパク質を発現する2つの別々の細胞プールを遺伝子操作しました。次に、細胞外マトリックス模倣物をトランズウェルの上部にピペットで移動させました。

固まったら、トランズウェルを反転させ、2つの細胞プールをメンブレンの下側に播種しました。次に、インサートをマルチウェルプレートに交換し、化学誘引性溶液を上部チャンバーにピペットで移しました。これにより、下部のセルが 3D マトリックスを上に移動しました。共焦点イメージングの助けを借りて、これらの研究者は細胞遊走を3Dで再構築し、細胞の2つのグループの遊走パターンを区別しました。

JoVEのトランズウェルマイグレーションアッセイに関するビデオをご覧になりました。この方法の構成要素とプロトコルを理解することで、なぜこの方法が細胞生物学者によって広く使用されているのかがおわかりいただけたと思います。このセットアップは簡単ですが、この方法が適応できるさまざまな構成により、細胞の運動性研究に不可欠です。いつものように、ご覧いただきありがとうございます!